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基于反义RNA技术的FabI抑制剂筛选模型的构建
目的 基于反义 RNA 沉默技术构建针对细菌 FabI 的超敏全细胞筛选模型,用于筛选 FabI 抑制剂.方法 以 Escherichia coli 基因组 DNA 为模板,PCR 扩增fabI 基因的 -74 ～ 86 bp 核苷酸序列,反向插入携带 pairedtermini 结构的反义质粒 pHN678 中,得到重组质粒pHNF,再转化至 E.coli 中,得到反义工程菌 E.coli/pHNF;通过平板表型观察对反义工程菌进行筛选;考察了 IPTG浓度对筛选模型的影响,确定 96 孔板抗菌筛选模型的条件,并用三氯生作为阳性对照、氨苄西林和浅蓝菌素作为阴性对照对该模型进行评价.结果 获得了针对 fabI 的反义工程菌,确定了适 IPTG浓度为 40 μmol/L,成功构建了 FabI 特异性酶抑制剂的超敏全细胞筛选模型,并验证了其可行性.应用该筛选模型对5847 个内生真菌次级代谢产物进行活性筛选,初筛阳性率约为 9.7%,经复筛后获得 8 份阳性样品.结论 成功建立了基于反义 RNA 沉默技术的 FabI 超敏全细胞筛选模型,并利用该模型筛选到 8 份阳性样品.
关键词： RNA 反义 药物评价 临床前 烯脂酰-ACP还原酶 -
醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体的精确鉴定与药敏分析
目的 精确鉴定醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体菌株；检测菌株对氨基糖苷类抗生素和碳青霉烯类抗生素的敏感性.方法 运用自动化分析仪VITEK 2试卡法对临床分离不动杆菌进行菌种鉴定,对鉴定为醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体的菌株进一步经16S rRNA序列分析确证其准确种属.分别用自动化分析仪VITEK 2和微稀释法测定精确鉴定后的醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体菌株对阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、亚胺培南和厄他培南五种抗生素的敏感性,分析药敏实验结果.结果 共进行了232株不动杆菌的VITEK 2鉴定,其中195株鉴定为醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体.对195株醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体菌株进一步用16S rRNA序列分析确证其准确种属,结果显示173株为鲍曼不动杆菌,22株为醋酸钙不动杆菌.对173株鲍曼不动杆菌及22株醋酸钙不动杆菌分别用VITEK 2和微稀释法进行阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、亚胺培南和厄他培南五种抗生素的药敏检测.微稀释法药敏结果显示,受试鲍曼不动杆菌对三种氨基糖苷类抗生素均呈现高水平耐药,而对两种碳青霉烯类抗生素敏感度较高；受试醋酸钙不动杆菌对五种抗生素均呈现较高敏感度.与微稀释法药敏检测结果相比,VITEK 2试卡法药敏结果中受试鲍曼不动杆菌和醋酸钙不动杆菌对各抗生素的药敏检测结果均出现了不同程度的误差,鲍曼不动杆菌药敏检测结果中阿米卡星符合率低,严重错误率高达34.10％;醋酸钙不动杆菌药敏检测结果中厄他培南符合率低,重大错误率高达40.91％.结论 VITEK 2在不动杆菌种属鉴定中存在局限性,辅以16S rRNA序列分析,方可精确鉴定醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体.鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类抗生素耐药现状严重.用VITEK 2进行鲍曼不动杆菌和醋酸钙不动杆菌对氨基糖苷类和碳青霉烯类的药敏测定时存在不同程度的误差,建议辅以微稀释法.
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基因Hath1表达对结肠癌细胞的抑制作用
目的 研究 Hath1 基因对结肠癌细胞体外增殖的抑制作用.方法 用trizol试剂提取肿瘤细胞总RNA,定量逆转录PCR法检测Hath1在结肠癌细胞和正常组织细胞中的表达:MTS和流式细胞仪法分别检测Hath1在结肠犏细胞中的增殖率和凋亡百分率:构建IEC-6稳定表达Hath1siRNA细胞系,检测Hath1 siRNA 对IEC-6细胞生长的影响.结果 在正常人的小肠与结肠组织及大鼠小肠上皮细胞IEC-6中有着比较高水甲的Hath1的表达,而在4株结肠癌细胞中Hath1的表达都很低.在表达Hath1的4株结肠癌细胞SW480、HT29、LS174T、SW620中,其细胞增殖率分别被抑制了38.5%、23.4%、55%、35.6%.在LS174T细胞中Hath1不能有效地诱导肿瘤细胞发生凋亡,但是可以显著地提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性.siRNA 干扰试验进一步证明了Hath1起到肿瘤抑制基因的作用.结论 Hath1不能有效地诱导肿瘤细胞发生凋亡,但是可以显著地提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性.
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siRNA干扰跨膜转运蛋白21的表达对KO小鼠胚胎成纤维细胞γ分泌酶活性的影响
目的 探讨跨膜转运蛋白21(TMP 21)对γ分泌酶活性的影响.方法 将淀粉样前体蛋白基因缺陷型KO小鼠胚胎成纤维细胞[MEF(KO)]分为转染组(T)和对照组(C),转染组转染载有TMP 21小分子干扰RNA(siRNA)的质粒,对照组转染空质粒.每组均制备包含细胞全膜蛋白的样品(T1、C1),经CHAPSO进一步溶解后超速离心制备所得纯化全膜蛋白样品(T2、C2),用γ分泌酶组分早老蛋白1(PS-1)特异性抗体免疫沉降C2或T2后获得的γ分泌酶样品(IPT2、IPC2).蛋白质印迹法检测各类样品中γ分泌酶重要组分TMP 21、PS-1和Nicastrin(NCT)蛋白表达量;应用ELISA法检测β淀粉样肽40和β淀粉样肽42的生成总量.结果 蛋白质印迹法检测显示,TMP 21蛋白表达量在转染组样品IPT2中为5294±247 ng/ml,在对照组样品IPC2中为19110±579 ng/ml,组间差异有统计学意义(P<0.05);各类样品中PS-1与NCT蛋白表达量无明显变化;TMP21可与PS-1共沉降.ELISA法检测显示,转染组样品IPT2与饱和浓度底物C99反应生成的β淀粉样肽40和β淀粉样肽42总量为348±18 pg/ml,对照组样品IPC2为与饱和浓度底物C99反应生成的β淀粉样肽40和β淀粉样肽42总量为342±18pg/ml,组间差异有统计学意义(P<0.01).结论 TMP 21可能为γ分泌酶的组分之一.在TMP21蛋白低表达状态下γ,分泌酶活性升高,提示TMP 21为γ分泌酶的负调控因子之一.
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慢病毒靶向携带survivin-siRNA抗肺腺癌裸鼠体内研究
目的 探讨慢病毒载体介导survivin-siRNA对人肺腺癌裸鼠移植瘤的体内抑瘤活性.方法 参考siRNA的设计策略,构建表达survivin-siRNA 的慢病毒载体;于各BALB/C裸鼠右侧腋窝皮下接种人肺腺癌A549细胞悬液,构建人肺腺癌A549细胞裸鼠移植瘤模型,肿瘤组织局部注射survivin-siRNA的慢病毒载体,观察肿瘤的体积及随时间变化的生长曲线: 通过碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色检测细胞凋亡情况;流式细胞术检测肿瘤细胞周期变化.结果 慢病毒载体介导survivin-siRNA对裸鼠人肺腺癌A549的抑瘤率为46.07%:经过PI和Annexin-V染色区分凋亡早晚期的细胞为30%～35%,荧光显微镜下观察肿瘤细胞凋亡;G1期细胞比例明显增加,S期细胞比例则明显减少.结论 慢病毒载体介导的siRNA能有效抑制裸鼠移植人肺腺癌A549的survivin基因的表达,有效激发细胞凋亡.
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靶向PV株核蛋白基因的小分子干扰RNA对不同狂犬病病毒毒株复制的交叉抑制作用
目的 研究小分子干扰RNA(siRNA)对狂犬病病毒(RV)不同毒株复制的交叉抑制效果.方法 采用体外转录和RNA酶Ⅲ消化长片段双链RNA的方法制备8条以RV的PV株核蛋白(N)基因为靶基因的21nt siRNA,用以转染已经感染了不同滴度PV、CTN或CVS株RV的BSR细胞,采用直接免疫荧光法观察转染的siRNA对已感染BSR细胞的不同毒株RV复制的抑制效果,并分析这种抑制效果与靶基因序列的相关性.结果 不同21nt siRNA均对PV株的复制产生了较强的抑制作用;对CTN株和CVS株的交叉抑制作用观察结果表明,21nt siRNA与靶基因在碱基错配高达5个的情况下仍对病毒复制保持抑制效应.然而,siRNA与靶基因碱基错配的位置与抑制作用的丧失高度相关.3'端第2个碱基的错配将使抑制作用表失,随后的碱基错配对抑制作用的影响依次降低;中部碱基错配影响较小;而5'端碱基错配对抑制作用几乎没有影响.结论 siRNA对靶基因的抑制作用的丧失与其同靶基因序列碱基错配的位置相关,3'端碱基错配可降低其抑制作用的特异性,产生偏靶效应的范围和概率可能增大,这为设计独特的siRNA序列提供了新的思路.
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顺铂联合siRNA干扰CD147基因抗肝癌效果体外研究
目的探讨化疗药物联合应用 RNA干扰技术对体外肝癌细胞生长和侵袭能力的抑制作用。
方法利用小片段干扰 RNA（siRNA）干扰肝癌 SMMC7721、HepG2及 HCC7402细胞CD147基因表达，观察沉默 CD147基因增强顺铂对肝癌细胞活力、细胞死亡及侵袭能力的影响。
结果沉默 CD147基因能显著增强顺铂对肝癌细胞活力的抑制， siRNA-CD147联合顺铂处理组与顺铂处理组 SMMC7721细胞生长抑制率分别为62.90%、37.08%（P <0.01）；能显著促进肝癌细胞死亡，siRNA-CD147联合顺铂处理组与顺铂处理组 SMMC7721细胞死亡率分别为（57±3）%、（45±3）%（P <0.05）；同时也能显著增强顺铂对肝癌细胞侵袭能力的抑制作用，siRNA-CD147联合顺铂处理组与顺铂处理组 SMMC7721细胞穿膜细胞数分别为14.5±2.3、29±2.5（P <0.01）。
结论 siRNA沉默肝癌细胞CD147基因能增强肝癌细胞对顺铂的敏感性，该联合疗法为肝癌的综合治疗提供了新的思路和方法。 -
乳腺癌血管内皮生长因子-(A、C、D)mRNA的表达及其预后意义
目的 探讨乳腺癌组织中血管内皮生长因子(VEGF)-(A、C、D)mRNA表达在乳腺癌发生发展中的作用及其与预后的关系.方法 用TaqMan real-time逆转录聚合酶链反应检测61例乳腺癌和29例乳腺良性病变中VEGF-(A、C、D)mRNA的表达,分析其表达与乳腺癌临床病理参数及生存状况间的关系.结果 (1)乳腺癌中VEGF-(A、C)mRNA表达量(2.79±1.31、3.33±0.88)高于良性乳腺病变(1.59±1.35、2.76±0.55),差异有统计学意义(P=0.000,P=0.002).乳腺癌中VEGF-D mRNA表达阳性率(73.77%)高于良性乳腺组织(51.72%,P=0.038),但表达量二者间无差异,P=0.683.(2)单因素和多因素分析均显示VEGF-D与VEGF-C mRNA比值在淋巴结转移阳性组低于阴性组,且与淋巴结转移有关(P单=0.046,P多=0.062).(3)乳腺癌VEGF-(A、C)mRNA高表达患者无病生存率分别低于低表达组(P=0.030,P=0.044).结论 VEGF-(A、C、D)mRNA表达异常可能与乳腺癌发生发展有关.VEGF-D与VEGF-C mRNA表达比值改变可能与乳腺癌淋巴结转移有关,VEGF-(A、C)是乳腺癌预后重要的影响因子.
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长链非编码RNA MALAT1在骨肉瘤组织中的表达及其对骨肉瘤细胞侵袭和转移的影响
目的 观察长链非编码RNA MALAT1与骨肉瘤的相关性,探讨其在骨肉瘤细胞侵袭和转移中的作用机制.方法 应用即时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测2014年1月至2015年12月就诊于河南省新乡医学院第一附属医院和河南省平顶山市第一人民医院的20例骨肉瘤患者肿瘤组织和配对瘤旁组织中MALAT1的表达水平,应用Mann-Whitney U检验分析其与临床病理参数的关系.应用慢病毒载体、MALAT1 shRNA慢病毒载体转染骨肉瘤U-2OS细胞,分别应用qRT-PCR法检测MALAT1表达情况;四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测肿瘤细胞的增殖能力;细胞侵袭实验检测肿瘤细胞侵袭能力;免疫荧光和Western blot法检测Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达.结果 在骨肉瘤患者肿瘤组织中MALAT1的表达水平高于配对瘤旁组织(P ＜0.01);MALAT1表达水平与淋巴结状态、远处转移(肺转移)相关(P＜0.01);MTT法结果显示,沉默MALAT1可抑制骨肉瘤U-2OS细胞增殖(P＜0.05);细胞侵袭实验结果显示,抑制MALAT1表达可降低U-2OS细胞的侵袭能力,与正常对照组和慢病毒载体组相比,差异有统计学意义(P＜0.01);免疫荧光和Westem blot结果显示,沉默MALAT1可下调Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin、基质金属蛋白酶7、c-MYC等的表达.结论 MALAT1在骨肉瘤组织中高表达并与肿瘤侵袭密切相关;MALAT1促进骨肉瘤侵袭的机制可能与Wnt/β-catenin信号通路有关.
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尿激酶受体反义核糖核酸抑制肺癌细胞的侵袭转移
目的用反义核糖核酸(RNA)封闭尿激酶受体的表达,抑制人肺癌细胞株95D的侵袭转移能力,验证反义RNA技术在抗肿瘤中的作用.方法将尿激酶受体(uPAR)反义核糖核酸表达质粒转染具有高度侵袭转移能力的人肺癌细胞株95D,利用改良Bovden小室分析转染细胞的体外侵袭能力,并将转染细胞接种裸小鼠以观察其体内转移能力.结果G418筛选后,鉴定出2个表达uPAR反义RNA细胞克隆,uPAR蛋白质水平相应降低.表达uPAR反义RNA的细胞克隆的体外侵袭能力及在裸小鼠体内的肺转移能力较亲本细胞和空载体对照细胞均有显著性降低(P＜0.05).结论抑制尿激酶受体的表达,能够有效抑制肺癌的侵袭转移,反义RNA技术在抗肿瘤治疗中有良好的应用前景.
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HER2免疫组织化学1+浸润性乳腺癌的基因扩增状态和mRNA表达分析
目的 探讨HER2 免疫组织化学( IHC) 1+乳腺癌患者的基因扩增状态和原位HER2 mRNA表达情况,为精准检测HER2及相关临床策略的修订提供初步参考数据.方法 抽取北京协和医院2011至2013年间手术获取的非特殊型浸润性乳腺癌HER2 IHC 1+存档蜡块标本65例,制作组织芯片,分别采用荧光原位杂交(FISH)和RNAscope方法检测其HER2基因状态和原位mRNA表达水平.如原发灶HER2的FISH结果不确定或阴性但mRNA高表达,再以FISH复检其淋巴结转移灶的HER2基因状态.结果 在65例标本中,FISH阳性4例( 6.2%),其中2例为HER2/CEP17＞2且平均HER2基因拷贝数＞4,另2例为HER2/CEP17＜2但平均HER2基因拷贝数＞6;在此4例FISH阳性标本中,2例为mRNA高表达(RNAscope 3分),另2例为中度表达(RNAscope 2分).另外,在全部标本中,3例HER2/CEP17＞2但平均HER2基因拷贝数＜4,其中2例mRNA高表达(RNAscope 3分和4分),另1例mRNA中度表达( RNAscope 2分).未见HER2基因状态及mRNA表达与临床病理特征(肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移、脉管癌栓)之间存在明显相关性( P均＞0.05).结论 在本组HER2 IHC 1+乳腺癌中检出了部分FISH阳性的标本,其mRNA也有一定程度的表达,可判断为抗HER2治疗的潜在获益者.鉴于精准分子分型对于乳腺癌临床处理及相关诊疗策略制定具有重要意义,后续有必要进行大样本量的验证.
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反义凝血酶受体基因表达抑制大鼠动脉内膜损伤后内膜增生
目的了解凝血酶及其受体在血管损伤后动脉内膜增生中的作用,以进一步阐明经皮冠状动脉血管腔内成形术(PTCA)后再狭窄的发生机制,为寻找再狭窄的防治途径提供线索.方法采用球囊导管损伤动脉内膜的方法建立大鼠颈动脉球囊损伤模型.用纳米粒子包装凝血酶受体重组反义基因质粒pLXSN/ATR,用保留灌注的方法局部定位转染损伤后的大鼠颈动脉.结果 PCR检测发现重组基因整合,RNA斑点杂交观察到实验组大鼠颈动脉壁内有重组反义凝血酶受体基因表达,正义凝血酶受体基因的表达受到明显抑制,反义基因转染组新生内膜、中膜比例降低了40.9%.结论反义凝血酶受体重组基因转基因表达对大鼠颈动脉球囊损伤后动脉内膜的增生具有抑制作用,提示凝血酶及其受体在PTCA后再狭窄过程中有重要作用,为再狭窄的防治提供了新的线索.
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靶向血管内皮生长因子C短发夹式RNA对人乳腺癌MCF-7细胞生物学特性的影响
目的 研究重组质粒表达载体介导的短发夹式RNA(shRNA)对乳腺癌MCF-7细胞株中血管内皮生长因子C(VEGF-C)的表达及乳腺癌细胞增殖、侵袭能力的影响.方法 脂质体介导重组质粒pSIREN-VEGF-C转染乳腺癌MCF-7细胞株,嘌呤酶素筛选阳性克隆;荧光定量PCR及Western blot检测转染前后乳腺癌MCF-7细胞中VEGF-C基因的表达;MTT法及Transwell体外侵袭实验检测转染前后乳腺癌MCF-7细胞的增殖及侵袭能力.结果 转染重组质粒后乳腺癌MCF-7细胞中VEGF-C mRNA及蛋白表达均明显下调,抑制率分别为95%及100%(P<0.05);MTT法和 Transwell体外侵袭实验显示,与阴性质粒组和空白对照组比较,转染重组质粒后各时间段乳腺癌MCF-7细胞增殖均明显受抑制(P<0.05),同时穿膜的肿瘤细胞数也明显减少[(29.0±1.9)个与(59.0±2.1)个和(61.0±2.2)个相比,P<0.05].结论 表达VEGF-C shRNA的重组质粒载体pSIREN-VEGF-C在乳腺癌MCF-7细胞中能高效、特异地发挥靶基因沉默作用,并对乳腺癌细胞的增殖及侵袭能力有显著抑制作用.
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增殖细胞核抗原短发夹状RNA对人骨肉瘤细胞生长的影响
目的构建增殖细胞核抗原(PCNA)短发夹状RNA表达载体,检测其对人骨肉瘤细胞PCNA表达、细胞增殖及细胞凋亡的影响.方法体外构建PCNA shRNA 表达载体pSilence2.1-neo-PCNA,转染人骨肉瘤细胞系MG-63,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测转染前后PCNA mRNA表达,免疫组织化学(SP)法检测转染前后PCNA 蛋白的表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法及克隆形成试验检测细胞增殖活性,3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)细胞掺入试验检测细胞DNA合成,流式细胞仪检测细胞周期分布,吖啶橙染色法检测细胞凋亡情况.结果 pSilence2.1-neo -PCNA载体转染能显著抑制PCNA mRNA及蛋白的表达,转染后mRNA表达抑制率为80.51%﹑增殖指数值为空白组的25.68%.转染组48 h细胞增殖抑制率为61.78%,转染组3H-TdR掺入率明显低于空白组(P<0.01).细胞周期分析显示,siRNA转染组G0G1期细胞含量显著增加,而S期细胞含量显著减低.转染组凋亡率为16.54%. 结论 pSilence2.1-neo-PCNA可显著抑制MG-63细胞PCNA 的表达及细胞增殖活性,促进细胞凋亡.
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转化生长因子-β/Smad信号对人横纹肌肉瘤细胞RD生长和凋亡的调控
目的研究TGF-β/Smad信号对人胚胎性横纹肌肉瘤细胞系RD生长和凋亡的调控作用.方法采用小分子RNA干扰(RNAi)技术,以阳离子脂质体为载体,将生物合成的发夹状短链RNA(shRNA)转染RD细胞,封闭Smad4的表达以阻碍内源性TGF-β/Smad信号的转导;采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检验shRNA干扰Smad4表达的效果;采用免疫荧光化学,通过激光共聚焦显微镜检测Smad4封闭前后RD细胞中Smad2/3表达位置的变化;应用四甲基偶氮唑盐(MTT)和3H-thymidine摄入实验检测阻碍内源性TGF-β/Smad信号转导和以外源性TGF-β1刺激这2种条件下RD细胞的生长状况;采用流式细胞术和荧光化学染色检测上述2种条件下RD细胞的凋亡情况.结果 RNAi技术可有效封闭RD细胞中Smad4 mRNA和蛋白的表达;Smad4的封闭导致Smad2/3由胞质入核明显减少;内源性TGF-β/Smad信号转导受阻不但抑制RD细胞生长,并且诱导凋亡;外源性、较高浓度的TGF-β1可抑制RD细胞生长,但不诱导凋亡.结论 TGF-β/Smad信号在一定的浓度范围内精细调控RD细胞的生长和凋亡.
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乳腺癌发生模型MCF10各细胞系中APC基因启动子区甲基化及mRNA表达检测
目的探讨乳腺癌发生模型MCF10中抑癌基因APC启动子区甲基化状态及其对mRNA表达的影响.方法应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)及双亚硫酸钠基因测序技术检测MCF10模型的乳腺增生细胞系MCF10A、癌前细胞系MCF10AT、导管内癌细胞系MCF10DCIS.com、浸润癌细胞系MCF10CA1a、MCF10CA1d、MCF10CA1h及经典乳腺癌细胞系MCF-7和正常乳腺组织中APC基因启动子1A甲基化状态,然后用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和实时PCR技术检测上述样品的mRNA表达水平.结果在MCF10模型的增生细胞系、癌前细胞系、导管内癌细胞系、浸润癌细胞系中,APC基因启动子1A处于低甲基化状态;与正常乳腺组织相比,各细胞系APC基因mRNA表达无明显减少,MCF10AT、MCF10CA1d、MCF10CA1h、MCF10DCIS.com的mRNA表达分别减少0.27、0.96、1.78、2.70、2.03倍,MCF10A和MCF-7分别增加0.02和0.33倍).结论 MCF10模型中乳腺癌的发生发展过程与APC基因启动子区异常甲基化无关.
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RNA干扰抑制乙酰肝素酶对肺腺癌细胞A549增殖、侵袭和凋亡的影响
目的 探讨抑制乙酰肝素酶表达对人肺腺癌细胞A549增殖、侵袭和凋亡的影响.方法 构建靶向人乙酰肝素酶基因短发夹状双链RNA(shRNA)真核表达质粒(pshRNA-Hpa),用脂质体将其转入A549细胞,建立稳定转染细胞株系,经逆转录.PCR和Western blot法检测转染效率后,分别用四甲基偶氮唑蓝(MTT)、Transwell侵袭实验和流式细胞术(AnnexinV-FITC/PI双染法)检测其对A549细胞增殖、侵袭和凋亡的影响.采用Western blot法检测转染后磷酸化蛋白激酶B(PKB/Akt-Ser473)的表达.结果 转染pshRNA-Hpa的A549细胞乙酰肝素酶mRNA及蛋白表达明显低于未处理A549细胞,抑制率分别为54.09%和48.26%,细胞增殖速度减缓,侵袭能力降低,流式细胞术显示早期细胞凋亡率达(12.53±0.34)%,较空白对照组、空载体转染细胞组和阴性对照组明显增加(P＜0.01).同阴性对照质粒相比,转染pshRNA-Hpa的A549细胞Akt-Ser473的磷酸化水平降低52.15%.结论 靶向乙酰肝素酶重组shRNA质粒pshRNA-Hpa能有效抑制A549细胞乙酰肝素酶的表达,并可能通过下调磷酸化蛋白激酶B途径抑制细胞的增殖侵袭、促进细胞的凋亡.
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个体性反义RNA对乳腺癌细胞突变p53基因表达的特异性封闭作用
目的 研究针对p53基因突变的个体性反义RNA对乳腺癌突变p53基因的特异性封闭作用.方法 通过免疫细胞化学LSAB法染色、聚合酶链反应-单链构象多态性分析及测序确定人乳腺癌细胞系MDA-MB-231中p53突变位点,构建针对该突变点的反义表达载体并制备其反义RNA.原位杂交技术检测反义RNA与细胞内突变p53基因的特异性结合;在阳离子脂质体介导下将反义RNA转染细胞;以免疫细胞化学LSAB法染色及细胞生长抑制率观测反义RNA作用时效;Western blot检测p53蛋白的表达;四甲基偶氮唑盐法检测转染细胞的生长活性;流式细胞术检测转染细胞的细胞周期分布;原位缺口末端标记法检测转染细胞的凋亡情况.结果 人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的p53第8外显子(exon8)有突变,据此位点构建反义表达载体[pGEM3zf(+/-)p53exon8].原位杂交结果显示反义RNA(ASp53exon8'RNA)在细胞质内有阳性杂交信号;于转染后48 h反义RNA封闭效果显著,突变p53蛋白(mt-p53)的表达受抑制,细胞增殖能力下降,G2/M期阻滞.结论 针对p53基因突变位点制备的个体性反义RNA可特异性封闭乳腺癌细胞突变p53基因的表达.
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myocardin基因沉默在PDGF-BB诱导小鼠骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞分化中的作用
目的 构建myocardin特异性siRNA真核表达载体,体外观察其对myocardin基因的沉默效应及对小鼠骨髓间充质干细胞(MSC)向平滑肌样细胞分化过程中的影响.方法 培养小鼠骨髓问充质干细胞并利用血小板源生长因子(PDGF-BB,50 mg/L)联合高浓度胎牛血清(20%FBS)诱导其向平滑肌样细胞分化;构建含U6启动子和myocardin特异短发卡RNA(shRNA)编码序列的质粒载体pGen-myo-shRNA,以含非特异性shRNA编码序列的质粒载体pGenesil-Con(pCon)为阴性对照,分别转染诱导培养后第6天的小鼠MSC,48 h后用RT-PCR技术检测细胞内myocardin在mRNA水平的表达;同时用免疫组织化学方法 检测平滑肌肌球蛋白重链(sM myosin heavy chain,SM-MHC)的表达来鉴定平滑肌样细胞的分化.结果 成功构建myocardin特异性siRNA真核表达载体,利用其沉默myocardin基因后,干扰组相比空白对照组myocardin mRNA表达下调42.86%,差异有统计学意义(P
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RNA干扰端粒酶活性对HeLa细胞生物学行为的影响
目的 观察RNA干扰(RNAi)体外培养的HeLa细胞端粒酶催化亚单位(hTERT)对HeLa细胞生物学行为的影响,进一步探讨端粒酶活性与肿瘤细胞恶性生物学行为的相关性.方法 体外转录法设计合成4条针对hTERT基因的shRNA,脂质体转染HeLa细胞后经免疫荧光染色和端粒重复序列扩增-酶联免疫法(TRAP-ELISA)测定端粒酶活性,筛选出端粒酶沉默效果佳片段即B链shRNA.以B链shRNA转染HeLa细胞为实验组,转染无关siRNA的HeLa细胞为对照组,显微镜下观察细胞在纤维黏连蛋白(FN)上的铺展;CCK-8细胞计数试剂盒检测细胞在FN上黏附;划痕实验评价细胞迁移;Boyden小室侵袭实验检测细胞侵袭能力.结果 铺展实验显示细胞接种到FN上30 min时,对照组铺展细胞的比率为(31.3±7.9)%,而实验组铺展细胞的比率仅为(5.6±2.3)%,两组差异有统计学意义(P<0.01);2 h后对照组和实验组铺展细胞的比率分别为(79.4±4.8)%和(26.3±6.1)%,两组差异仍有统计学意义(P<0.01);24 h后两组所有细胞几乎均呈铺展状态.细胞黏附实验显示细胞在FN上黏附30 min时对照组细胞黏附率为(83.7±5.4)%,而实验组的细胞黏附率为(67.2±2.8)%,明显低于对照组(P<0.05).划痕实验检测细胞的迁移能力显示实验组细胞24 h迁移率为(27.1±6.2)%,明显低于对照组(58.7±15.0)%.Boyden小室侵袭实验显示在Matrigel胶上培养4 h后,实验组和对照组侵袭的细胞数分别为75.7±14.5和165.1±11.0,差异有统计学意义(P<0.05).结论 降低体外培养HeLa细胞的端粒酶活性使细胞的生物学特性发生改变,表现为减低了HeLa细胞的恶性生物学行为.
