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环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)在丙型肝炎病毒基因检测中的应用
该文介绍了一种便捷、灵敏而又特异的环介导逆转录等温扩增基因检测技术,该技术分别使用特异对应于靶序列中8个基因区段的3对特殊引物,并在反转录酶和Bst-DNA聚合酶的作用下对靶序列进行等温核酸扩增反应,整个检测反应只需1～2h.利用这种技术成功检测了丙型肝炎病毒基因,对60份经Real-time PCR或RT-PCR验证阳性的血清样品检测,阳性符合率为98%.同时,对扩增终产物进一步进行酶切分析,并与HIV、HBV和不同亚型流感病毒RNA进行交叉反应和特异性测试,均与预期结果吻合.将Real-time PCR定量后的RNA系列稀释后对检测方法的灵敏度进行了测试.结果显示,该技术的检测灵敏度在理论上可达到10个拷贝的RNA分子.以上结果证明,RT-LAMP扩增技术是一种检测程序简单、灵敏度和特异性较高的基因检测手段,在丙型肝炎病毒的快速检测方面具有一定的开发潜力.
关键词： 丙型肝炎病毒 环介导逆转录等温扩增 实时监控聚合酶链反应 -
融合表达DEC205单链抗体和NS3蛋白的HCV DNA疫苗的免疫原性研究
为研发新型HCV DNA疫苗并探讨优化其免疫原性的策略,我们分析靶向树突状细胞(Dendritic cells,DC)的分子对HCV DNA疫苗免疫原性的影响.我们基于抗小鼠DC细胞表面分子DEC205/CD205的单克隆抗体DEC205的单链分子,构建可单独表达DEC205单链抗体或者与HCV非结构蛋白NS3融合表达的DNA表达质粒,并构建单独表达HCV非结构蛋白NS3的DNA表达质粒;经瞬时转染法鉴定HCV NS3及其与DEC205单链抗体融合蛋白的表达;随后采用注射结合电转的方式免疫Balb/C小鼠并研究各疫苗的体液(NS3特异性IgG抗体)与细胞免疫(IFN-γ ELISPOT)效果.结果表明:DEC205单链抗体基因与HCV NS3编码基因的融合可显著增强NS3特异的免疫应答;采用皮内注射加卡钳电极电转的方式可以产生强的NS3特异性抗体和T细胞免疫反应.因此,通过DEC205单链抗体与HCV DNA疫苗靶抗原融合可明显增强免疫应答效果.该策略为HCV及其他类似病原的新型DNA疫苗研制提供重要依据.
关键词： 丙型肝炎病毒 DNA疫苗 NS3抗原 小鼠DEC205单链抗体 -
四份中国HCV阳性血清中包膜蛋白E1/E2准种基因的序列分析及新型插入突变的发现
为分析四份中国丙型肝炎病毒(HCV)阳性血清中包膜蛋白E1/E2基因的准种特征.本研究对从4份中国HCV阳性血清(1b亚型:274、366和383；2a亚型:283)中提取的HCV核酸,采用逆转录-聚合酶反应扩增编码全长E1/E2蛋白(191～764aa)的基因片段,随机挑取多个克隆测序.根据E1/E2基因核苷酸的序列与其他相关序列(来自于GenBank)构建亲缘性关系进化树,进行核苷酸与氨基酸同源性分析并对重要的基因位点进行分析.共获得阳性克隆序列43个(274株10个,283株12个,366株13个,383株8个),发现高变区HVR1、HVR2的基因异质性高,而其他抗体中和表位及跨膜区I、Ⅱ及N末端糖基化位点相对保守.并首次发现在HCV 2a亚型(283血清)中多个准种序列存在1 279nt(E1区,313aa)处单碱基插入优势基因突变,导致HCV包膜蛋白编码突变与中断(E2区,398aa).本研究对中国HCV代表株包膜蛋白E1/E2编码基因的准种多样性及一种新型插入突变进行了描述,可为进一步研究HCV免疫逃避与慢性化机制提供重要信息.
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表达丙型肝炎病毒(HCV)截短型NS3与core融合抗原的重组腺病毒疫苗在小鼠中的免疫原性与保护效果分析
为研发安全广谱有效的丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)T细胞疫苗,本研究构建了表达HCV截短型非结构蛋白3 (Nonstructural protein 3,NS3)与核心蛋白(core)融合抗原的重组腺病毒疫苗.体外免疫荧光及蛋白印迹实验表明该融合抗原可有效表达;小鼠免疫结果表明该重组腺病毒疫苗除了激发抗原特异的抗体反应外,还可激发较强的针对NS3抗原特异的T细胞免疫应答.该T细胞免疫应答主要表现为IFN-γ+与TNF-α+ CD4+T细胞亚群.采用异型(JFH1,2a型)HCV重组痘病毒接种小鼠进行保护效果分析,与对照组相比,表达截短型NS3与core融合抗原的重组腺病毒疫苗2针免疫后可产生明显的交叉免疫保护.本研究为进一步研究HCV免疫保护机制及新型疫苗研制提供了参考.
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丙型肝炎病毒NS5A蛋白对Huh7细胞周期的影响
应用PCR技术从含有丙型肝炎病毒(HCV)全长开放阅读框的质粒pBRTM/HCV 1～3 011中获得NS5A全长基因片段,利用基因重组技术将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)中.通过酶切、PCR及测序鉴定证实,NS5A基因已正确插入到pcDNA3.1(-)中.再利用脂质体介导转染Huh7细胞,30h后收获细胞,经Western blot验证,证实HCV的NS5A基因在Huh7细胞中已经获得表达.在培养条件完全一致的条件下,表达NS5A基因的Huh7细胞与pcDNA3.1(-)转染的细胞在转染30h后被收集起来,乙醇固定,PI染色后利用流式细胞仪检测细胞周期变化.G0/G1期由60.6%下降到49.7%,S期由23.9%上升到32.7%,而转染pcDNA3.1(-)细胞的细胞周期与正常的Huh7细胞则差别不大.从而证明HCV NS5A蛋白对Huh7细胞周期具有调节作用.
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嵌合中国河北株包膜蛋白基因的HCV细胞培养模型的传代分析
建立稳定的嵌合中国河北株包膜蛋白基因的丙型肝炎病毒(HCV)细胞培养体系,进行传代特性分析.本研究经体外转录获得嵌合中国河北株包膜蛋白基因的丙型肝炎病毒(HCV)全长RNA,脂质体法转染Huh7.5-CD81细胞,连续传代培养,进行Real Time RT-PCR、间接免疫荧光、Western blot、再感染试验与感染滴度检测及序列分析.结果表明:嵌合重组HCV RNA转染Huh7.5-CD81细胞后可产生感染性的病毒颗粒(HCVcc);传代过程中,Western blot可检测细胞内HCV蛋白的表达;IFA检测阳性细胞数逐渐增多,41d升至高峰,达80％～90％;RealTime RT-PCR检测传代细胞上清中HCV RNA拷贝数在104～107拷贝/mL;再感染实验嵌合HCVcc高感染滴度为104 ffu/mL.序列分析显示在传代后期嵌合的HCV包膜基因发生了适应性突变,导致6处氨基酸改变.结论嵌合中国河北株1b亚型包膜蛋白基因的HCV细胞培养体系可以产生具有感染性的嵌合HCV病毒颗粒,传代后感染性增强并且嵌合的HCV包膜基因发生了适应性突变.
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丙肝病毒非灵长类同源病毒的研究进展
丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)是一种危害人类健康的病原体,感染人体后极易导致慢性肝炎,并能引起肝纤维化或脂肪肝,可能进一步发展成为肝硬化、肝癌等终末期肝病.尽管已被发现20多年,丙肝病毒的来源以及进化途径一直没有确定.与此同时,缺乏合适的动物模型严重阻碍HCV致病机理的研究.从2011年起,随着新型测序技术的应用,多种丙肝非灵长类同源病毒相继被发现,这些研究成果将在研究丙肝病毒来源、进化途径以及相关动物模型建立中起重要作用.
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丙型肝炎病毒感染相关的PRRs应答的分子机制
全球丙型肝炎病毒(HCV)感染者约为一亿七千万人,我国感染阳性率约为3.2%,HCV感染可导致肝炎、肝硬化、肝癌及肝外淋巴增生性疾病(包括巨球血症及B细胞淋巴瘤等).成年HCV感染者超过70%的人发展为慢性持续性感染[1-3].目前常用的抗病毒治疗的有效率不足50%,且费用昂贵[4].由于HCV免疫应答及逃逸机制尚不十分清楚[5],使HCV疫苗的研制也举步维艰,已有的HCV感染给社会造成了严重负担.据预测未来几十年中国因HCV感染而死亡的人数仍将继续增长,因此必须加速研究HCV感染过程及宿主应答的分子机制,发现新的抗病毒治疗的药物靶标,研制有效的HCV疫苗.
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正链RNA病毒起始RNA合成分子机制的研究进展
正链RNA病毒大多是人类和动植物的重要病原体,如脊髓灰质炎病(PV)、口蹄疫病毒(FMDV)、丙型肝炎病毒(HCV)、登革热病毒(DEV)、西尼罗河病毒(WNV)以及严重急性呼吸综合症病毒(SARS)等,都给人类的健康以及动植物的生长带来严重危害,造成巨大的经济损失.
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丙型肝炎病毒入胞抑制剂的研究进展
丙肝感染是全球性的公共卫生问题之一,目前尚无预防丙肝病毒感染的疫苗,联合应用靶向丙肝不同复制阶段的药物,即所谓的“鸡尾酒”疗法可能会有更好的疗效.丙肝病毒进入宿主细胞的过程是药物干预的重要环节,这个过程是由丙肝病毒的包膜蛋白与宿主因子作用介导的,其中病毒的包膜蛋白包括E1、E2,宿主因子包括硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate,HS)、膜蛋白CD81、B族Ⅰ型清道夫受体(Scavenger receptor class B type Ⅰ,SR-BI)、两种紧密连接蛋白Occludin(OCLD)和Claudin(CLDN)、低密度脂蛋白受体(Low densitity lipoprotein receptor,LDLR)、树突细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素分子(Dendritic cell-specific ICAM-3-grab-bing nonintegrin,DC-SIGN)、肝/淋巴细胞特异性细胞间粘附分子3-结合整合素分子(Liver/lymph node specific ICAM-3-grabbing inte-grin,L-SIGN)和转铁蛋白1受体(Transferrin receptor 1,TfR1)等.病毒的包膜蛋白和这些宿主因子都可以作为靶向丙肝入胞抑制剂的作用靶点,许多研究表明丙肝入胞抑制剂作为一种新颖和有发展前景的化合物与作用于复制阶段药物联合应用能够更有效的治疗丙肝.本文综述了自20世纪90年代以来发现的靶点和靶向丙肝病毒进入宿主细胞的化合物.
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脂滴在丙肝病毒生命周期中的作用
脂滴是细胞内中性脂的主要储存细胞器.近许多研究都发现脂滴与丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)有着密切的关系.脂滴对HCV的生命周期发挥着重要作用,影响HCV的感染、复制、组装和分泌一系列生命过程.本文就脂滴在病毒生命周期中的作用的新进展进行综述.
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互补引物/模板评价毕加酵母表达的丙型肝炎病毒RNA依赖的RNA聚合酶
构建含有感染性克隆HCV非结构基因5b区序列的酵母表达质粒,转化毕加酵母,获得持续、可溶性HCV RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)的表达,纯化蛋白在SDS-PAGE及Western blot中显示出特异性的64.2kD HCV RdRp蛋白带,同聚引物/模板测定显示RdRp的活性极低,延长反应时间,RNA聚合活性仅轻度升高.采用合成的杂聚互补引物/模板,未发现核苷酸在毕加酵母表达的RdRp作用下掺入模板,随时间延长,杂聚互补引物/模板降解.
关键词： 丙型肝炎病毒 RNA依赖的RNA聚合酶 互补引物/模板 -
丙型肝炎病毒核心蛋白在昆虫细胞中表达、加工和细胞定位研究
以杆状病毒-昆虫细胞表达系统Bac-to-Bac为模型,就目前存在较多争论的HCV核心蛋白的加工和细胞定位问题进行探讨.根据核心蛋白的亲水性分析结果,设计了三种长度的基因片段(C173、C191和C215),经过PCR扩增、重组转移载体构建、细菌内转座和昆虫细胞转染,获得三种重组病毒(rvBACC173、rvBACC191和rvBACC215)用于表达分析.SDS-PAGE电泳和免疫印迹试验表明,昆虫细胞能够识别核心蛋白第191和192位氨基酸之间的切点并低效率切割;但不能够识别173～191位之间的切点.间接免疫荧光试验表明,截断型核心蛋白C173定位于细胞核内,而C191和C215则停留在细胞浆中.rvBACC173感染的细胞在核内出现单一的"类晶体样结构",电子显微镜分析证实,这种结构是截断型核心蛋白大量转运并沉积在细胞核内形成的蛋白聚合体.试验结果还表明,第173至191之间的疏水性序列负性调节蛋白的表达,并且影响蛋白在细胞内的分布.间接ELISA实验证实,部分纯化的核心蛋白可用作诊断试剂检测人血清中的特异性抗体.
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采用基因芯片检出一例丙型肝炎病毒3b基因亚型的报告
研究表明,感染HCV的严重性与所感染的HCV基因型有一定的关系,并且不同的HCV基因型对干扰素治疗有不同的影响.HCV的基因分型目前缺乏统一的分类和命名方法.Chan等对5′NCR进行基因树分析,将HCV分为1、2、3三个主要的基因型[1],随后通过对C、NS3、NS5区段的分析指出,每种基因型均由两到三种基因亚型组成,并将其命名为1a、1b、2a等[2,3].Simmonds等[4]分离出HCV的基因型4,并发展了Chan的命名方法[5].同时Houghton等[6]将1a和1b分别命名为基因型Ⅰ和Ⅱ;Enomoto等[7]将2a和2b命名为基因型Ⅲ; Cha等[8]将3命名为基因型Ⅳ,并将以前在南非发现的一组HCV命名为基因型V.Okamoto等[9]和Mori等[10]将基因型2分为基因型Ⅲ和Ⅳ,基因型3分为基因型Ⅴ和Ⅵ.为了避免混淆,本文中采用Chan和Simmonds的命名方法.HCV的基因分型方法主要包括基因组或基因组的部分序列测序分析,型特异性引物PCR扩增(type-specific primers PCR)[9],限制性内切酶长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism,RFLP)[4],线性探针法(line probe assay,LiPA)[7,11],以及Livache等[12]和Bidan等[13]采用的吡咯阵列传感器芯片的HCV基因分型方法.
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丙型肝炎病毒NS2-3蛋白酶基因在Sf9昆虫细胞中的表达
丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)为单股正链RNA病毒,其基因组长约9.5kb,5'端和3'端各有一个长约345bp和60bp的非编码区,编码区含一个大开放读码框架,编码3 010aa～3 033aa残基的多蛋白前体.
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从肝炎病毒看病毒与宿主相互作用研究的新进展
病毒病是严重危害人类健康与生命的主要疾病之一.全球丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)慢性感染者达1.7亿,其中20%可能进一步发展为肝硬化和肝细胞癌.目前病毒病的防治措施主要有疫苗接种和药物治疗.但是,人类与病毒斗争历程发展到今天,对于危害严重的主要病毒性疾病仍未研究出有效、价廉、安全的疫苗和药物;而且,不断出现的新病毒病对人类生命健康构成严重威胁.因此,加强病毒学基础研究,特别是病毒与宿主相互作用和病毒感染分子致病机理,以及以此为基础的抗病毒疫苗和药物研究,是当前生物医学研究中的重要方向,对人类重大病毒性传染病防治具有重要理论和实际意义.
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内蒙古呼和浩特地区丙型肝炎病毒基因型分布
为了解内蒙古呼和浩特地区丙型肝炎病毒(HCV)基因型的分布特征,为本地区丙型肝炎的治疗、预防提供基础数据资料.收集呼和浩特地区2014年1月至2015年1月就诊的门诊和住院丙型肝炎患者血清采样标本149份,均为HCV抗体检测阳性且HCVRNA定量检测阳性.QIAGEN柱式病毒RNA提取法提取HCV RNA,反转录成cDNA,巢式PCR法扩增HCVNS5B区,对扩增片段进行测序,在NCBI BLAST上进行序列比对得到相似度大的参考序列并确定基因型,用Megalign,Clustal W进行序列分析并建立同源关系树,分析呼和浩特地区HCV感染基因型的分布特征,以及基因型与宿主性别、年龄的关系.在测序成功的94份样本中,共检出6个基因型,1b型占73.40％(69/94),2a型占19.14％(18/94),3a、3b、6a型各占2.12％(2/94),6u型占1.06％(1/94).性别资料明确的93例样本,男女基因型分布无显著差异(P＞0.05).年龄资料明确的90例HCV样本,1+2型的患病年龄高于3-+-6型的患病年龄有统计学意义(P＜0.05).得出内蒙古呼和浩特地区HCV感染的基因型1b为主,其次为2a型,但也有3型、6型等基因型的传人.HCV的基因型4型和5型未检测到.
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中国HCV3b型包膜蛋白编码基因的克隆分析与假病毒制备
从中国丙型肝炎病毒(HCV) 3b亚型感染者克隆分析包膜蛋白编码基因,并用于HCV 3b亚型假病毒制备.本研究从中国HCV感染血清中筛选克隆到2个3b亚型包膜蛋白编码基因,序列分析后构建表达质粒,以1b(Con1)作为对照,体外转染293T细胞后分析不同包膜蛋白表达水平,并制备了HCV 3b亚型假病毒(HCVpp),比较不同HCVpp感染效率.结果表明:2个3b亚型包膜蛋白编码基因(C27与C30)与国际3b参考株TrKj的进化关系较近.C27与C30核苷酸与氨基酸同源性较高(分别为98.5％与98.2％),包膜蛋白编码区存在10个氨基酸位点差异,且C27包膜蛋白体外表达水平明显高于C30,其中C27可制备出高感染效率的HCV 3b型假病毒,其感染效率明显高于C30与HCV 1型(Con1)制备的HCVpp.本研究分析了2个HCV 3b亚型感染者包膜蛋白编码基因序列及表达特性,并首次获得了高感染效率的HCV 3b亚型假病毒,为HCV研究及疫苗与药物研发提供了有效工具.
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酵母双杂合系统在丙型肝炎病毒NS5A研究中的应用
酵母双杂合系统是在酵母细胞中研究蛋白-蛋白相互作用的新技术.应用该技术,以丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)为"诱饵",筛检了人肝癌细胞HepG2来源的cDNA文库,获得了7个NS5A结合蛋白的基因克隆.报道了其中两个粜钥寺?#2、#16)的结果,并对"人核小体组装蛋白相关蛋白"(Human nucleosome assembly protein-related protein,hNRP)和"载脂蛋白A-I"(Apolipoprotein A-I)与NS5A结合的生物学意义进行了讨论.
关键词： 酵母双杂合系统 丙型肝炎病毒 人核小体组装蛋白相关蛋白 载脂蛋白A-I -
丙型肝炎病毒相关混合型冷球蛋白血症的炎症因子浓度分析
目的 探讨丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)相关混合型冷球蛋白血症(mixed cryoglobulinemia,MC)患者的外周血炎症相关因子的表达情况.方法 30例患者经过年龄、性别、HCV抗体检测结果、冷球蛋白定性结果匹配后,纳入本研究.分别归入MC和HCV双阳性组(MC+HCV+)、MC和HCV双阴性组(MC-HCV-)、MC阳性HCV阴性组(MC-HCV+)、MC阴性HCV阳性组(MC-HCV+).采用魏氏沉降法、毛细管电泳分型进行冷球蛋白定性、定量、分型分析,Meso Scale Discovery(MSD)超敏电化学发光多细胞因子检测试剂盒检测人白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2),CXC趋化因子10(C-X-C motif chemokine 10,CXCL10),CXC趋化因子12(C-X-C motif chemokine 12,CXCL12),胸腺基质淋巴细胞生成素(thymicstromallymphopoietin,TSLP).IBMSPSS22.0软件进行数据分析.结果 MC+组IL-2,CXCL12,TSLP浓度高于MC-组(P<0.05),HCV-MC+亚组CXCL12,TSLP浓度高于HCV-MC-亚组(P<0.05).其他亚组内细胞因子浓度差异不具有统计学意义.结论 本研究发现CXCL12,TSLP与MC有一定的关联,而与HCV感染没有相关性.这些发现为进一步深入研究HCV相关MC的发生机制提供了初步的研究基础.
