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糖原合成酶激酶3β抑制剂CHIR99021诱导人胚胎干细胞分化为限定性内胚层细胞
目的：探讨糖原合成酶激酶(GSK)3β抑制剂CHIR99021诱导人胚胎干细胞分化为限定性内胚层细胞的可行性。方法将人胚胎干细胞H1细胞置于无滋养层培养基（Essential 8）培养。采用免疫荧光法检测人胚胎干细胞多能性标志物Oct4、Nanog的表达。于细胞中加入0.33、1.00、3.00、9.00、27.00μmol/L浓度的CHIR99021培养3 d，以不加CHIR99021的细胞作对照。采用荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测细胞多能性相关基因OCT4、SOX2和限定性内胚层相关基因GATA4、SOX17的表达水平。实验数据比较采用单因素方差分析和LSD-t检验。结果免疫荧光法能够检测到人胚胎干细胞多能性标志物Oct4、Nanog的表达。经0.33、1.00、3.00μmol/L CHIR99021处理后的人胚胎干细胞生长状态良好，CHIR99021浓度较高时细胞生长状态较差或死亡。经1.00、3.00μmol/L CHIR99021处理后的细胞多能性相关基因OCT4表达均下调(LSD-t=-40.54，-59.12；P<0.05），SOX2表达亦明显下调(LSD-t=-20.46，-3.87；P<0.05）。经1.00、3.00μmol/L CHIR99021处理后的细胞限定性内胚层相关基因GATA4表达上调(LSD-t=137.21，65.29；P<0.05），SOX17表达亦明显上调(LSD-t=50.93，6.56；P<0.05）。结论人胚胎干细胞应用无滋养层培养仍然保持良好的干细胞生物学特性。CHIR99021可以高效诱导人胚胎干细胞向限定性内胚层细胞分化。
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Chir99021联合PD0325901对小鼠胚胎干细胞中miRNAs差异表达的影响
目的：通过研究Chir99021联合PD0325901对小鼠胚胎干细胞中miRNAs差异表达的影响，为揭示胚胎干细胞的自我更新和分化的机制提供更多线索。方法采用miRNA基因芯片技术检测Chir99021联合PD0325901处理组和PD0325901处理组miRNAs的表达谱差异。选取3倍以上及通过查文献与胚胎干细胞自我更新相关的1.5倍以上3倍以下的miRNAs，采用实时荧光定量PCR法验证，利用miRDB、Miranda两个数据库交叉预测差异表达的靶基因，并应用KEGG Pathway进行靶基因功能富集分析。结果与PD0325901单独处理相比，Chir99021联合PD0325901处理组有47种miRNAs上调1.5倍以上，75种miRNAs下调1.5倍以上；用实时荧光定量PCR验证差异表达的miRNAs，结果显示13个miRNAs与芯片结果相符。靶基因预测分析显示，miR-466a-5p、miR-466d-5p处于重要位置，Plcb1、Prkcb处于关键基因位置。结论 Chir99021可引起小鼠胚胎干细胞中的miRNAs差异表达，差异表达的miRNAs可能通过调控Plcb1、Prkcb基因而影响胚胎干细胞的自我更新。
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CHIR99021和Wnt3a在小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化中的作用
目的 观察Wnt/β-catenin信号通路激活剂CHIR99021和Wnt3a在小鼠胚胎干细胞(mESCs)向心肌细胞分化中的作用.方法 采用悬浮一步培养法形成拟胚体(EBs),在EBs形成后第2天至第5天分别加入CHIR99021、Wnt3a,命名为CHIR99021组及Wnt3a组,将自动分化的EBs作为对照组.用免疫荧光法检测心肌特异性蛋白肌球蛋白重链(α-MHC)、肌钙蛋白T(cTNT)及膜联蛋白43(CX43)的表达.用qRT-PCR检测中胚层标志基因Brachyury、心肌前体细胞标志基因Nkx2.5、心肌细胞特异性标志基因α-MHC、cTnT和Cx43 mRNA的表达.用Western blot法检测 α-MHC、cTNT和CX43蛋白表达.结果 免疫荧光法提示各组mESCs能够向心肌细胞分化.在CHIR99021和Wnt3a诱导分化过程中,Brachyury在分化第7天达高峰;Nkx2.5、α-MHC、cTnT和Cx43的mRNA表达量随着分化时间的延长而逐渐增加,第15天增加为明显,且CHIR99021组和Wnt3a组高于对照组;CHIR99021组优于Wnt3a组(P<0.05,P<0.01).Western blot检测结果显示CHIR99021组和Wnt3a组α-MHC、cTNT和CX43蛋白表达量明显高于对照组,CHIR99021组高于Wnt3a组.结论 CHIR99021和Wnt3a在分化早期阶段通过活化Wnt/β-catenin信号通路可促进mESCs心肌细胞分化,且CHIR99021促心肌分化作用优于Wnt3a.
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CHIR99021对小鼠胚胎干细胞心肌细胞分化的双重作用
目的：研究CHIR99021在小鼠胚胎干细胞( mESCs)分化为心肌细胞的作用。方法运用经典的悬滴培养法促进 mESCs 形成拟胚体( EBs)。在不同分化时间段加入糖原合成激酶-3β(GSK-3β)抑制剂CHIR99021,诱导mESCs向心肌细胞分化,相差显微镜在不同时间点观察不同组EBs搏动百分率。 RT-PCR法检测心肌特异性转录因子Nkx2．5、α-肌球蛋白重链(α-MHC)基因表达水平的变化。 Western blot法和免疫荧光染色法检测心肌特异性蛋白cTnT的表达。实验时将不加入CHIR99021命名为对照组,分化第2~5天和第6~10天加入CHIR99021分别命名为2~5 d组和6~10 d组。结果通过悬滴培养法能够形成 EBs,且形成的EBs能够出现自发性搏动并有cTnT表达。在诱导分化的过程中,第2~5天加入CHIR99021的2~5 d组的搏动 EBs百分率比对照组更高,Nkx2．5、α-MHC基因表达的水平也比对照组高；6~10 d组的结果跟2~5 d组相反。各组中都可通过Western blot和免疫荧光染色法检测到cTnT的表达,但2~5 d组的cTnT的表达量高于对照组,6~10 d组的cTnT的表达量低于对照组。结论 GSK-3β抑制剂 CHIR99021对mESCs心肌细胞分化具有双重作用,即分化前期(2~5 d)促进分化,可获得更高的分化率,分化后期(6~10 d)结果相反。
