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针刺对快速老化小鼠SAMP10转录调节因子NF-E2、YB-1、LRG47的影响
目的:探讨针刺延缓衰老的机制.方法:采用快速老化小鼠(SAMP10)、正常老化小鼠(SAMR1)为模型,运用地高辛标记的非放射性Northern blot技术,观察8月龄SAMR1对照组、SAMP10对照组、SAMP10针刺组及SAMP10非穴位刺激组全脑、皮层和海马NF-E2、YB-1、LRG47基因表达的变化.结果:SAMP10对照组小鼠NF-E2、YB-1、LRG47在全脑、皮层、海马中的表达下调,针刺后表达上调并趋向于正常组.结论:SAMP10小鼠脑衰老与NF-E2、YB-1、LRG47基因表达异常有关,针刺可以通过调节NF-E2、YB-1、LRG47基因表达增强红细胞系统功能和细胞增殖,提高细胞抗菌免疫,从而起到延缓衰老的作用.
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电针对脊髓损伤早期bcl-2 mRNA及蛋白表达的影响
目的:探讨电针治疗脊髓损伤的机制.方法:成年雄性SD大鼠,随机分为模型(MC)组、电针(EA)治疗组、甲基强的松龙(MP)组及假手术(SO)组.采用改良的Allen's捶击法致大鼠T10脊髓损伤,应用原位杂交和免疫组织化学方法及图像定量分析法观察脊髓损伤早期bcl-2 mRNA和蛋白的表达.结果:MC组脊髓损伤后6 h bcl-2 mRNA表达有增高趋势,伤后24 h表达增高;伤后6 h bcl-2蛋白表达未见明显变化,伤后24 h表达有增高趋势.EA组bcl-2 mRNA及蛋白表达均高于模型组,与MP组相比差异无显著性意义.结论:电针可上调bcl-2 mRNA及蛋白的表达,从而抑制细胞凋亡,保护神经细胞.
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头穴针刺对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑内TGF-β1mRNA表达的调节
目的:观察头穴针刺治疗急性脑缺血的机理.方法:采用大鼠急性局灶性脑缺血再灌注模型,应用原位杂交方法观察脑缺血再灌注时TGF-β1mRNA表达的变化及针刺对TGF-β1 mRNA表达的影响,同时测定了脑梗死体积.结果:假手术组大鼠TGF-β1mRNA在皮层、纹状体呈基础水平表达,脑缺血再灌注后24 hTGF-β1mRNA表达增强,针刺可明显缩小梗死的体积,明显增强皮层TGF-β1mRNA的表达.结论:针刺对缺血性脑损伤的保护作用机制可能与针刺增强脑内TGF-β1mRNA的表达有关.
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电针对大鼠脑局部缺血再灌流后c-fos、mRNA表达的影响
采用Wistar大鼠,线栓法制作脑局部缺血再灌流动物模型,以原位杂交技术及苏木素-伊红(HE)染色方法,观察电针对缺血侧额叶、顶叶及海马各区内c-fos、mRNA表达并神经元组织形态学改变的影响.结果表明,电针能显著增强脑局部缺血再灌流后病灶侧额、顶叶皮层及海马各区c-fos、mRNA表达,并能减少缺血再灌流损伤后上述各脑区神经元的变性坏死.结果提示电针对脑局部缺血后受损神经元的保护作用可能与增强了c-fos、mRNA的表达有关.
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针刺对部分去背根猫脊髓背角与备用背根节神经营养素家族及其mRNA表达的影响
目的:探讨针刺促脊髓背根侧枝出芽的机制.方法:用免疫组化和原位杂交技术检测部分去传入纤维并针刺后,猫脊髓Ⅱ板层和保留背根节内3种神经营养素及其mRNA的表达变化.结果:NGF及其mRNA分布于Ⅱ板层神经元内,针刺对二者的表达无显著影响.BDNF主要分布于神经终末和膨体内,NT-3主要分布于神经元和胶质细胞内,二者的mRNA均阴性,针刺组该二因子的表达均显著增强.三种因子及其mRNA在保留背根节部分神经元内表达,针刺组3种因子及其mRNA表达均显著增强.结论:针刺促进3种因子及其mRNA在保留背根节的表达,可能是其促进部分去传入纤维猫脊髓可塑性的机制之一.
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Cx43对针灸治疗原发性痛经大鼠效应的影响
目的:观察沉默穴位局部缝隙连接蛋白(connexin43,Cx43)的表达对针刺效应的影响,探讨针刺治疗原发性痛经的机制.方法:以催产素造成大鼠原发性痛经模型,应用RNA干扰(RNAi)技术沉默穴位局部Cx43的表达.将50只SD雌性大鼠分为正常组(N)、模型组(M)、针刺组(A)、针刺+干扰组(A+1)、针刺+干扰对照组(A+IC).应用RT-PCR方法检测大鼠子宫的催产素受体(oxytocin receptor,OTR)、加压素受体(vasopressin receptor,VPR)的mRNA表达情况;放免法和ELISA检测血浆中前列腺素E2(PGE2)和PGF2α.的舍量.结果:①A组和A+IC组的大鼠扭体次数(9.43±3.87,10.28±4.23)明显低于M组和A+I组(15.43±5.13,17.00±3.87),潜伏期(12.43±3.46,11.00±3.65)rain高于M组(7.57±1.99)min和A+I组(8.43±2.57)min(P<0.05).②A+I组穴位处的Cx43 mRNA和蛋白表达低于N组(P<0.05).③A组和A+IC组的OTR、VPR的mRNA表达较M组和A+I组降低,且差异有统计学意义(均P<0.05);M组和A+I组差异无统计学意义(P>0.05).④A组和A+IC组的PGE2升高,PGF2α降低,较M组差异有统计学意义(P<0.05).结论:沉默穴位局部Cx43能有效抑制针刺效应,通过降低痛经大鼠子宫内膜OTR、VPR及调节前列腺素合成系统,可能是针刺治疗原发性痛经的作用机制之一.
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电针刺激对心脏手术病人心肌热休克蛋白mRNA基因表达的影响
观察电针刺激对心脏手术病人心肌细胞热休克蛋白mRNA基因表达的影响.28例ASD病人,随机分为针麻组(组Ⅰ,n=6),针刺加全麻组(组Ⅱ,n=10),和全麻组(组Ⅲ,n=9),于转流前10 min,停转流,停转流30 min,停转流1 h测定CK-MB.结果:①3组病人停转流和转流后1hCK-MB均较转流前明显增加,但组Ⅲ的升幅明显高于组Ⅰ和组Ⅱ;②针刺组HSP70mRNA表达高于对照组(P<0.05).因此针刺有增加缺血心肌细胞HSP70mRNA表达作用.
关键词： 电针 心脏外科手术 热休克蛋白质类/代谢 RNA 信使/代谢 -
嘧肽霉素影响烟草花叶病毒RNA蓄积量的研究
嘧肽霉素是新报道的由土壤中分离筛选出来的不吸水链霉菌辽宁变种(Streptomyces achygroscopicus var.liaoningensis)产生的,其有效成分是胞嘧啶核苷肽类化合物,已获得农药临时登记,该药剂对烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)等多种病毒病害具有很好的防治效果[1,2].定量竞争PCR(Quantitative competitive PCR,QCPCR)是一种定量检测细胞因子较为精确的方法[3],其实质是待测核酸(DNA或RNA)与内参模板一起竞争参与PCR反应,并通过电泳将扩增产物在凝胶上明显的分开,从而进一步进行定性或定量分析[4].该技术广泛应用于医学及食品研究领域[3-6],但在植物病毒学领域的应用鲜有报道.本研究采用定量竞争PCR方法和间接ELISA方法系统地测定了嘧肽霉素对烟草花叶病毒的抑制作用,并初步探讨了该药剂的抗病毒作用机理.
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氧化低密度脂蛋白受体在人血管内皮细胞上的表达及其调控
采用放射配基结合及竞争抑制实验和反转录-聚合酶链反应检测人脐静脉内皮细胞(HUVECs)上血凝素样的氧化低密度脂蛋白受体(LOX1)的表达，表明HUVECs存在LOX1的基因表达和高亲和力位点Bmax(54.5±20.3)ng/106cell, Kd(2.01±0.6)×10-8mol/L，氧化低密度脂蛋白对其自身受体LOX1的基因表达为正反馈调节，应用LOX1抑制剂可抑制此作用。
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长链非编码RNA及其在下咽鳞状细胞癌发生发展中的作用机制
目的 总结长链非编码RNA(LncRNA)在肿瘤发生、发展中的调控机制,以及LncRNA在下咽鳞状细胞癌(HSCC)发生、发展中的作用.方法 在中国知网、万方数据、PubMed、谷歌学术、EMBASE等数据库上,以"长链非编码RNA,下咽癌/下咽鳞状细胞癌""β-连环蛋白,下咽癌/下咽鳞状细胞癌""LncRNA,tumor""LncRNA,Hypopharyngeal carcinoma/HSCC""Wnt/β-catenin,EMT""Wnt/β-catenin or/and EMT,Hypopharyngeal carcinoma/HSCC"等为关键词,检索2000年1月—2018年5月国内外针对LncRNA及其在HSCC发生发展中作用机制进行研究的有关文献资料,共检索到文献3297篇,终纳入44篇文献,其中中文文献2篇、英文文献42篇.总结LncRNA对肿瘤调控机制的研究进展,并对LncRNA和Wnt通路在HSCC发生发展中的作用机制进行重点分析.结果 LncRNA广泛参与DNA损伤修复和细胞凋亡等生理或病理过程,在生物调节过程中扮演着重要角色;Wnt信号通路是重要的细胞信号转导通路,在细胞的增殖、分化中发挥重要的作用.LncRNAs与mRNA结合促进了HSCC的发生发展,LncRNA通过Wnt信号通路促进HSCC的转移及复发.结论 LncRNA与许多肿瘤等多种疾病的发生密切相关;HSCC的发生发展受LncRNA的调控,LncRNA通过Wnt信号通路在HSCC肿瘤细胞的生长、迁移、侵袭中发挥重要作用.
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Caspase 8的多样性表达与伤口愈合
半胱氨酸蛋白酶 8(caspase 8)先前被认为只与细胞凋亡有关,但Jamora等揭示表皮caspase 8的表达水平在伤口愈合过程中存在较大的波动.他们通过原位杂交发现接近伤口的部位,表皮增厚并伴有caspase 8 RNA水平的下调.
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大鼠在体心肌缺血再灌注损伤细胞膜钙转运通道蛋白mRNA的表达变化
目的 探讨大鼠心肌在体缺血再灌注(IR)损伤后细胞膜钙转运通道蛋白的mRNA变化对钙超载的作用。方法 12只SD大鼠按随机数字法分为IR组和对照组。IR组通过结扎（缺血20 min）后松解(再灌注60 min)前降支造成心肌IR,对照组则免除结扎松解前降支。应用生理记录仪连续监测两组大鼠缺血开始前及再灌注60 min后心率、平均动脉压等血流动力学指标。全自动生化仪检测缺血前及再灌注60 min后两组大鼠血钙及肌钙蛋白T(cTnT)的水平。荧光定量PCR检测再灌注60 min后两组大鼠左心室缺血区和右心室心肌细胞膜钙转运通道蛋白即心肌细胞膜钠钙交换器1(NCX1)，L型钙通道(LVDCC)α-1C和胞膜钙转运ATP酶1(PMCA1 )mRNA的表达。结果两组大鼠缺血前的心率、平均动脉压均高于再灌注60 min后，而两组间缺血前和再灌注60 min后的心率、平均动脉压差异则无统计学意义。两组血浆Ca2+浓度在缺血前与再灌注60 min后差异无统计学意义，同时间点两组之间的差异也没有统计学意义。缺血前IR组与对照组血浆cTnT浓度水平相近，缺血60 min后IR组血浆cTnT浓度较对照组升高[(4.29±2.22) μg/L比(1.62±0.60)μg/L，P=0.031]；两组血浆cTnT浓度在缺血前与再灌注60 min后差异也有统计学意义（均P＜0.05）。NCX1，LVDCCα-1C和PMCA1的mRNA表达在再灌注60 min后同心室两组间和同组内左右心室之间的差异均无统计学意义（NCX1：对照组左心室为50±4，右心室为47±9；IR组左心室为55±6,右心室为53±11；LVDCCα-1C:对照组左心室为33±7，右心室为30±7；IR组左心室为28±3，右心室为37±5；PMCA1，对照组左心室为70±10,右心室为53±11；IR组左心室为66±12，右心室为78±8;均P＞0.05）。结论 大鼠在体心肌缺血20 min再灌注60 min后,NCX1、LVDCCα-1C和PMCA1的mRNA表达水平均无显著改变，提示钙超载并非由细胞膜钙转运通道蛋白数量改变引起。
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小分子干扰RNA对新生鼠肺成纤维细胞转化生长因子β1的干预效果及意义
目的 探讨转化生长因子β1(TGF-β1)小分子干扰RNA(siRNA)体外转染新牛鼠肺成纤维细胞的干预效果,研究TGF-β1 siRNA的佳干预剂量及维持时间. 方法 首先采用化学合成TGF-β1 siRNA对新生鼠肺成纤维细胞进行干预,通过实时定量PCR检测技术筛选出有效干扰片段;然后构建TGF-β1 siRNA腺病毒载体,体外转染新生鼠肺成纤维细胞,半定量PCR检测体外转染后TGF-β1基因的抑制效果,确定其佳干预剂量及维持时间. 结果 (1)化学合成siRNA抑制TGF-β1基因表达的效果:siRNA剂量为20 pmol,转染后24 h检测抑制效果,第2、3、4条siRNA均有不同效果,其中第3条siRNA抑制效率>70%;(2)TGF-β1 siRNA腺病毒载体转染细胞,观察20、50μl不同剂量转染后24 h抑制情况,并与20μl阴性和空白对照比较,结果显示20、50μl均有明显抑制效果;观察转染后24、48、72 h的抑制效果,比较显示转染后24 h有明显抑制效果,72 h抑制效果强,说明随着转染时间延长,抑制作用越明显. 结论 TGF-β1 siRNA腺病毒载体体外转染新生鼠肺成纤维细胞对TGF-β1的表达均有明显抑制效果.
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小干扰RNA靶向沉默CXCR2基因抑制肝癌细胞的增殖
目的 研究CXCR2-小干扰RNA(siRNA)基因体外抑制肝癌细胞增殖的作用.方法 将CXCR2-siRNA以脂质体转染法转染肝癌细胞hepG2,24h后荧光显微镜观察细胞荧光含量.采用RT-PCR及免疫印迹法分别检测正常肝Chang细胞、未转染肝癌hepG2细胞以及转染CXCR2-siRNA基因后hepG2细胞在转染24、48、72h后的CXCR2 mRNA和蛋白表达水平.以未转染的hepG2细胞为对照,CCK8法检测转染CXCR2-siRNA的hepG-2细胞在转染24、48、72 h后的增殖.以未转染的hepG2细胞为对照,检测转染CXCR2-siRNA 24 h后hepG2细胞与Transwell小室孵育24h时的侵袭能力.结果 CXCR2-siRNA转染hepG2 24 h后镜下可见大量绿色荧光,转染率为80％.hepG2细胞CXCR2mRNA和蛋白表达水平高于Chang细胞(mRNA:1.69±0.22比0.63±0.31,蛋白:1.93±0.25比0.84±0.29,均P＜0.05).转染CXCR2-siRNA24和48 h后hepG2细胞CXCR2mRNA表达量低于未转染的hepG2细胞(0.75±0.24、0.83±0.21比1.78±0.25,均P＜0.05),72 h后CXCR2-siRNA虽然仍能抑制hepG2细胞CXCR2mRNA的表达,但与未转染的hepG2细胞相比差异并无统计学意义(1.35±0.18比1.78±0.25,P＞0.05).转染CXCR2-siRNA24和48 h后的hepG2细胞CXCR2蛋白表达低于未转染的hepG2细胞(0.91±0.25、1.16±0.23比1.98±0.31,均P＜0.05),转染72 h后蛋白水平有所上升,与对照组相比差异无统计学意义(1.71±0.18比1.98±0.31,P＞0.05).转染CXCR2-siRNA 24、48、72 h后hepG2细胞mRNA和蛋白表达差异均无统计学意义.与未转染的hepG2细胞相比,转染CXCR2-siRNA 24、48、72 h后hepG2细胞增殖受到抑制(均P＜0.05).转染CXCR2-siRNA的hepG2细胞对Transwell小室的侵袭能力明显低于未转染的hepG2细胞[(36±5)个腐倍视野(×200)比(526±9)个府倍视野(×200),P＜0.05].结论 siRNA沉默CXCR2基因体外可有效抑制肝癌细胞的增殖.
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联合靶向小干扰RNA对疱疹病毒2感染的体外抑制作用
目的 探讨联合靶向特异性小干扰RNA(siRNA)对疱疹病毒(HSV)2的体外特异抑制作用.方法 将体外合成的靶向HSV-2编码包膜糖蛋白gB的UL27.2基因、靶向DNA结合蛋白UL29.2基因的siRNA和该两种联合靶向特异性siRNA制剂,共转染Vero细胞并感染HSV-2,观察靶基因的表达情况、Vero细胞病变、空斑减数实验和子代病毒滴度并进行各组间比较:结果特异性UL27.2siRNA、UL29.2 siRNA和联合siRNA转染Vero细胞后,均能不同程度抑制各HSV-2临床株感染所导致的细胞病变,对病毒增殖抑制率分别为63.9%、86.7%和93.3%.实时定量PCR检测各组siRNA分别对UL27.2和UL29.2两个基因的表达,结果显示UL27.2 siRNA和UL29.2 siRNA对各自的靶向基因均有抑制,而联合靶向siRNA制剂对两个基因的抑制率高.结论 联合靶向特异性siRNA制剂能有效抑制HSV-2的感染和复制.
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张力刺激对关节软骨细胞β-肌动蛋白mRNA表达的影响
目的 观察张力刺激对关节软骨细胞β-肌动蛋白(β-aetin)mRNA表达的影响.方法 分别获取正常和骨关节炎关节软骨细胞,给予3%、6%和15%的张力刺激,运用实时定量PCR方法检测不同张力刺激强度下关节软骨细胞β-actin mRNA表达的变化.结果 6%和15%的张力刺激均可明显提高lE常关节软骨细胞β-actinmRNA表达(1.34±0.05,1.36±0.04,P＜0.05),而只有15%的张力刺激才能明显增加骨关节炎关节软骨细胞β-actin mRNA表达.结论 关节软骨细胞β-actin mRNA表达量随张力刺激强度不同而变化,不同内外环境使关节软骨细胞对张力刺激的反应不同,故在其相关生物力学研究中不能应用β-actin作为内参.
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靶向Atp6i和T细胞免疫应答cDNA7的小干扰RNA载体构建及其腺相关病毒重组颗粒的制备
目的 构建靶向Atp6i和T细胞免疫应答cDNA7(TIRC7)的RNA干扰重组体,包装成腺相关病毒(AAV)重组颗粒,为使用该干扰重组体进行体内外基因治疗相关疾病提供依据.方法 设计特异性针对Atp6i和TIRC7基因共同区域的小干扰RNA序列,连接到经Xba Ⅰ和BglⅡ酶切线性化的pAAV.H1载体上并转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后进行测序分析.将酶切及测序分析鉴定成功的小干扰RNA序列与pAAV-RC、pHelper采用磷酸钙沉淀法共转染AAV-293细胞,复制、包装组成AAV.H1Atp6i重组病毒颗粒,以磷酸盐缓冲液(PBS)作为空白对照组,AAV.H1Luc作为阴性对照组,荧光显微镜观察转染效率.Western免疫印迹检测AAV.H 1Atp6i重组病毒颗粒对TIRC7蛋白表达的影响.结果 成功构建靶向Atp6i和TIRC7的RNA干扰重组体.重组质粒、pAAV-RC及pHelper成功转染AAV-293细胞,转染效率近100％,成功包装成AAV.H1Atp6i重组病毒颗粒.Western免疫印迹显示TIRC7蛋白在空白对照组、阴性对照组及AAV.H1Atp6i处理组均有表达,相对分子质量为75 000,AAV.H1Atp6i处理组TIRC7蛋白表达较空白对照组和阴性对照组均下降了80％ (0.271 ±0.072比0.988±0.042、0.992±0.053,均P＜0.05).结论 成功获得靶向Atp6i和TIRC7的RNA干扰重组体以及AAV.H1Atp6i重组病毒颗粒,可以干扰TIRC7蛋白的表达.
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RNA干扰同源盒A10表达对K562细胞增殖及凋亡的影响
目的 通过构建靶向同源盒A10(HOXA10)的真核表达载体,探讨利用RNA干扰沉默HOXA10基因对人慢性髓系白血病细胞株K562增殖和凋亡的影响.方法 根据筛选的针对HOXA10的特异性有效小干扰RNA(siRNA)序列设计合成短发夹RNA(shRNA)寡核苷酸链,构建pGPHI-GFP-Neo-HOXA10真核表达载体并测序,应用阳离子脂质体转染K562细胞.实验分为细胞对照组(仅加等量细胞及培养基),阴性对照组(脂质体转染阴性对照质粒)、实验组(脂质体转染pGPHI-GFP-Neo-HOXA10).转染载体24 h后利用RT-PCR检测各组HOXA10 mRNA表达；转染载体24、48、72 h后应用MTT法检测各组细胞增殖并计算细胞抑制率；转染载体48 h后应用流式细胞术检测各组细胞凋亡.结果 成功构建pGPHI-GFP-Neo-HOXA10载体并转染K562细胞.与细胞对照组和阴性对照组比较,实验组转染载体能有效降低HOXA10 mRNA的表达水平[(38.86±4.49)％比(88.52±9.24)％、(86.75±7.38)％,P＜0.05],而阴性对照组与细胞对照组比较差异则无统计学意义(P＞0.05).与阴性对照组比较,实验组载体作用于K562细胞24、48、72 h后,细胞增殖能力均明显下降,细胞抑制率明显升高[(39.92±0.74)％比(7.98±5.52)％;(55.62±1.18)％比(8.27±3.45)％;(66.30±1.26)％比(8.63±3.58)％;均P＜0.05].实验组细胞凋亡率较细胞对照组、阴性对照组也显著升高[(22.29±1.67)％比(9.82±0.69)％、(10.14±0.96)％,P＜0.05],而阴性对照组与细胞对照组比较差异则没有统计学意义(P＞0.05).结论 构建的真核表达载体pGPHI-GFP-Neo-HOXA10可有效沉默K562细胞中HOXA10基因的表达,能明显抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡.
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介绍一种石蜡组织标本RNA与DNA共提取的方法
近几年,随着对恶性肿瘤发生发展分子机制的深入研究,靶向治疗在肿瘤的治疗领域发挥着越来越重要的作用,因此个体化分子检测肿瘤中是否存在靶向药物的相应分子靶点[1],已成为临床医师实施靶向药物治疗的依据.由于石蜡组织同时提取DNA和RNA时需要的标本量较大,尤其对于穿刺组织因标本量的局限性,有的只能开展部分检测项目.本文介绍一种石蜡组织标本RNA和DNA共提取的方法,可以大大减少标本的使用量.
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保幼激素Ⅲ对三带喙库蚊滞育发生期间卵巢滤泡和体内RNA变化的影响
目的:探索保幼激素Ⅲ(JH3)对滞育三带喙库蚊卵巢滤泡和体内RNA变化的影响.方法:短光照和低温联合作用导致三带喙库蚊滞育后,用2ppm 0.5ul或3ppm 0.5ul/蚊外源JH3点滴处理,观察卵巢滤泡发育情况,并测定蚊体内RNA和卵巢内蛋白质含量的变化.结果:低温和短光照引起三带喙库蚊滞育后,卵巢滤泡发育受到抑制,体内RNA的含量明显减少,JH3处理可诱导部分滞育的三带喙库蚊转入发育状态,解除滞育的个体卵巢第一滤泡增大,体内RNA含量增加,但对卵巢蛋白的含量没有影响.结论:JH3可诱导滞育三带喙库蚊卵巢发育,体内RNA合成增加.
