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MTBDRplus V2用于诊断涂阴疑似肺结核患者的效果评价
目的 评价MTBDRplus V2线性探针技术(简称“MTBDRplus V2”)用于诊断涂阴疑似肺结核患者的检测效能.方法 连续纳入2014年1-12月在安徽省胸科医院和西安市胸科医院就诊的涂阴疑似肺结核患者1973例,对其1973份痰标本同时开展MTBDRplus V2和MGIT 960快速液体培养(mycobacterial detection system,BACTECTM MGITTM 960,简称“MGIT 960培养法”),对培养阳性鉴定为结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)的菌株,开展利福平和异烟肼药物敏感性试验(简称“药敏试验”),对两种方法耐药检测结果不一致样本进行耐药相关基因测序验证.采用SPSS 22.0软件进行统计学分析,两种方法对MTBC检出率的比较使用x2检验,以P＜0.05为差异有统计学意义.对利福平和异烟肼耐药基因检测的效能比较分析用敏感度、特异度进行效果评估.结果 1973例涂阴疑似肺结核患者中,MTBDRplus V2和MGIT960培养法对MTBC 的检出率分别为27.67％(546/1973)和26.76％(528/1973),差异无统计学意义(x2=0.05,P=0.974).以MGIT 960培养法为标准,MTBDRplus V2检测痰标本中MTBC的敏感度和特异度分别为86.74％(458/528)和93.84％(1356/1445).以MGIT 960药敏试验检测利福平和异烟肼耐药结果为标准,MTBDRplus V2检测利福平和异烟肼耐药性的敏感度分别为94.34％(50/53)和77.38％(65/84),特异度为96.62％(372/385)和98.02％(347/354).结论 MTBDRplus V2可快速准确检测出涂阴疑似肺结核患者痰标本中的MTBC,并可同时检测利福平和异烟肼对MTBC的药物敏感性,其检测结果敏感度和特异度高,对于结核病防控有很好的应用价值.
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单耐利福平结核分枝杆菌耐药分子机制研究
目的 探讨单耐利福平结核分枝杆菌中耐药相关基因突变以及药物外排泵两种不同耐药机制的功能.方法 从国家结核病参比实验室2007-2008年全国耐药基线调查菌株库中挑选单耐利福平的菌株23株.采用直接测序法检测利福平耐药相关基因rpoB突变情况.提取rpoB无突变菌株的RNA后反转录并采用real-time PCR方法检测20个药物外排泵基因的表达量,对比菌株低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)实验结果,筛选可能与利福平药物外排相关的基因,并选用大肠埃希菌为模式生物,构建表达载体,检测过表达目的外排泵的大肠埃希菌对利福平的耐药程度以验证.结果 在23株单耐利福平的菌株中,有16株(69.6％)检测到rpoB突变,其中包括531位点突变9株,526位点突变6株及533位点突变1株.Ser531Leu、His526Asp表现为高浓度耐药,其MIC分别为192 μg/ml和256 μg/ml；而突变类型His526Gly、His526Leu、His526Arg和Leu533Pro表现为低浓度耐药,其MIC分别为0.75 μg/ml,4 μg/ml、2 μg/ml和0.5μg/ml.在rpoB未突变菌株中,通过real-time PCR发现Rv2936、Rv0783和Rv0933的转录水平与MIC呈正相关.在对照组和转入pEASY-E1- Rv0933的大肠埃希菌中MIC均为8μg/ml,而转入pEASY- E1- Rv2936和pEASY-E1- Rv0783的大肠埃希菌的MIC均有不同程度的提高,分别为32 μg/ml和16μg/ml.结论 不同耐药突变类型导致的耐药程度不同,Rv2936和Rv0783可能是与利福平耐药相关的的药物外排泵基因.
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RNA恒温扩增实时荧光检测技术对结核性胸腔积液的诊断价值
目的 探讨RNA恒温扩增实时荧光检测技术(simultaneous amplification and testing,SAT-TB)对结核性胸腔积液的诊断价值.方法 选取2014年6月至2016年6月聊城市传染病医院收治的有胸腔积液的患者210例作为研究对象,其中143例临床诊断为结核性胸膜炎,作为结核性胸膜炎组;其余67例患者作为对照组.应用涂片法、改良罗氏培养法、SAT-TB法检测研究对象胸腔积液标本,比较各检测方法的检测效能.结果 SAT TB检测的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为36.36％(52/143)、98.51％(66/67)、98.11(52/53)、42.04％(66/157).SAT-TB检测的敏感度明显高于涂片法[3.50％(5/143)]及罗氏培养法[20.28％(29/143)],差异均有统计学意义(x2=19.08,P=0.021;x2=9.12,P＜0.01).SAT-TB法检测完成时间为1～2 h,罗氏培养法完成时间为6～8周.结论 SAT-TB法能快速检测胸腔积液中的结核分枝杆菌,敏感度高于涂片法和罗氏培养法.
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IFNA8基因单核苷酸多态性与我国汉族人群结核分枝杆菌易感性的关联分析
目的 探讨我国汉族人群IFNA8基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)与结核分枝杆菌易感性的关系.方法 收集2010年1月至2011年12月期间深圳市第三人民医院收治的结核病患者资料,采用病例对照研究方法,应用MassARRAY飞行时间质谱生物芯片技术,分成检测结核病组(1533例)和对照组(1445名)IFNA8基因SNPs(rs1330322、rs10964982、rs4978116)的基因型,计算各SNP位点等位基因频率(allele frequency,AF),应用“四格表”x2检验比较两组人群中候选SNP位点等位基因频率的差别,以P＜0.05为差异有统计学意义,并计算相应的比值比(odds ratio,OR)和95％置信区间(95％CI).结果 (1)rs1330322位点A等位基因频率在结核病组、对照组中分别为30.5％(936/3066)、27.8％(804/2890),差异有统计学意义(x2=5.277,OR=1.140,95％CI=1.019～1.275,P=0.022).rs10964982和rs4978116位点的次要等位基因频率在结核病组中分别为17.0％(520/3066)和28.8％(882/3066),在对照组中分别为17.0％(491/2890)和28.6％(826/2890),两组间差异无统计学意义(x2值分别为0.001、0.025,P值分别为0.976、0.874).(2)根据性别分层发现,结核病组女性患者中,rs1330322位点等位基因A频率为30.8％(330/1072),对照组等位基因A频率为26.6％(300/1126),两组间差异有统计学意义(x2=4.605,OR=1.225,95％CI=1.018～1.474,P=0.032).男性结核病组、对照组患者等位基因A频率分别为30.4％(606/1994)、28.6％(504/1764),两组间差异无统计学意义(x2=1.489,OR=1.091,95％CI=0.948～1.256,P=0.222).(3)对女性患者进一步进行年龄分层发现,对于rs1330322位点,≤25岁结核病组、对照组A等位基因频率分别为33.8％(111/328)、25.2％(112/444),两组间差异有统计学意义(x2=6.818,OR=1.516,95％CI=1.108～2.074,P=0.009).而＞25岁人群A等位基因在两组人群中差异无统计学意义(x2=0.610,OR=1.096,95％CI=0.871～1.380,P=0.435).结论 SNP位点rs1330322与结核分枝杆菌易感性密切相关,rs1330322位点基因型在女性、年龄≤25岁组人群具有更高的结核病患病风险预测价值.
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结核分枝杆菌Rpf-DNA疫苗对Mtb感染小鼠免疫保护作用的研究
目的 评价Mtb复苏因子DNA疫苗(resuscitation-promoting factor DNA,Rpf-DNA)对Mtb感染宿主的免疫保护作用.方法 构建复苏因子D(Rpf D-DNA)和复苏因子E(Rpf E-DNA)质粒疫苗,180只BALB/c 小鼠(4周龄)分为6组,每组30只,分别用空质粒、Rpf D-DNA质粒、Rpf E-DNA质粒、BCG、生理盐水免疫,H37Rv标准株气溶胶感染.检测血清复苏因子(Rpf)抗体、IFN-γ; RpfD、E刺激淋巴细胞后进行淋巴细胞增殖、细胞杀伤实验；检测细胞上清IFN-γ、IL-12、IL-2;对肺组织进行病理学检测和细菌负荷(CFU)计数.结果 (1)疫苗免疫组血清Rpf D、Rpf E抗体水平；Rpf D组0.32±0.1,Rpf E组0.39±0.1,BCG组0.02±0.01,空质粒组0.01±0.0,生理盐水组0.09±0.04,空白对照组0.03±0.01,RpfD组与RpfE组抗体水平与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有显著统计学意义,F值分别为Rpf D:45.6,43.2,45.1,45.7；Rpf E:51.6,53.6,51.0,52.2;P值均＜0.01.血清IFN-γ:Rpf D组(43.9±24.8)pg/ml,Rpf E组(45.9±21.0)pg/ml,BCG组(21.0±11.0)pg/ml,空质粒组(7.9±4.9) pg/ml,生理盐水组(4.7±2.1) pg/ml,空白对照组(5.8±4.7)pg/ml,RpfD、RpfE质粒组与BCG组比较差异有统计学意义(F值分别为Rpf D:10.2；Rpf E:12.4;P值均＜0.05),与空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有显著统计学意义,F值分别为Rpf D:15.6,17.8,17.3;Rpf E:17.5,21.1,20.7;P值均＜0.01.(2)淋巴细胞增殖实验CCK-8:Rpf D组176.0±4.2,Rpf E组183.0±4.3,BCG组101.0±1.1,空质粒组100.0±6.8,生理盐水组104.0±8.4,空白对照组116.0±2.2,RpfD、RpfE质粒组与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有统计学意义,F值分别为Rpf D:9.5,10.1,10.0,9.0;Rpf E:11.2,12.9,11.7,10.3;P值均＜0.05.细胞杀伤实验:Rpf D组32.0±3.2,Rpf E组30.0±4.2,BCG组16.0±5.9,空质粒组3.3±1.5,生理盐水组6.7±0.5,空白对照组7.3±3.5,Rpf D、Rpf E质粒组与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有统计学意义,F值分别为Rpf D:8.8,14.5,13.7,11.9;Rpf E:8.1,12.5,11.6,11.1;P值均＜0.05.(3) Rpf D、Rpf E蛋白各自刺激淋巴细胞后上清细胞因子检测:IL-2:Rpf D组9.5±2.4,RpfE组9.2±1.2,BCG组2.4±2.1,空质粒组1.2±0.3,生理盐水组1.8±1.0,空白对照组1.5±0.7,Rpf D、Rpf E质粒组与其他各组比较差异有统计学意义,F值分别为Rpf D:12.5,14.6,13.5,13.9；Rpf E:12.0,13.6,13.1,13.2;P值均＜0.05.IFN-γ:Rpf D组22.2±5.7,Rpf E组28.7± 14.4,BCG组16.1±10.1,空质粒组9.8±1.6,生理盐水组13.2±2.1,空白对照组15.7±2.9,RpffD、RpfE质粒组与其他各组比较差异有统计学意义,F值分别为Rpf D:7.8,12.6,8.7,8.3;Rpf E:11.3,16.4,14.7,14.2;P值均＜0.05.结论 实验表明复苏因子疫苗能诱导Mtb感染小鼠产生体液免疫和细胞免疫,有希望成为结核病候选疫苗之一.
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结核分枝杆菌rpoB基因突变特征的初步探讨
目的 了解浙江省耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变特征.方法 对65株临床分离菌株rpoB基因509-631位点分别进行PCR-SSCP检测和DNA序列测定,观察不同耐药株rpoB基因突变的规律.结果 耐利福平分离株96.4%(27/28)存在rpoB基因突变,其中526位突变率64.3%(18/28),513位突变率21.4%(6/28),531位突变率7.1%(2/28),529位突变率3.6%(1/28);耐其他抗结核药18.5%(5/27)存在rpoB基因突变,突变位点具有随机性.所有敏感菌株均无突变.结论 rpoB基因突变与利福平耐药密切相关,浙江省rpoB基因突变主要以526位突变为主,其次为513位,两者占总数的86%(24/28),而耐其他抗结核药菌株也存在rpoB基因的突变,但没有明显规律,且均对利福平敏感.
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河南省濮阳市1119株结核分枝杆菌耐药情况分析
目的 了解河南省濮阳市涂阳肺结核耐药结核病的流行现状和特点,为今后结核病防治工作提供参考依据.方法 收集2010年3月1日至2013年2月28日全市结核病防治机构发现的1291例涂阳肺结核患者的痰标本,进行分枝杆菌培养,用比例法进行6种抗结核药物(H、R、E、S、Ofx、Km)敏感性试验.经培养阳性、菌型鉴定为结核分枝杆菌且药敏试验成功的1119例为研究对象,其中,初治患者1017例,复治患者102例,并对1119株结核分枝杆菌的药敏试验结果进行分析.计数资料组间比较采用x2检验,P＜0.05为差异有统计学意义.结果 1119株结核分枝杆菌对6种抗结核药物的总耐药率、单耐药率、多耐药率、耐多药率分别为37.2％(416/1119)、24.3％(272/1119)、8.2％(92/1119)、4.5％(50/1119).在总耐药方面,其中初治患者耐药率35.1％(357/1017),复治患者耐药率57.8％(59/102);复治患者耐药率明显高于初治患者,两者间差异有统计学意义(x2 =20.525,P＜o.05).对6种抗结核药物的耐药率由高到低的顺序是:H(19.9％,223/1119)、S(19.5％,218/1119)、R(10.8％,121/1119)、Ofx(3.7％,14/1119)、E(3.6％,40/1119)、Km(1.4％,16/1119).初治患者单耐药率为24.3％(247/1017),复治患者单耐药率为24.5％(25/102),两者之间差异无统计学意义(x2=0.002,P＞0.05).初治患者多耐药率为7.9％(80/1017),复治患者多耐药率为11.8％(12/102),两者间差异无统计学意义(x2=1.867,P＞0.05).初治患者耐多药率为2.9％(30/1017);复治患者耐多药率为19.6％(20/102);两者间差异具有统计学意义(x2=56.423,P=0.000).结论 濮阳市1119例涂阳肺结核患者的耐药结果,反映了本地区耐药结核病的实际水平,为今后结核病防治、特别是耐药结核病防治,及时采取干预措施、更有效地控制疫情奠定了基础.
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沿海地区11例手部分枝杆菌感染分析
目的探讨沿海地区手部非结核分枝杆菌感染的体外培养技术和要领,为临床确诊,治疗提供直接证据.方法对2001年6月-2004年9月收治的28例可疑手部分枝杆菌感染作组织块匀浆后的涂片抗酸染色,分枝杆菌培养,分枝杆菌生化分型,分枝杆菌的核酸测序分型.结果分枝杆菌培养阳性11例,具体为海分枝杆菌占8例,偶发1例,鸟1例,结核1例,其中直接抗酸染色检查阳性2例.结论手部慢性可疑分枝杆菌感染患者应同时做抗酸染色及分枝杆菌培养.非结核分枝杆菌感染尤其是海分枝杆菌远比结核分枝杆菌常见,是沿海地区手部非典型感染的主要致病因素.在分枝杆菌培养时必须同时在30℃、35℃两种温度下进行培养.
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重庆地区耐多药结核分枝杆菌对氟喹诺酮类药物耐药的相关基因特征分析
目的 分析重庆地区耐多药结核分枝杆菌对氟喹诺酮类(FQs)药物耐药的相关基因特征,以及与结核分枝杆菌基因型的相关性.方法 收集2015年1月至2017年6月重庆市39个区(县)967例耐多药结核病(MDR-TB)可疑患者的所有耐多药(MDR)结核分枝杆菌临床分离株229株,通过微孔板Alamar blue显色法检测4种FQs药物[氧氟沙星(Ofx)、左氧氟沙星(Lfx)、莫西沙星(Mfx)、加替沙星(Gfx)]的耐药性,用PCR测序方法对FQs药物耐药相关基因gyrA、gyrB进行分析,并采用实时荧光定量熔解曲线方法进行北京基因型鉴定.结果 在229株MDR菌株中,94株(41.0％,94/229)对任一FQs药物耐药.其中,Ofx耐药率高(41.0％,94/229);Lfx、Mfx耐药率居中,分别为31.4％(72/229)、30.6％(70/229);Gfx耐药率低(20.1％,46/229).94株对FQs耐药菌株中,81株(86.2％,81/94)发生gyrA基因突变,第94位密码子突变常见(60.6％,57/94);10株(10.6％,10/94)发生gyrB基因突变.7株gyrA基因双位点突变均显示为高水平耐药;9株gyrA与gyrB联合突变中,2株为高水平耐药.重庆地区对FQs耐药菌株中北京基因型80株(85.1％,80/94),其中,现代北京基因型占60.0％(48/80).结论 重庆地区MDR结核分枝杆菌对FQs耐药的菌株以现代北京基因型为主,其耐药相关基因突变主要发生于gyrA基因.
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结核分枝杆菌rpsL和rrs基因突变与氨基糖苷类和多肽类抗结核药物耐药的关系
目的 测定结核分枝杆菌(MTB)临床分离株对链霉素(Sm)、卡那霉素(Km)、阿米卡星(Am)、卷曲霉素(Cm)的敏感性,了解其耐药程度和交叉耐药水平,并进一步探讨耐药及交叉耐药与MTB的rrs和rpsL基因突变的关系.方法 采用微量平板Alamar Blue检测(MABA)法,检测64株选自北京胸科医院的MTB临床分离菌株的Sm、Km、Am和Cm的小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)值;并且对这些菌株rrs和rpsL基因进行序列测定.结果 64株MTB临床分离株中,52株对Sm耐药,其中有42株(80.8％)发生rpsL基因突变,包括32株(76.2％)为128A→G(Lys43Arg),其MIC值均≥128μg/ml;9株(21.4％)263A→G(Lys88Arg),1株(2.4％)263A→T(Lys88Met),MIC值介于4～64μg/ml.9株菌rrs基因514A→C突变,其中,8株MIC值介于4～8 μg/ml,1株MIC值为2μg/ml.在2株Sm耐药株(MIC值是4μg/ml)中没有发现rpsL基因、rrs基因530区及rrs基因1400区突变.18株菌检测到rrs基因1401A→G突变,均对Km和Am高度耐药.其中,15株为rrs基因1401A→G单突变,3株合并rrs基因其他位点突变.18株菌对Sm、Km、Am均耐药,且对Km和Am均高度耐药.18株rrs基因1401A→G突变菌株中,13株菌对Km、Am、Cm均耐药,且均为Km、Am高度耐药耐合并Cm低度耐药;5株菌对Cm敏感(MIC值均为2.5 μg/ml).64株菌株均有rpsL基因363A→G突变,相应的密码子为121位AAA→AAG突变,其编码的氨基酸均为赖氨酸(Lys).结论 MTB的rpsL基因Lys43Arg、Lys88Arg/Met突变分别可能与Sm高度和中度耐药相关;rrs基因514A→C突变可能与Sm低度耐药相关.rrs基因1401A→G联合514A→C突变,或联合rpsL基因突变可能与Sm、Km、Am均耐药相关.rrs基因1401A→G是Km高度耐药及交叉耐药的分子基础,也可能是Km和Am与Cm部分交叉耐药的分子基础.
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38例骨关节结核患者病灶标本分枝杆菌培养及药物敏感性试验结果分析
目的 对骨关节结核病灶脓液与肉芽组织分枝杆菌的培养阳性率及药物敏感性试验(简称“药敏试验”)结果进行分析.方法 选择2008年10月至2009年10月在首都医科大学附属北京胸科医院骨科住院并进行手术治疗的骨关节结核患者38例,术中同时采集病灶部位脓液及肉芽组织,采用改良罗氏培养基进行分枝杆菌培养,对培养阳性菌株进行12种抗结核药物(异烟肼、利福平、利福喷丁、乙胺丁醇、链霉素、卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素、氧氟沙星、左氧氟沙星、对氨基水杨酸、丙硫异烟胺)的药敏试验,并分析培养阳性率与患者病程、疗程的关系.结果 38例患者肉芽组织培养阳性率为36.8％ (14/38),高于脓液培养(21.1％,8/38),差异有统计学意义(Fisher确切概率法,P＜0.001);对14例患者肉芽组织培养阳性的菌株进行12种抗结核药物的药敏试验显示:全敏感4例,占28.6％(4/14);单耐药3例,占21.4％(3/14);多耐药5例,占35.7％(5/14);耐多药1例,占7.1％(1/14);广泛耐药1例,占7.1％(1/14).病程＜12个月与病程＞12个月的患者,脓液分枝杆菌培养阳性率分别为26.9％(7/26)、8.3％(1/12),差异无统计学意义(Fisher确切概率法,P=0.393);肉芽组织分枝杆菌培养阳性率分别为46.2％(12/26)、16.7％(2/12),差异无统计学意义(Fisher确切概率法,P=0.147).术前化疗疗程＜2个月的患者脓液分枝杆菌培养阳性率(38.9％,7/18)高于疗程＞2个月的患者(5.0％,1/20),差异有统计学意义(Fisher确切概率法,P=0.016);术前化疗疗程＜2个月的患者肉芽组织分枝杆菌培养阳性率(61.1％,11/18)高于疗程＞2个月的患者(15.0％,3/20),差异有统计学意义(Fisher确切概率法,P=0.006).结论 骨关节结核患者病灶标本分枝杆菌耐药率较高,术中应尽量采集肉芽组织进行分枝杆菌罗氏培养,以提高培养阳性率;术前化疗时间＜2个月能提高分枝杆菌培养阳性率.
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应用基因芯片方法检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼的耐药性
目的 应用基因芯片方法检测结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)对利福平和异烟肼的耐受性,评价其临床应用价值.方法 应用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增一基因芯片杂交的方法检测经常规药敏实验证实的30株Mtb利福平和异烟肼敏感株和5.株耐利福平和异烟肼分离株的堆rB基因及katG和inhA基因突变,同时以PCR-直接测序法为对照.结果 应用PCR-基因芯片与基因测序方法检测30株Mtb利福平敏感株咖B基因和异烟肼敏感株katG基因和inhA基因均为野生型.50株Mtb利福平耐药株中,PCR-基因芯片与基因测序分析3株rpoB基因均为野生型,41株均为突变型;6株PCR-基因芯片与基因测序结果不一致.50株Mtb异烟肼耐药株中,PCR-基因芯片与基因测序分析16株katG基因和30株inhA基因均为野生型,31株katG基因均为315位密码子突变,7株inhA基因均为-15位突变型,其中2株为katG和inhA双重突变,3株katG和13株inhA PCR-基因芯片与基因测序结果不一致.结论 应用PCR-基因芯片方法可快速、有效地检出大多数Mtb耐多药分离株,指导临床用药.
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结核分枝杆菌三种蛋白在结核病血清学诊断中的评价研究
目的 对结核分枝杆菌相对分子质量为38 000(以下采用38 kD表示)、线粒体通透性转换蛋白64 (mitochondrial permeability transition 64,MPT-64)和肝素结合血凝素(heparin-binding haemagglutinin,HBHA)蛋白在外周血中抗体的表达水平进行检测和比较,并对它们在结核病血清学方面的诊断价值进行评估.方法 选取2012年7月至2013年10月北京胸科医院收治的肺结核患者作为活动性肺结核(ATB)组,共78例;选取同期36例潜伏结核感染(LTBI)患者作为LTBI组;同期在北京胸科医院进行体检的31名健康人群(HC)作为HC组.将本实验室前期纯化的38 kD、MPT64和HBHA作为抗原应用于免疫学的检测,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清中三种蛋白抗体的表达水平,经过统计学处理后,分别比较ATB、LTBI和HC三组之间的差异,并结合受试者工作特征曲线计算各蛋白抗原的敏感度和特异度,评价三种蛋白血清抗体的临床诊断价值.结果 ELISA检测ATB组38 kD蛋白抗体的吸光度(A)450 nm处的A值(0.343±0.120)高于LTBI组(0.221±0.102)和HC组(0.143±0.097),差异有统计学意义(t=3.07, P<0.05);MPT64抗体的A450值(0.234±0.102)高于LTBI组(0.198±0.087)和HC组(0.123±0.075),差异有统计学意义(t=3.79, P<0.05);HBHA抗体的A450值(0.263±0.113)高于LTBI组(0.188±0.091)和HC组(0.148±0.078),差异有统计学意义(t=2.70, P<0.05).以38 kD、MPT64和HBHA蛋白抗体表达水平从LTBI组鉴别ATB组时的受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)分别为0.78、0.61和0.62,敏感度分别为71.79%、62.82%和52.56%,特异度为72.22%、58.33%和69.44%;从HC组鉴别ATB组时的AUC分别为0.91、0.81和0.79,敏感度分别为87.17%、69.23%和73.08%,特异度为80.65%、74.19%和74.19%;从HC组鉴别LTBI组AUC分别为0.63、0.75和0.69,敏感度分别为58.33%、77.78%和63.89%,特异度为64.52%、51.61%和74.19%.结论 MTB 38 kD、MPT64和HBHA蛋白都有较好的免疫反应性,3种蛋白抗体在不同患者人群血清中的表达水平有差异,对肺结核诊断价值的评估结果表明采用ELISA对外周血中MTB蛋白抗体进行检测可作为结核病临床检测诊断的辅助方法.
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荧光染色发光二极管显微镜检测结核分枝杆菌的效果分析
目的 探讨荧光染色发光二极管(LED)显微镜镜检对结核分枝杆菌的检出效果.方法 收集232例可疑结核病患者的痰标本,每位患者收集3份痰(即时痰、清晨痰和夜间痰),共696份痰标本.分为萋-尼染色(Z-N)法镜检组(简称Z-N组),荧光染色发光二极管显微镜镜检组(简称LED组).对每份痰标本同时采用上述两种镜检法进行检测.比较两者的检查结果,分析两种方法检查结核分枝杆菌的阳性率差异情况.结果 LED组检出率为37.9%(88/232),Z-N组检出率为26.7%(62/232),经检验,x2=6.66,P＜0.01,差异有统计学意义.结论 LED显微镜镜检具有阳性检出率高等优点.
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结核分枝杆菌休眠相关抗原Rv1733c DNA疫苗的构建及免疫学特性研究
目的 构建结核分枝杆菌(Mtb)休眠相关抗原Rv1733c的真核表达载体,并评价其作为DNA疫苗的免疫学特性.方法 利用限制性酶切的方法从本室前期保存的pMD-18T-Rv1733c质粒中构建Rv1733c的真核表达载体pcDNA-Rv1733c.将pcDNA-Rv1733c重组质粒稳定转染P815细胞,并用间接免疫荧光法检测Rv1733c的表达.采用数字表法随机将BALB/c小鼠分为3组,每组10只,即pcDNA-Rv1733c质粒DNA组、生理盐水组和BCG组.pcDNA-Rv1733c质粒DNA组和生理盐水组采用肌内注射方式免疫,间隔2周免疫1次,共免疫3次.BCG组采用皮下免疫一次.各组小鼠每2周采血,ELISA检测血清中特异性抗体水平和IgG2a/IgG1抗体亚类比率与比值.初次免疫8周后,MTS[3-(4,5-diethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2 H-etrazolium,inner salt](四氮唑蓝盐化合物)法检测小鼠脾淋巴细胞特异性增殖、ELISPOT检测脾淋巴细胞分泌IFN-γ的水平.流式细胞法检测脾淋巴细胞中CD4+和CD8+T细胞所占比率；LDH法检测CTL(cytotoxic T lymphocytes;细胞毒性T淋巴细胞)活性.结果 成功构建Rv1733c的真核表达载体pcDNA-Rv1733c.间接免疫荧光实验表明pcDNA-Rv1733c质粒稳定转染的P815细胞中能够稳定表达Rv1733c蛋白.pcDNA-Rv1733c质粒DNA免疫小鼠后能诱导小鼠产生特异性抗体,抗体亚类以IgG2a为主,随着免疫时间的延长,IgG2a/IgG1的比值趋于平衡；脾淋巴细胞增殖指数(2.00±0.36)高于BCG组(1.1±0.06)(t=3.096,P＜0.05)；特异性分泌IFN-γ的脾淋巴细胞频数(41.48±5.30)SFC/ 106高于生理盐水组(2.75±1.37)SFC/106(t=4.752,P＜0.05)；然而脾淋巴细胞中CD4+、CD8+T细胞所占比率[分别为(18.15±2.30)％、(7.68±1.34)％]、CTL杀伤活性[(29.52±1.96)％]都与生理盐水组相当[(16.43±2.02)％ (t=0.571,P＞0.05)、(7.32±0.42)％(t=0.234,P＞0.05)、(25.28±2.51)％(t=0.726,P＞0.05)].结论 成功构建Rv1733c真核表达载体pcDNA-Rv1733c;并能够诱导小鼠机体产生特异性的体液和细胞免疫应答,提示用于结核病新型疫苗的研究具有一定的意义.
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某高级中学结核病爆发分离菌株的实验室鉴定
目的 鉴定从某中学结核病爆发分离菌株的种属.方法 2006年5-8月辽宁省某高级中学部分学生出现活动性结核病的临床表现,从10例涂片阳性患者的痰标本中分离得到3份菌株经表型鉴定方法,传统生化方法,扩增hupB基因、dnaA-dnaN和NTF-1区;Spoligotyping以及MIRU基因分型;16S rRNA基因、16S-23S ITS和hsp65基因测序以及hsp65基因限制性酶切分析进行鉴定.结果 临床分离株经生化方法初步鉴定1株为结核分枝杆菌复合群和2株为非结核分枝杆菌,随后经表型鉴定和扩增hupB基因、dnaA-dnaN和NTF-1区;Spoligotyping以及MIRU基因分型,说明属于结核分枝杆菌复合群的菌株为结核分枝杆菌北京基因型现代株,MIRU基因型为223325173533.经16S rRNA基因、16S-23S ITS和hsp65基因测序以及hsp65基因限制性酶切分析说明属于非结核分枝杆菌的菌株为猪分枝杆菌.结论 从结核病爆发累及病人的标本中分离出结核分枝杆菌北京基因型现代株和猪分枝杆菌,猪分枝杆菌在暴发流行中的意义尚需进一步研究.
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新型抗结核多肽N22肽衍生物的稳定性和体外抑菌活性研究
目的 研究多肽N22肽衍生物的稳定性以及体外抑菌活性,证实这种新型抗结核多肽的抑菌作用并且为进一步的药代动力学研究提供参考依据.方法 通过高效液相色谱分析N22肽衍生物和异烟肼在37℃培养基中(PH7.2)0～6 d的含量变化.采用试管二倍稀释法以及AlamarBlue法考察N22肽衍生物的体外抑菌活性.结果 HPLC的实验结果表明N22肽衍生物稳定性较异烟肼差.体外抑菌实验证实N22肽衍生物对结核分枝杆菌有明显的抑制作用,低抑菌浓度(MIC)为50μg/ml,小于异烟肼的低抑菌浓度.同时该多肽对大肠杆菌也有抑制作用,其MIC为130μg/ml,结论 N22肽衍生物在热、酸碱条件下不稳定、易降解,与对照药物异烟肼相比,N22肽衍生物体外抑菌效果较好、MIC较低,而且该多肽不仅对结核分枝杆菌有抑制作用,对大肠杆菌同样具有抑制作用.
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95例结核性脑膜炎患者脑脊液分枝杆菌药敏试验和外周血CD4+ T淋巴细胞计数结果分析
目的 回顾性分析结核性脑膜炎(tuberculous meningitis,TBM)患者脑脊液分枝杆菌药敏试验与菌株鉴定结果,以及患者治疗初期外周血CD4+T淋巴细胞计数结果,期望为TBM临床早期有效治疗提供数据参考.方法 搜集重庆市公共卫生医疗救治中心结核性脑膜炎科2011年1月3日至2013年11月27日期间95例有脑脊液培养分枝杆菌药敏试验记录的TBM患者的临床资料,其中男52例,女43例;初治患者73例,复治患者21例(不含非结核分枝杆菌的患者1例);16例患者临床血液检测HIV抗体为阳性,统计脑脊液药敏试验(包括链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇、氧氟沙星、阿米卡星、卷曲霉素、丙硫异烟胺、力克菲蒺、利福喷丁、对氨基水杨酸钠共11种药物)和菌株鉴定的结果,以及治疗初期外周血CD4+T淋巴细胞计数值,分析耐药特征,及影响耐药和CD4+T淋巴细胞计数值的相关因素,采用卡方检验,以P＜0.05为差异具有统计学意义.结果 (1)脑脊液药敏试验与菌株鉴定结果:非结核分枝杆菌1例,占1.1％(1/95),且对11种抗结核药物均耐药;结核分枝杆菌复合群94例,占98.9％(94/95),其中40例对11种抗结核药物有不同程度的耐药,总耐药率为42.6％(40/94),其余54例均敏感.MDRTB占12.8％ (12/94);XDR-TB占1.1％(1/94).(2)耐药类型:单耐药者占9.6％(9/94);耐2种药物者占16.0％(15/94);耐3种药物者占2.1％(2/94);耐3种以上药物者占14.9％(14/94).(3)耐药顺位前6位排名:Sm[26.6％ (25/94)]＞INH[23.4％ (22/94)]＞RFP[18.1％ (17/94)]＞PAIN[16.0％ (15/94)]＞EMB与Rft[均为14.9％(14/94)].(4)11例TBM患者外周血CD4+T淋巴细胞计数在正常参考范围内,占11.7％(11/94);不同性别[男性90.2％(46/51)、女性86.0％(37/43)]、初治患者[90.4％(66/73)]或复治患者[81.0％(17/21)]对计数结果差异无统计学意义(x2值分别为7.76、7.44,P值均＞0.05);合并HIV抗体阳性的患者计数结果[100.0％(16/16)]显著低于HIV抗体阴性[85.9％(67/78)]的患者,差异有显著统计学意义(x2=34.21,P＜0.01).结论 94例TBM(不含非结核分枝杆菌感染的1例患者)初治与复治患者均呈高耐药趋势;外周血CD4+T淋巴细胞计数结果普遍偏低,特别是TBM合并HIV抗体阳性的患者.
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Mtb耐异烟肼基因变异株的体外小抑菌浓度研究
目的 研究Mtb耐INH临床分离株katG基因、inhA基因、ahpC基因突变对其体外小抑菌浓度(MIC)的影响.方法 对临床分离的耐INH的160株Mtb及对INH敏感的40株Mtb进行耐药基因芯片检测;并对所有标本进行INH MIC测定,比较不同变异株的MIC结果,其数据采用t检验进行比较,以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 Mtb耐INH株katG315基因变异占68.8％(110/160),katG315基因变异株的MIC为(20.20±19.46 μg/ml),高于inhA变异株(0.73±0.82 μg/ml)(t'=10.9171,t1α=1.9807,P＜0.05)；低于katG315+inhA变异株(69.33±32.45 μg/ml),(t'=7.164,t1α=2.0627,P＜0.05).结论 Mtb耐INH基因有不同的突变模式,各模式存在不同的耐药程度,此可以给临床用药进一步提供参考.
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胸膜活检和胸液培养分枝杆菌联合运用对结核性胸膜炎的诊断价值
目的 探讨胸液培养分枝杆菌、胸膜活检及其联合运用对结核性胸膜炎的诊断价值.方法 通过对270例结核性胸膜炎(合并肺结核141例)患者分别同时行胸液培养分枝杆菌、胸膜活检术检查,观察并比较它们的阳性率及其联合运用的阳性率.结果 单独行胸液培养分枝杆菌检查,阳性率41.1%:单独行胸膜活检术,阳性率65.2%,2种方法联用阳性率80.0%.联用方法与单独胸液培养组之间的差异具有统计学意义(χ2=85.476,P＜0.01);与单独胸膜活检组之间的差异也有统计学意义(χ2=14.892,P＜0.01).结论 2项检查均较安全,准确,对结核性胸腔积液诊断有显著意义,联合运用能大大提高确诊率,并能知道结核性胸腔积液是否是耐多药结核病(MDR-TB)和非结核分枝杆菌病(NTM).
