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一氧化氮诱导日本血吸虫成虫原代培养细胞凋亡的研究
目的探讨NO诱导的日本血吸虫细胞凋亡的细胞毒作用. 方法用不同剂量NO供体-硝普钠(SNP)处理日本血吸虫成虫原代培养细胞,8 h后用Annexin-V-FITC标记原代培养细胞,荧光显微镜下观察细胞的凋亡情况.结果 SNP能明显诱导日本血吸虫原代培养细胞发生凋亡,且细胞凋亡的发生率具剂量依赖性,300 μmol/L SNP处理组细胞的凋亡发生率明显高于100 μmol/L SNP处理组. 结论 NO能诱导日本血吸虫细胞凋亡,NO对血吸虫童虫的细胞毒作用可能与此有关.
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提高逆转录病毒滴度和靶细胞感染率方法的建立与应用
逆转录病毒载体广泛用于基因靶向治疗,干细胞基因工程,以及感染其他方法难以转染的细胞系,如某些肿瘤细胞,神经细胞,原代培养细胞等.重组小鼠干细胞病毒(recombinant murine stem cell virus,rMSCV)是一种常用的逆转录病毒载体,除可携带目的基因或DNA片段外,该载体还有药物抗性基因和绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)基因.
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人胚胎干细胞向成纤维细胞分化方法的专家共识
人胚胎干细胞（ESC）是一类从囊胚期的人胚胎内细胞团中分离所得的，具有体外自我更新稳定性并维持正常核型和发育多能性，甚至参与整个个体发育的高度未分化干细胞［1］。利用人ESC或由其分化而成的人体细胞、组织或器官来测试各种生物医用材料、食品及药物对人体的毒理特性或药效，较运用动物或永生化细胞更能反映人体真实的状况。因此，人ESC及其分化的细胞有望发展成为一种崭新的生物安全性检测和药物筛选模型［2］。目前多数研究仍用永生化细胞系或原代培养细胞进行生物材料的安全性评价［3-4］，分别存在核型异常或批次差异大等缺点。人ESC来源的成纤维细胞（ ES-F ）具有来源稳定，核型正常以及容易标准化等优点［5-6］，有望成为生物安全性评价体系的新模型［7］。规范人ESC向成纤维细胞分化方法是保证生物安全性检测评价模型可靠性的关键。为此，科技部国际科技合作重点项目“创建基于人胚干细胞的预测健康安全新体系”的项目组专家经反复讨论，制定了“人胚胎干细胞向成纤维细胞分化方法的专家共识”（以下简称“共识”），旨在规范人ES-F的分化方法，提高人ES-F的纯度，保证分化方法的可重复性，使其更系统、规范和有效地应用于临床和生物安全性评价体系中。
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葡多酚与硫辛酸对60Coγ致小鼠肝损伤拮抗作用
葡多酚(grape procyanidin,GPC),又称葡萄原花青素,是从葡萄籽中提取的一种天然植物多酚类物质,具有抗氧化、抗辐射、抗突变等生物学功效[1].硫辛酸(lipoic acid,LA)作为一种细胞线粒体的抗氧化剂,能有效清除内源性自由基多发的线粒体所输出的自由基,从而避免自由基对细胞结构造成的氧化损伤[2].本研究观察GPC和LA对电离辐射损伤的拈抗作用.用60Coγ线进行照射小鼠肝原代培养细胞,测定超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)催化活性和过氧化损伤产物丙二醛(MDA)含量变化.
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脊髓前角原代培养细胞 ACP 酶的观察
目的探讨脊髓前角原代培养细胞 ACP 酶的分布，确定溶酶体形态、整体分布及与其它细胞器之间的相互关系。方法采用 Gomori′s 铅法进行 ACP 酶组化反应，光、电镜观察溶酶体的整体分布和定位。结果光镜下可见 ACP 反应阳性产物为棕色颗粒，散在分布于神经元的胞体及突起内；电镜可见其阳性产物为电子密度高的黑色沉淀，分布于不同形状的溶酶体及高尔基体内，并常见线状溶酶体与一些细胞器相伴行。结论脊髓前角原代培养细胞的 ACP 酶反应可较好的代表溶酶体的整体分布。
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正常胃黏膜上皮细胞的分离和鉴定方法
原代培养的胃黏膜上皮细胞是进行胃生理功能、病变机制、药物治疗等研究的重要工具,其整体生理状态和结构特点与体内姊妹细胞相似,临床实用价值较大,是肿瘤组织衍生细胞系所不能比拟的.然而在我国,几乎所有相关研究采用的都是各类细胞系,而非原代培养细胞,很重要的一个原因就是胃黏膜上皮由多种细胞成分组成,对分离条件要求较高,原代培养不易成功.近30年来,特别是上世纪80～90年代,由于基础研究和临床的需要以及细胞培养技术的发展,国内外学者开始原代培养胃黏膜上皮细胞,其来源涉及鼠、兔、犬、猪、人多个种属.为获得高纯度、高活力的功能性细胞,研究者们试用了多种分离方法,大体可归纳为酶分离腚法和非酶分离法.本文介绍了一些较成功的正常胃黏膜上皮细胞的分离、纯化和鉴定方法,以期对相关研究有所帮助.
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p12－LOX抑制剂黄芩素抑制胃癌细胞MKN－28的增殖和迁移
目的：检测血小板型12－脂氧合酶（ platelet－type 12－lipoxygenase， p12－LOX）在野生型和胃癌模型小鼠胃组织、原代培养细胞及人胃癌细胞MKN－28中的表达，并探讨p12－LOX的选择性抑制剂黄芩素（ baicalein， BAI）对MKN－28细胞增殖和迁移的影响。方法：RT－PCR法检测小鼠胃组织、原代培养细胞及胃癌细胞中p12－LOX表达；MTT法检测BAI对MKN－28细胞增殖的影响；划痕实验检测BAI对MKN－28细胞迁移的影响。结果：小鼠胃癌组织和原代培养细胞中p12－LOX mRNA表达量明显高于野生型，MKN－28细胞中p12－LOX mRNA表达量也显著高于正常胃黏膜GES－1细胞；BAI呈时间和剂量依赖性抑制MKN－28细胞的增殖，并明显抑制胃癌MKN－28细胞的迁移修复。结论：胃癌组织和细胞中 p12－LOX mRNA均呈高表达，BAI显著抑制MKN－28细胞的增殖和迁移。
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血红素对脑神经元、星形胶质细胞、毛细血管内皮细胞的不同损伤作用
目的 研究不同剂量高铁血红素对脑内神经元、星形胶质细胞、脑毛细血管内皮细胞(BCEC)的损伤作用. 方法 (1)在原代培养大鼠脑皮质神经元、星形胶质细胞、BCEC上添加不同剂量(0、5、25、50 mmol/L)的高铁血红素孵育2h,去血红素后继续培养24或96 h,阿拉玛蓝染色检查细胞存活率,常规生化反应法检测乳酸脱氢酶(LCD)释放率,相差光学显微镜观察细胞形态.(2)在原代培养细胞上添加不同剂量血红素孵育2h,去血红素后继续培养4h,以浓甲酸裂解细胞,分光光度计下测定细胞内血红素含量.(3)在原代培养细胞上加血红素分别孵育30、60、120 min,去血红素后继续培养4h,以中性福尔马林液固定细胞,普鲁士蓝染色检查细胞内三价铁离子(Fe3+)染色情况. 结果 (1)神经元经5 mmol/L的血红素处理后24 h,存活率下降40.2％,LCD释放率增加22.2％,细胞形态出现严重损伤病变.随着时间延长和血红素剂量加大,细胞死亡率和LCD释放率均增加,细胞病变加重.(2)中、低剂量血红素(5 mmol/L、25 mmol/L)不引起星形胶质存活率、LCD释放率及细胞形态改变,高剂量血红素(50 mmol/L)在24 h后导致星形胶质细胞存活率下降52.4％,LCD释放率增加31.8％,并出现细胞病变；但96 h后损伤细胞得到修复,细胞重新形成致密单层,细胞存活率和LCD释放率均达正常水平.(3)无论低剂量或高剂量血红素均未引起BCEC存活率下降、LCD释放率升高或细胞形态学改变.(4)经不同剂量血红素处理2h后,神经元内血红素含量均明显升高,星形胶质细胞内血红素含量只有在大剂量血红素处理后才升高,BCEC内血红素含量未见升高.(5)神经元接触血红素30 min后细胞内即出现大量Fe3+染色阳性颗粒,随着接触时间延长和剂量加大,Fe3+染色阳性细胞数增多;星形胶质细胞Fe3+染色阳性细胞数明显少于神经元,BCEC几乎不出现Fe3+染色阳性细胞. 结论 (1)血红素对神经元具有严重的直接损伤作用,对星形胶质细胞有可逆的损伤作用,对BCEC无直接损伤作用.(2)血红素能快速进入神经元并在神经元内积累,但较少在星形胶质细胞脑积累,难以在BCEC内积累.
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胞二磷胆碱对原代培养的中脑多巴胺能神经元的保护作用及其机制
为了研究胞二磷胆碱(citicoline,CC)对6-羟多巴胺(6-OHDA)诱导的Parkinson病体外细胞模型中的多巴胺能神经元的保护作用及其机制,本研究采用 MTT法检测细胞活力;应用Fluo3/AM荧光染料,并通过流式细胞仪检测细胞内钙离子[Ca2+]i浓度;罗丹明123检测线粒体膜电位(△ψm);罗丹明123和PI荧光双染,在荧光显微镜下观察细胞膜通透性和细胞凋亡;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测培养上清中LDH的漏出;TH免疫组化染色鉴定多巴胺能神经元.实验分成三组:(1)对照组:即原代培养细胞;(2)6-OHDA损伤组:即原代培养细胞加6-OHDA;(3)CC保护组:原代培养细胞中分别加2、1、0.1、0.01和0.001 mmol/LCC后,再加6-OHDA.结果显示:与6-OHDA组相比,1、0.1、0.01和 0.001 mmol/LCC组细胞活力增加(P＜001);[Ca2+]i浓度下降和△ψm升高(P＜0.01);除了0.001 mmol/LCC组外,各CC组LDH漏出率明显低于6-OHDA组(P＜0.01).以上结果提示:在体外Parkinson病细胞模型中,CC可能通过保护神经元细胞膜,提高线粒体膜电位,增加细胞活力,降低[Ca2+]i浓度,减少LDH漏出等途径削弱6-OHDA的神经毒性作用,发挥其对神经元的保护作用.
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白介素8B型受体在大鼠脑垂体中的分布和表达
目的 探讨白介素8B型受体(interluekine-8 receptor B, IL-8RB)在大鼠脑垂体中的分布和表达. 方法 用免疫组化法，观察该受体在垂体中的分布. 提取组织和原代培养细胞的总RNA，用RT-PCR检测该受体mRNA的表达. 结果 IL-8RB＋细胞主要分布于垂体前叶. 测序结果证实，PCR产物为IL-8RB mRNA. 结论 首次证实在大鼠脑垂体中有IL-8B型受体的表达及其分布区.(潘伯荣)
