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基于苯甲酸HPLC定量分析的制草乌氨基醇型乌头原碱类水解产物的含量测定
目的 建立推算乌头碱氨基醇型水解产物含量的方法.方法 通过控制苯甲酰乌头原碱水解条件,分别获得不同阶段的水解产物,确定苯甲酰乌头原碱降解率与苯甲酸转化率之间的关系,建立通过苯甲酸HPLC定量分析推导氨基醇型乌头原碱类水解产物含量的方法,并利用该方法对药典法制草乌生物碱含量进行测定.结果 苯甲酰乌头原碱降解率与苯甲酸转化率约为1∶1,通过测定苯甲酸含量计算氨基醇型乌头原碱类含量的公式为:氨基醇型乌头原碱类含量≈(苯甲酸的含量×529)/122.药典法制草乌的双酯型生物碱、单酯型生物碱和氨基醇型乌头原碱类含量分别为0.0025％、0.16％和0.005％.结论 通过定量分析苯甲酸含量推导乌头碱氨基醇型水解产物含量的方法可行,操作简单.
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HPLC同时测定附子理中丸中3种单酯型生物碱含量
目的:建立附子理中丸中3种单酯型生物碱(苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱)的含量测定方法.方法:色谱柱Alltimate C18(4.6 mm ×250 mm,5μm)；保护柱Alltimate C18(4.6 mm ×7.5 mm,5μm);流动相40 mmol·L-1乙酸铵(加氨水调pH 10.00 ±0.5)-乙腈梯度洗脱；流速1.0 mL· min-1,检测波长240 nm,柱温35℃.结果:苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱分别在进样量0.212 ～1.272 μg,0.0116～0.0696 μg,1.035 ～6.210 μg线性关系良好,r分别为0.9996,0.9997,0.9996,在8h内稳定性良好.同时,针对苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱,附子理中丸(河南宛西)平均加样回收率依次为97.59％ (RSD 1.90％)、98.81％(RSD 2.00％)、98.37％(RSD 1.72％),附子理中丸(安徽东芝堂)平均加样回收率依次为98.18％ (RSD 2.39％)、103.06％(RSD 1.77％)、98.23％(RSD 2.05％),而附子理中丸(北京同仁堂)仅含苯甲酰新乌头原碱的平均加样回收率100.17％(RSD 2.29％).结论:方法结果准确可靠、快速,适用于构建附子理中丸成方制剂的多指标质量评价模式.
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附子配伍甘草后对附子生物碱类成分大鼠在体肠吸收特性的影响
目的:研究附子-甘草配伍前后附子中6种生物碱类成分的大鼠在体肠吸收特征.方法:采用大鼠在体肠灌注模型,以紫外分光光度法测定酚红质量浓度,利用LC-MS测定灌注液中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱的质量浓度,分别研究附子单煎液、附子-甘草合煎液、附子-甘草合并液3种配伍方式对上述6种生物碱类成分肠吸收的影响.结果:与附子单煎液相比,苯甲酰乌头原碱在附子-甘草合煎液、附子-甘草合并液中的吸收速率常数(Ka)和单位时间吸收率(A)呈下降趋势;苯甲酰新乌头原碱在附子-甘草合煎液、附子单煎液中的Ka和A相比附子-甘草合并液有所减少;附子-甘草合煎液中次乌头碱的Ka和A相比附子单煎液呈下降趋势,附子-甘草合并液中次乌头碱的Ka和A相比附子单煎液均呈升高趋势,附子-甘草合煎液中苯甲酰次乌头原碱、乌头碱和新乌头碱的吸收相比附子单煎液中均有所降低.结论:附子配伍甘草后6种乌头碱类成分在大鼠十二指肠中的吸收均有一定程度的降低,为阐释“附子得甘草而后缓”的配伍理论提供了实验依据.
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HPLC同时测定复方藤乌软膏中6种乌头类生物碱含量
目的：建立高效液相色谱法(HPLC)同时测定复方藤乌软膏中6种乌头类生物碱含量的方法。方法色谱柱为Agilent XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm)；流动相A为乙腈-四氢呋喃(25∶8),B为0.1 mol/L醋酸铵溶液(每1000 mL加冰醋酸0.5 mL),梯度洗脱；流速：1 mL/min；检测波长：235 nm；柱温：25℃。结果乌头碱在0.072～0.648μg具有良好的线性关系(r＝0.9995),平均回收率为99.29%,RSD＝1.25%；新乌头碱在0.062～0.648μg具有良好的线性关系(r＝0.9995),平均回收率为99.12%,RSD＝0.85%；次乌头碱在0.064～0.384μg具有良好的线性关系(r＝0.9998),平均回收率为99.57%,RSD＝1.07%；苯甲酰乌头原碱在0.056～0.672μg具有良好的线性关系(r＝0.9992),平均回收率为98.11%,RSD＝0.61%；苯甲酰新乌头原碱在0.055～0.993μg具有良好的线性关系(r＝0.9999),平均回收率为99.27%,RSD＝1.10%；苯甲酰次乌头原碱在0.078～0.702μg具有良好的线性关系(r＝0.9998),平均回收率为99.08%,RSD＝1.38%。结论本方法操作简便、灵敏度高、重复性好,结果准确,可作为复方藤乌软膏中乌头类生物碱的含量测定方法。
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乌头碱水解转化规律的研究
目的:了解乌头碱的水解转化规律.方法:将乌头碱单体置纯水中,密封加热8,12,16,20,24 h,水解液碱化萃取,采用HPLC-MS分析主要水解产物;进一步采用中性氧化铝柱色谱分离,得到主要水解产物,并鉴定结构.结果:经HPLC-MS分析,鉴定主要水解成分峰为苯甲酰乌头原碱和乌头原碱.水解20 h,苯甲酰乌头原碱的转化率高.结论:双酯型的乌头碱可水解转化为单酯型乌头碱和乌头原碱;在控制条件下,苯甲酰乌头原碱为主要水解产物.
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HPLC分离测定四逆汤中3种双酯型生物碱及其6种水解产物
四逆汤为中医的经典名方,由附子(制)、干姜及炙甘草(蜜炙)组成,具有温中祛寒、回阳救逆的功效.现代药理研究表明该药具有强心,抗休克,增加冠脉血流量的作用[1].该方的君药为附子,其主要成分为乌头类生物碱(包括乌头碱、新乌头碱和次乌头碱),此类生物碱属于双酯类生物碱,毒性极大.酯类生物碱分子中的酯键是产生毒性的关键部位,在水中加热易水解,首先生成苯甲酰乌头原碱,进一步反应产生乌头原碱,两类水解产物毒性极小,但仍有药理活性[2].因此,能有行之有效的方法准确检测出该药中的各种活性成分是十分重要的,对确保临床用药的安全性有效性以及四逆汤这一经典药方的新剂型研发都有极为重大的意义.
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反相离子对色谱法测定附子中生物碱成分
目的测定附子中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、北乌碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰新乌头原碱等6种生物碱的含量.方法用反相离子对HPLC法,使用AichromBond-1 C18柱(250 mm×4.6 mm ID);流动相:乙腈-5 mmol·L-1NaH2PO4溶液,磷酸调至pH 4.5(50:50),内含7 mmol·L-1十二烷基硫酸钠(SDS);检测波长:235 nm;流速:1.0 mL·min-1;柱温:35℃.结果以上6种生物碱可以完全分离,准确测定.结论该方法准确度高,可应用于附子中生物碱的含量测定.
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基于HPLC-Q-TOF-MS研究6种乌头生物碱类成分的裂解途径
目的 研究6种乌头类生物碱(乌头碱、次乌头碱、中乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰中乌头原碱)的质谱裂解途径.方法 采用高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱(HPLC-Q-TOF-MS)对该类化合物进行分析.结果 在正离子模式下,乌头类生物碱的主要裂解途径是连续丢失CH3OH与H2O.双酯型生物碱也可以在C-8位置断裂,失去CH3COOH分子形成明显的特征碎片离子,从而实现与单酯型生物碱的区分.结论 此质谱裂解途径可为乌头类生物碱的结构鉴定提供依据,采用HPLC-Q-TOF-MS技术可以高效地分析中药中乌头类生物碱类化学成分,有利于化合物的分析和鉴定.
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基于外翻肠囊模型的黄芪-附子配伍对附子6种生物碱肠吸收的影响研究
目的 研究黄芪-附子药对配伍对附子3种单酯型生物碱(苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱)和3种双酯型生物碱(次乌头碱、新乌头碱、乌头碱)肠吸收的影响.方法 运用大鼠外翻肠囊模型,选择十二指肠、空肠、回肠为研究肠段,以表观渗透系数(Papp)为评价指标,考察黄芪对附子6种生物碱Papp的影响.结果 当附子-黄芪3∶1时,黄芪在十二指肠和回肠能显著降低双酯型生物碱的Papp,在3种肠段均能降低单酯型生物碱的Papp;当附子-黄芪1∶1时,除次乌头碱在回肠外,黄芪能显著降低双酯型生物碱的Papp;当附子-黄芪1∶3时,黄芪能显著降低单酯型生物碱(除回肠外)的Papp,在各肠段均能显著降低3种双酯型生物碱的Papp.结论 黄芪可抑制附子生物碱的吸收,且其抑制作用因配伍比例、生物碱的种类和肠段不同而不同.
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附子水溶性生物碱提取纯化工艺研究
目的 研究附子水溶性生物碱的提取纯化工艺.方法 采用UPLC-MS/MS技术,以14种生物碱(多根乌头碱、宋果灵、附子灵、尼奥灵、塔拉萨敏、新乌头原碱、乌头原碱、次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、乌头碱、次乌头碱)的总量为考察指标,采用单因素实验和正交试验方法筛选佳提取工艺;以8种水溶性生物碱(乌头原碱、新乌头原碱、次乌头原碱、附子灵、尼奥灵、塔拉萨敏、宋果灵、多根乌头碱)的量为考察指标,对5种大孔树脂吸附和解吸附性能进行考察,优选佳纯化工艺.结果 佳提取纯化工艺为蒸附片加10倍量pH值3.5的酸水,煎煮3次(维持pH值约3.5),每次2h,合并水煎液,用20％ NaOH溶液调pH值10.0,加热回流水解2h后,放冷,调pH值11.0,上大孔树脂HPD 300,上样量为生药2.5 g/mL树脂,6 BV水洗除杂,4 BV 80％乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,减压浓缩干燥,即得附子水溶性生物碱提取物.该提取物收率为1.69％,其中新乌头原碱、乌头原碱、次乌头原碱、附子灵、尼奥灵、塔拉萨敏、多根乌头碱、宋果灵的总量高达约15％.结论 优选得到的提取纯化工艺稳定可行,为附子水溶性生物碱的研究应用提供参考.
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HPLC测定草乌与瓜蒌配伍前后6种毒性成分量的变化
目的 研究草乌Aconiti Kusnezoffi Radix与瓜蒌TrichosanthisFructus按照13个不同比例配伍后,苯甲酰新乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、中乌头碱、乌头碱、次乌头碱成分量的变化.方法 草乌与瓜蒌的干燥粉末,混匀,分别用10倍量蒸馏水和75％乙醇浸润1h,提取2次,每次1h,合并提取液,离心,取上清液.HPLC采用Welch Xtimate C18 (250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,乙腈-40 mmol/L乙酸铵(氨水调pH 10.0)梯度洗脱;体积流量1mL/min,检测波长235nm.结果 草乌与瓜蒌配伍后,随瓜蒌比例增加,药液pH值逐渐降低,单酯型生物碱总量变化不明显,而双酯型生物碱总量增加.结论 草乌与瓜蒌配伍后,从化学成分来看,双酯型生物碱类成分增加导致毒性增加.
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HPLC-MS/MS多组分定量测定结合化学计量学研究市售小金丸的质量一致性
目的 建立HPLC-MS/MS同时测定小金丸中藁本内酯、原儿茶酸、肌苷、齐墩果酸、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱、乌头碱10种成分的检测方法,并结合聚类分析、主成分分析(PCA)等化学计量学方法对不同厂家、不同批次小金丸的质量一致性进行评价.方法 建立HPLC-MS/MS方法同时测定小金丸中10种活性成分的量.采用Agilent Technologies Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为0.1％甲酸水溶液-乙腈;质谱采用ESF多反应监测(MRM)模式扫描,并对定量测定结果进行聚类分析和PCA,综合评价市售小金丸质量的差异性.结果 方法学验证结果显示,10个化合物在各自质量浓度范围内线性关系良好(R2＞0.990 0);定量限为0.01～4.49 ng/mL,平均回收率在94.82％～104.33％.样品测定结果表明A厂家小金丸质量与其他厂家存在较大差异,PCA降维处理后所得荷载图中,苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、乌头碱、肌苷等组分离原点距离远,其量的差异是导致一致性差异的主要成分.结论 市售小金丸质量一致性较差,各厂家在小金丸生产过程中应加强对制草乌和地龙药材的质量控制.
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苯甲酰乌头原碱、苯甲酰中乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱对照品的制备
目的 建立苯甲酰中乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱对照品的制备方法.方法 将乌头碱、中乌头碱和次乌头碱3种双酯型生物碱在高温下水解,再结合柱层析方法制备得到苯甲酰乌头原碱、苯甲酰中乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱3种单酯型生物碱,通过HPLC、MS、1H-NMR、13C-NMR等方法进行纯度、结构鉴定.结果 制备得到的苯甲酰乌头原碱、苯甲酰中乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱质量分数分别为98.6％、98.5％、99.3％.结论 该方法简单,制备所得的对照品可用于附子质量控制.
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乌头碱转化菌的筛选及发酵工艺初步优化
通过对60份自然界土样微生物进行定向筛选,获得一株细菌SIPI-18-5,该菌株可以将乌头碱转化为单酯型或毒性更小的化合物.通过质谱分析其转化产物,初步判断其中含有苯甲酰乌头原碱和去氧苯甲酰乌头原碱.进一步优化发酵培养和转化工艺,终确定发酵培养基(g/L)为:葡萄糖10,(NH4)2SO4l,酵母膏10,FeSO4 0.01,CaCO35,消前pH8.0,接种量5％.佳转化工艺为:转化温度30℃,摇床转速180 r/min,250 ml摇瓶装量50 ml,乌头碱的佳添加量为0.1 g/L,并于转接发酵后16h添加乌头碱作为诱导剂.在适条件下,苯甲酰乌头原碱的生成量为0.051 g/L,摩尔转化率为54.5％.
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苯甲酰乌头原碱配伍芍药苷的抗炎镇痛作用研究
目的 探讨不同剂量苯甲酰乌头原碱配伍芍药苷的抗炎镇痛作用.方法 通过小鼠耳肿胀试验、大鼠足肿胀试验、小鼠热板试验和小鼠扭体试验, 研究不同剂量苯甲酰乌头原碱配伍芍药苷的抗炎镇痛作用.结果 苯甲酰乌头原碱配伍芍药苷 (高剂量配伍组) 可显著抑制二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀 (P<0.05) .在1 h时, 苯甲酰乌头原碱配伍芍药苷可显著抑制大鼠足肿胀 (P<0.05或<0.01);在2 h时, 中、高剂量配伍组可显著抑制大鼠足肿胀 (P<0.05或<0.01), 其中高剂量配伍组相对于芍药苷组和苯甲酰乌头原碱高剂量组, 大鼠足肿胀显著减轻 (P<0.05);在4 h时, 中、高剂量配伍组可显著抑制大鼠足肿胀 (P<0.05或<0.01), 高剂量配伍组相对于芍药苷组, 大鼠足肿胀显著减轻 (P<0.05) .在1 h和1.5 h时, 高剂量配伍组可显著升高小鼠热刺激疼痛的痛阈值 (P<0.05) .高剂量配伍组可显著升高小鼠冰醋酸刺激疼痛的痛阈值 (P<0.05) .苯甲酰乌头原碱配伍芍药苷可显著减少冰醋酸刺激引起的小鼠扭体次数 (P<0.01), 其中高剂量配伍组相对于芍药苷组和苯甲酰乌头原碱高剂量组, 小鼠扭体次数显著减少 (P<0.01) .结论 苯甲酰乌头原碱配伍芍药苷可增加苯甲酰乌头原碱、芍药苷的抗炎镇痛作用.
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不同配伍对芍药甘草附子汤中苯甲酰类乌头碱含量变化的影响
目的探讨芍药甘草附子汤不同配伍对苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱3种成分含量变化的影响.方法 采用HPLC法对不同配伍样品煎液中的3种苯甲酰乌头碱进行含量测定,并分析比较不同煎煮时间不同配伍对其含量变化的影响.色谱条件:BDS Hydedsil C18 (250mm×4.6 mm,5μm),流动相:乙腈∶四氢呋喃(25∶15)-0.1 mol·L-1醋酸铵溶液梯度洗脱,检测波长235 nm,柱温35℃,流速1.0 mL·min-1.结果芍药甘草附子汤中各配伍与单味附子相比,苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的含量均升高.结论附子与甘草、白芍配伍后能有效地起到减毒增效的作用,体现了中医药配伍用药的合理性和科学性.
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反相高效液相色谱法同时测定骨刺消痛胶囊中3种单酯型生物碱的含量
目的 建立RP-HPLC法同时测定骨刺消痛胶囊中3种单酯型生物碱含量.方法 色谱柱为Inert Sustain C18柱(5 μm,4.6 mm×250 mm);流动相A为乙腈-四氢呋喃(25:8),流动相B为0.1mol·L-1醋酸铵溶液(每1000mL加冰醋酸0.5 mL),梯度洗脱;流速:1.0mL·min-1;检测波长:234nm;柱温:30℃.结果 苯甲酰新乌头原碱在进样量为0.0246～0.615 μg与峰面积具有良好的线性关系(r=0.9997),低、中、高浓度平均加样回收率分别为96.8％、98.9％、97.8％,RSD分别为0.94％、0.88％、0.95％;苯甲酰乌头原碱在进样量为0.0987～2.4675 μg与峰面积具有良好的线性关系(r=0.9999),低、中、高浓度平均加样回收率分别为100.1％、99.8％、100.3％,RSD分别为0.43％、0.25％、0.19％;苯甲酰次乌头原碱在进样量为0.0118～0.295 μg与峰面积具有良好的线性关系(r=0.9998),低、中、高浓度平均加样回收率分别为97.7％、99.8％、98.1％,RSD分别为0.91％、1.2％、0.97％.结论 本方法操作简便、灵敏度高、重复性好,结果准确,可作为骨刺消痛胶囊中单酯型生物碱的含量测定方法.
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RP-HPLC法测定五生饮中3种单酯型乌头类生物碱的含量
目的 建立五生饮中3种单酯型乌头类生物碱(苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱)的含量测定方法.方法 采用YMC-Pack ODS-AM C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),柱温:35℃,以乙腈-四氢呋喃(25:15)为流动相A,0.1 mol·L-1醋酸铵溶液(每1000 mL加冰醋酸0.5 mL)为流动相B,梯度洗脱,流速:1.0 mL·min-1,检测波长:235 nm,进样量:10μL.结果 苯甲酰新乌头原碱在146.96～ 1469.60 ng范围内线性关系良好,r=0.9999,平均回收率为99.05％(RSD为1.87％);苯甲酰乌头原碱在16.78 ～ 167.80 ng范围内线性关系良好,r=0.9998,平均回收率为99.42％(RSD为1.94％);苯甲酰次乌头原碱在20.30 ～ 203.00ng范围内线性关系良好,r=0.9999,平均回收率为100.15％(RSD为1.53％).结论 本研究所建立的方法操作简单,稳定性好,准确度高,重复性好,为五生饮水煎剂的质量控制提供参考.
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附子的安全应用
附子为临床回阳救逆之要药,其主要成份为乌头碱、次乌头碱、中乌头碱等.其中,以乌头碱(口服0.2mg可中毒,3 ～ 4mg致死)毒性大,但经炮制和合理配伍后,毒性减弱.附子传统的炮制品有白附片、熟附片、黑顺片、黄附片、盐附子和胆附子等.各类炮制方法是用较长的时间浸泡或煮制,使乌头碱结构中的两个酯键水解,首先失去乙酰基,生成单酯类生物碱苯甲酰乌头原碱,再继续水解,失去苯甲酰基,生成乌头原碱.乌头原碱几乎丧失了麻辣的味感,而带有苦味.苯甲酰乌头原碱的毒性约为乌头碱的1/200,而乌头原碱的毒性仅为乌头碱的1/2000.次乌头碱和中乌头碱也能水解,它们首先水解成苯甲酰次乌头碱和苯甲酰中乌头碱,继而水解得次乌头胺和中乌头胺,从而毒性下降.临床上有很多本身具一定毒性、药理作用与附子相似,与之配伍具协同作用而增强毒性的中药,因此要引起注意*"①慎与蟾酥合用:蟾酥为强心固醇混合物,有效成份蟾酥精,药理作用与附子相似,可通过兴奋迷走神经中枢直接作用于心肌,与附子配伍,对心脏作用大大加强,结果导致附子中毒.②慎与罗布麻合用:罗布麻含有强心甙即罗布麻甙及毒毛旋花子甙元等,有强心利尿作用,与附子合用药效增强,严重中毒时,可抑制心脏的传导系统和兴奋异位自律点而发生各种心律失常.③慎与麻黄合用:麻黄碱具有拟肾上腺素作用,能促进肾上腺,神经与肾上腺髓质嗜铬细胞释放去甲肾上腺素,而间接发挥拟肾上腺素的作用;同时麻黄碱的结构与肾上腺素的结构类似,可与α,β受体结合,直接兴奋肾上腺,兴奋心脏,使血压升高,心律加快,可增加附子对心脏的毒性.④慎与山楂合用:山楂的主要成分为有酸和黄酮类化学物,有增强心肌收缩力,增加心输出量,减慢心律作用,与附子有协同作用,致其毒性增强.
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HPLC测定附杞固本膏中单酯型生物碱的含量
目的 建立附杞固本膏中单酯型生物碱的高效液相色谱含量测定方法.方法 色谱柱Waters XTerra RP18 5mm(4.6mm×250mm);柱温30℃;流动相:以乙腈-四氢呋喃(25∶15)为流动相A,以0.1 mol/L醋酸铵溶液(每1000mL含冰醋酸0.5mL)为流动相B,进行梯度洗脱;流速1.0mL/min;检测波长为235nm.结果 经方法学验证表明,苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱分别在0.045-1.800μg、0.0425-1.7000μg、0.0442-1.7680μg范围内呈线性关系,精密度、稳定性、重现性均符合要求,本测定方法的平均回收率分别为99.89％、99.22％、101.12％,RSD为1.72％、1.75％、2.32％(n=6).结论 该方法简便、快速、准确、无干扰,可用于该制剂的质量控制.
