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安徽省391株结核分枝杆菌临床分离株MLVA基因分型研究
目的 初步探讨安徽省结核分枝杆菌多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)的分型及分布特征.方法 选取安徽省结核分枝杆菌391株临床分离菌株,常规培养、收集菌体,提取基因组DNA,采用聚合酶反应(PCR)对15个VNTR位点进行检测分析,基因分型聚类分析采用BioNumerics 5.0软件.结果 经基因聚类分析,可分4个基因群(Ⅰ群、Ⅱ群、Ⅲ群和Ⅳ群),分别为Ⅰ群占3.32％(13/391),Ⅱ群占3.07％(12/391),Ⅲ群所占89.00％ (348/391),Ⅳ群占4.60％(18/391)；共含183个基因型,其中149株为独特类型,余242株分为34簇,其中大的一簇包含64株(基因型为424343357333544)；研究显示明显的基因多态性,Mtub21和MIRU26位点显示较高多态性(h),分别为0.591和0.527; ETR-B、ETR-C、ETR-D和MIRU23显示较低多态性,h分别为0.125、0.08、0.124和0.137;基因群分布与药敏间的差异无统计学意义(x2值分别为0.22、0.00、0.01、0.07,P值均＞0.05).结论 初步证实安徽省结核分枝杆菌菌株存在明显的基因多态性,以Ⅲ型菌株为主,应加强对此型菌株流行的监控.
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套式PCR及测序方法用于痰标本中结核分枝杆菌rpoB耐药基因突变检测
目的应用套式PCR-DNA测序方法直接检测痰标本中结核分枝杆菌相关的rpoB基因突变,以期建立一种直接检测分枝杆菌耐利福平的快速方法,并评价其临床应用价值.方法采用套式PCR-DNA测序方法直接检测112例活动性肺结核患者和20例非结核性肺部疾病患者痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变情况.同份痰标本同时做涂片抗酸染色,罗氏培养及菌型鉴定.结果112例活动性肺结核患者痰标本套式PCR扩增87例呈阳性,产物DNA测序31例有rpoB基因突变,其中分离出耐利福平株的32例痰中29例发生了基因突变,耐药突变率90.6%(29/32),39例菌阴(涂阴培阴)痰中有2例发生突变.分离出对利福平敏感株的37例痰中未发生突变,20例非结核性肺部疾病患者痰标本套式PCR扩增均为阴性,特异性100%.结论套式PCR-DNA测序可望为直接检测临床痰标本中结核分枝杆菌耐利福平的准确、特异、快速的方法.
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分枝杆菌散在重复单位对结核分枝杆菌分型的研究
目的 评价分枝杆菌散在重复单位(MIRU)分型方法在结核病流行病学上的应用,探讨该方法的应用前景.方法 采用MIRU分型对158株结核分枝杆菌进行基因分型,这些菌株均已进行IS6110-RFLP分型.结果 MIRU分型结果产生只需1 d.158株结核分枝杆菌共产生105个类型,其中65个为独特类型.在MlRU的12个区中,重复区4、10、26、40具有较高的多态性.用Hunter-Gaston Index(HGI)对2种方法进行评价,IS6110-RFLP的分辨指数为99.4 %,MIRU技术的分辨指数为97.8%.当IS6110拷贝数小于等于10个时,IS6110-RFLP的分辨指数为98%,MIRU的分辨指数达到98.2%.结论 MIRU分型方法具有快速、简便、分辨力较高的特点,便于普及,可在结核病分子流行病学研究中发挥重要作用.
关键词： 分枝杆菌 结核 分枝杆菌散在重复单位 IS6110 RFLP -
深圳市耐多药结核分枝杆菌流行株耐药基因序列分析
目的 了解深圳市耐多药结核分枝杆菌(multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis,MDR-TB)的分子流行病学特征.方法 参照WHO/IUATLD标准,使用L-J药敏培养基,采用l%比例法药敏试验筛选出敏感株和异烟肼(isoniazid,INH)、利福平(rifampicin,RFP)双耐药临床分离株,通过DNA测序检测深圳地区153株敏感株与132株MDR-TB的INH耐药基因katG、inh A、oxyR-ahpC基因间区域及RFP耐药基因rpoB碱基排列顺序,运用DNASTAR和blastn进行序列分析.结果 153株敏感株突变率为27.5%(42/153),132株MDR-TB突变率为98.5% (130/132),其中katG基因突变率为73.5%(97/132),68.9%(91/132)为kat G315位突变;inh A基因突变率为18.2%(24/132),11.4%(15/132)为启动子区域突变,未发现inh A94特异突变株;ahpC基因突变率为16.7%(22/132),10.6%(14/132)为启动子区域突变;rpoB基因81 bp核心区域突变率为93.2%(123/132).结论 katG315、inhA启动子区域、ahpC启动子区域以及rpoB81bp核心区域突变为深圳地区耐多药结核分枝杆菌主要突变类型,与其他国家和地区差异无统计学意义;但深圳地区未见inh A94突变株.
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母牛分枝杆菌菌苗治疗卡介苗反应性淋巴结炎临床分析
目的 评价母牛分枝杆菌菌苗(微卡)在治疗卡介苗反应性淋巴结炎的临床效果,为治疗卡介苗反应性淋巴结炎提供参考依据.方法 搜集2012年1月至2015年7月上海市公共卫生临床中心的住院卡介苗反应性淋巴结炎患儿74例.根据患儿家属的治疗意愿,25例患儿口服异烟肼、利福平抗结核药物治疗(抗结核治疗组),44例患儿接受微卡治疗(微卡组),5例先天性免疫缺陷病患儿口服异烟肼、利福平、乙胺丁醇抗结核十微卡治疗.比较抗结核治疗组和微卡组患儿的治疗效果和不良反应.应用SPSS 21.0软件处理数据,组间比较采用x2检验,以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 抗结核治疗组100.0％(25/25)患儿淋巴结肿大均逐渐消退,微卡组95.5％(42/44)淋巴结肿大逐渐消退,两组有效率比较差异无统计学意义(x2=1.170,P＞0.05).抗结核药物治疗组16.0％(4/25)的出现肝功能损伤,微卡组无患儿出现肝功能损伤,两组肝损伤发生率比较差异有统计学意义(x2=7.473,P＜0.05).结论 采用微卡治疗卡介苗反应性淋巴结炎具有较好的效果,且可减少患儿不良反应的发生.
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母牛分枝杆菌菌苗治疗卡介苗反应性淋巴结炎临床分析
目的 评价母牛分枝杆菌菌苗(微卡)在治疗卡介苗反应性淋巴结炎的临床效果,为治疗卡介苗反应性淋巴结炎提供参考依据.方法 搜集2012年1月至2015年7月上海市公共卫生临床中心的住院卡介苗反应性淋巴结炎患儿74例.根据患儿家属的治疗意愿,25例患儿口服异烟肼、利福平抗结核药物治疗(抗结核治疗组),44例患儿接受微卡治疗(微卡组),5例先天性免疫缺陷病患儿口服异烟肼、利福平、乙胺丁醇抗结核十微卡治疗.比较抗结核治疗组和微卡组患儿的治疗效果和不良反应.应用SPSS 21.0软件处理数据,组间比较采用x2检验,以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 抗结核治疗组100.0％(25/25)患儿淋巴结肿大均逐渐消退,微卡组95.5％(42/44)淋巴结肿大逐渐消退,两组有效率比较差异无统计学意义(x2=1.170,P＞0.05).抗结核药物治疗组16.0％(4/25)的出现肝功能损伤,微卡组无患儿出现肝功能损伤,两组肝损伤发生率比较差异有统计学意义(x2=7.473,P＜0.05).结论 采用微卡治疗卡介苗反应性淋巴结炎具有较好的效果,且可减少患儿不良反应的发生.
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联合应用表型分析、热休克蛋白65限制性片段长度多态性分析和测序鉴定养鱼水中的非结核分枝杆菌
目的 了解养鱼水中非结核分枝杆菌(NTM)的分布情况.方法 采集30份市售养鱼水标本,通过分离培养和生化反应初步鉴定,然后从培养菌落中提取DNA,PCR扩增65kD分枝杆菌抗原,扩增产物:(1)分别应用两种限制性内切酶BstE Ⅱ和HaeⅢ酶切,然后进行琼脂糖凝胶电泳和限制性片段长度多态性分析(PRA);(2)直接测序.结果 30份市售养鱼水中29份样本分枝杆菌培养阳性,其中6份样本分别生长出两种形态性状完全不同的菌落,共分离出35株分枝杆菌,表型特征均符合NTM.理化性质、PRA和测序鉴定发现,戈登分枝杆菌8株(23%)、龟-偶然分枝杆菌复合群8株(23%)、日内瓦分枝杆菌9株(26%)、不产色分枝杆菌1株,其余9株未鉴定到种.结论 NTM广泛存在于市售养鱼水中,分子生物学方法与常规细菌学鉴定可互相补充,提高鉴定的正确性.
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颗粒显色指示技术快速检测结核分枝杆菌对吡嗪酰胺耐药性的价值
目的 探讨颗粒显色指示技术快速测定结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)对吡嗪酰胺耐药性的临床应用价值.方法 应用颗粒显色指示法测定102株Mtb对吡嗪酰胺耐药性,并与美国BD公司BACTEC MGIT-960分枝杆菌检测系统结果进行比较.结果 颗粒显色指示法测定102株Mtb临床分离株,结果对吡嗪酰胺敏感70株、耐药32株,BACTEC MGIT-960法测定结果敏感69株、耐药33株；两法测定均敏感67株、均耐药30株.如以BACTEC MGIT-960法药敏结果为判断标准,则颗粒显色指示法测定吡嗪酰胺耐药性的敏感度为90.9%(30/33),特异度为97.1%(67/69),阳性预测值为93.8%(30/32),阴性预测值为95.7%(67/70),准确性为95.1%(97/102).结论 颗粒显色指示技术快速测定Mtb吡嗪酰胺耐药性简便快速,操作不需特殊仪器设备,具有很高的临床应用价值.
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广西壮族自治区HIV与MTB双重感染患者的临床特征分析
目的 探索广西壮族自治区HIV与MTB双重感染患者的临床特征,为进一步研究双重感染的控制、诊疗提供科学依据.方法 连续纳入2013年9月至2015年8月广西壮族自治区南宁市、来宾市和贵港市可随访的HIV感染者或AIDS患者,且发现HIV感染后无结核病诊断史及抗结核药物使用史;同时纳入性别、年龄(±3岁)相近的单纯结核病患者,均采用统一设计的调查表调查.通过临床特征分析及相关实验室检查对双重感染患者、单纯HIV感染者或AIDS患者、单纯结核病患者进行比较分析.结果 共纳入HIV感染者或AIDS患者1024例,确诊或临床诊断并发MTB感染者160例(15.62％)(简称“双重感染组”);单纯HIV感染者或AIDS患者505例(49.32％).纳入单纯结核病患者489例.双重感染组在咳嗽咯痰[76.88％(123/160)]、符合结核病的胸部影像学改变[80.00％(128/160)]、痰涂片阳性率[7.32％(9/123)]均低于单纯结核病组[93.46％(457/489)、98.98％(484/489)、34.97％(171/489)](x2分别为34.88,80.76,36.20,P值均＜0.01),而低热[41.25％(66/160)]、体质量下降[34.38％(55/160)]、盗汗[8.75％(14/160)]、肺外结核[22.50％(36/160)]的发生率均高于单纯结核病组[8.79％(43/489)、6.34％(31/489)、3.89％(19/489)、0.41％ (2/489)](x2=90.88,P＜0.01;x2=82.43,P＜0.01;x2=5.91,P=0.015;x2=106.73,P＜0.01).双重感染组患者体质量下降[34.38％(55/160)]、气促和(或)呼吸困难[21.88％(35/160)]、胸痛[10.00％(16/160)]、腹泻数天不止[9.38％(15/160)]、舌表面鹅口疮或口腔黏膜奶酪样白斑[27.50％(44/160)]等临床表现发生率均高于单纯HIV感染者或AIDS患者[6.14％(31/505)、3.17％(16/505)、0.59％(3/505)、2.18％(11/505)、5.35％(27/505)](x2分别为86.04,60.05,Fisher精确检验,16.75,62.53,P值均＜0.01).CD4+T淋巴细胞计数(74.00个/mm3)明显低于单纯HIV感染者和(或)AIDS患者(282.00个/mm3)(Z=-9.43,P＜0.01).双重感染组未接受艾滋病抗病毒药物治疗(HAART)者咳嗽咯痰[81.36％(96/118)]、低热[50.00％(59/118)]、体质量减轻[41.53％(49/118)]的发生率明显高于接受治疗者[64.29％(27/42)、16.67％(7/42)、9.52％ (4/42)](x2=5.08,P=0.024;x2=14.20,P＜0.01;x2=14.32,P＜0.01);而有无卡介苗接种史[62.86％(22/35)、84.80％(106/125)]的差异仅在与结核病相符的影像学改变方面有统计学意义(x2 =8.23,P＜0.01).结论 双重感染患者临床特征复杂,诊断难度大,需对其加强监测和随访,并探索和推广新快速诊断方法,以及早发现、进行治疗.
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卷曲霉素在罗氏培养基中的稳定性研究
目的 检测卷曲霉素(Cm)在罗氏培养基中的稳定性,了解Cm在罗氏培养基中的降解速率；检测Cm降解对药物敏感性试验结果的影响.方法 用高效液相色谱仪分别检测4℃和37℃2种保存条件下,Cm在罗氏培养基中的稳定性；使用不同保存条件下的罗氏培养基进行药物敏感性试验,以验证Cm降解对敏感性试验结果的影响.结果 在4℃保存时,罗氏培养基中的Cm含量与时间呈反比,保存10d时,罗氏培养基中的Cm降解2.04％,保存40 d时,Cm降解21.5％,保存80 d时,Cm降解41.7％,保存到200 d时,检测不到Cm的存在；在37℃保存10d时,罗氏培养基中的Cm降解46.8％；在37℃保存30 d时,无法在罗氏培养基中检测到Cm的存在.在4℃存储时间为10～160 d的Cm罗氏培养基进行结核分枝杆菌药物敏感性试验(DST)时,MIC在0.8～1.0 μg/ml菌株,在4℃存储时间为40 d的Cm罗氏培养基上生长6周后出现16个菌落.MIC在1.0～1.5 μg/ml菌株,在4℃存储时间为40 d的Cm罗氏培养基上生长6周后出现阳性结果(+).结论 Cm罗氏培养基在37℃保存时不稳定,在4℃保存时相对稳定,但存储时间不应超过40 d.
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DNA疫苗治疗小鼠耐多药结核病的研究
目的 研究结核分枝杆菌DNA疫苗治疗小鼠耐多药结核病的效果.方法 用结核分枝杆菌耐利福平和异烟肼临床分离株HB361尾静脉注射60只雌性BALB/c小鼠后,将小鼠随机均匀地分为6组,感染后第3 d开始,分别用生理盐水(A组)、pVAX1载体(B组)、利福平(C组)、HSP65DNA疫苗(D组)、Ag85A DNA疫苗(E组)、Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗(F组)治疗60 d,DNA疫苗每隔15 d肌肉注射1次,共5次.治疗结束后3周,分别取肺和脾观察病理改变、称取重量、做菌落计数.结果 治疗结束后3周,与对照组比较,D组、E组和F组肺脏病变有不同程度减轻,病变局限,2/3区域可见正常的肺泡结构,肺泡轮廓相对清晰,细胞分布均匀.与A组相比,D组、E组和F组肺脏菌落数分别减少了0.34、0.50和0.26 logs;脾脏菌落数依次减少了0.37、0.46和0.28 logs(P＜0.05,P＜0.01).结论 Ag85A DNA疫苗治疗小鼠耐多药结核病效果优于HSP65 DNA和Ag85A/ESAT6嵌合DNA疫苗.
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母牛分枝杆菌菌苗辅助治疗初治菌阳肺结核的临床分析
目的观察和评价母牛分枝杆菌菌苗(微卡菌苗)在初治菌阳肺结核治疗中的作用.方法采用随机配对分组法,分微卡菌苗治疗组(A组,84例)和对照组(B组,84例).2组化疗方案均为2HRZE/4HR,A组加用微卡菌苗治疗2月,B组不用微卡菌苗.结果 A组第1月涂片阴转率36.9%,培养阴转率47.6%;第2月涂片阴转率79.8%,培养阴转率85.7%.B组第1月涂片阴转率19.0%,培养阴转率17.9%;第2月涂片阴转率53.8%,培养阴转率67.9%.前2月痰菌阴转率A组显著高于B组(P《0.01).疗程满6个月后A组涂片阴转率98.8%,培养阴转率97.6%;B组涂片阴转率96.4%,培养阴转率97.6%.A组和B组治疗6个月痰菌阴转率无显著性差异(P》0.05).病灶吸收好转及空洞缩小关闭速度,A组优于B组.A组的细胞免疫功能显著改善.随访A组和B组的细菌学复发率分别为1.3%和2.6%(P》0.05).结论微卡菌苗能改善初治菌阳肺结核患者的细胞免疫功能,加快痰菌阴转、病灶吸收及空洞缩小关闭的速度,不良反应少且轻微.微卡菌苗可用作初治菌阳肺结核的免疫治疗.
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发光二极管荧光显微镜实验室诊断效果评价
目的 评估发光二极管荧光显微镜实验室诊断结核分枝杆菌的能力.方法收集409痰标本,以固体罗氏培养为金标准,比较发光二极管荧光显微镜与普通光学显微镜、普通荧光显微镜在敏感性、特异性及检出时间上的差异,并比较技术人员对几种方法的评价.结果 罗氏培养阳性的175份痰标本中,普通光学显微镜法112份为阳性,普通荧光显微镜法121份为阳性,发光二极管荧光显微镜法130份为阳性,敏感性分别为64.0%,69.1%,74.3%;罗氏培养阴性的234份痰标本中,普通光学显微镜法233份为阴性,荧光显微镜法227份为阴性,发光二极管荧光显微镜法227份为阴性,特异性分别为99.6%,97.0%,97.0%.χ2检验统计结果 表明,发光二极管荧光显微镜与普通光学显微镜、普通荧光显微镜检测结果 差异有统计学意义(P＜0.001).普通光学显微镜,普通荧光显微镜和发光二极管荧光显微镜读片所用的读阳性片时间分别为186.7 s、75.1 s、72.2 s,发光二极管荧光显微镜与普通光学显微镜在读阳性片时间上差异有统计学意义(P＜0.05),与普通荧光显微镜差异无统计学意义.参与研究的技术员评价发光二极管荧光显微镜较其他2种方法易接受.结论 发光二极管荧光显微镜较普通光学显微镜及普通荧光显微镜在检查效果及检出时间上存在明显优势,对技术人员的亲和性好,具有推广使用的价值.
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耐多药肺结核耐药基因突变与临床疗效探讨
目的了解耐多药肺结核耐药基因的突变与临床疗效的关系,为耐多药肺结核的治疗提供参考依据.方法 108例病人痰标本用PCR-SSCP方法检测了五种耐药基因和传统的药敏试验,并与临床疗效进行比较分析.结果耐多药肺结核耐药基因检测率分别是耐异烟肼的katG基因突变率为70.4%,耐利福平的rpoB基因突变率72.2%,耐链霉素的rpsL基因突变率71.9%,耐吡嗪酰胺的pncA基因突变率53.4%,耐乙胺丁醇的embB基因突变率31.7%,其中高浓度耐药菌的基因突变率远高于低浓度的突变率.根据药敏试验及耐药基因检测结果指导治疗,应用以KAOP为基础的化疗方案,配合患者过去未曾用过的1～2种抗结核药物,经过平均1.4年的治疗,108例耐多药病人74.1%的病人痰菌阴转,且67.5%的病人痰结核杆菌培养阴转,83.3%的病人病灶吸收好转,65.3%的空洞闭合,取得了临床上较为满意的疗效.结论对耐多药肺结核进行耐药基因检测是一项重要工作,对指导治疗及预后判断有一定的参考价值.但尚需进行更多的观察.
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结核分枝杆菌IS6110探针的克隆化
目的制备克隆化结核分枝杆菌IS6110探针。方法将IS6110的PCR扩增245bp片段克隆至质粒载体pCR2.1中。结果得到了含有IS6110克隆化245bp的质粒菌株。结论克隆化的探针易操作且一致性较好。
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PCR-SSCP技术快速检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究
目的应用PCR-SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变,评价此方法用于结核分枝杆菌利福平(RFP)耐药性的意义.方法以结核分枝杆菌H37Rv为对照、50例耐RFP(单耐和多耐)结核分枝杆菌临床分离株、12例RFP敏感菌株、35例耐RFP肺结核患者痰标本,采用PCR-SSCP检测痰标本和菌株中结核杆菌rpoB基因突变.结果 50例耐RFP菌株中有45例PCR-SSCP条带与结核分枝杆菌H37Rv条带有明显差别,与药敏试验结果做对比,PCR-SSCP检测敏感性为90%,特异性为100%;12例敏感菌株与H37Rv条带一致,35份肺结核病人痰标本,21份痰PCR扩增阳性,15份SSCP图谱与H37Rv图谱有差别,而且PCR-SSCP 28份图谱与H37Rv有差别,阳性率为80%.结论 PCR-SSCP检测结核分枝杆菌rpoB基因突变快速、简便、易行,有望用于结核分枝杆菌RFP耐药性的快速测定,并将成为直接检测临床标本中结核分枝杆菌耐RFP快速方法.
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不同痰标本处理方法对结核分枝杆菌罗氏培养检测结果的影响
目的 分析采用简单法和离心法处理痰标本,以及采用离心法处理痰标本时不同离心条件对罗氏培养检测结果的影响.方法 收集2010年9-11月北京市结核病胸部肿瘤研究所国家结核病临床实验室进行细菌学检查的疑似结核病患者痰标本198份,其中涂片阳性的痰标本99份,涂片阴性的痰标本99份.同时应用简单法和离心法对198份痰标本进行罗氏培养；离心法培养时分别采用5种不同的离心条件:3000×g离心15 min、3000×g离心8 min、3000×g离心25 min、2000×g离心15 min、5000×g离心15 min.结果 任何一种方法培养阳性即认定标本培养阳性,198份痰标本中共有126份培养阳性,其中97份来自涂阳痰标本,29份来自涂阴痰标本；简单法的阳性率为93.65％(118/126),离心法高的阳性率为96.03％(121/126).简单法的平均初生长时间为(20±8.56)d,离心法(3000×g离心15 min)的平均初生长时间为(22±9.10)d,两者间差异有统计学意义(Z=-4.81,P＜0.001).在125份离心法培养阳性的标本中,3000×g离心15 min、3000×g离心8 min、3000×g离心25 min、2000×g离心15 min、5000×g离心15 min,5种不同离心条件下的培养阳性率分别为96.03％(121/126)、89.68％(113/126)、95.24％(120/126)、92.06％(116/126)和96.03％(121/126).结论 罗氏培养过程中,简单法的阳性率与离心法接近,但由于简单法操作简单、污染率较低,初生长时间较短,因而可能更符合临床的需要；应用离心法进行罗氏培养时,离心力或离心时间的变化可能会影响培养的阳性率.
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脂阿拉伯甘露聚糖的提纯及其对肺结核的诊断价值
目的 初步建立提取纯化结核分枝杆菌(M.TB)脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomanan,LAM)的方法,并将其用于血清标本检测,评价其对肺结核的诊断价值.方法 M.TB菌体经冰浴超声破碎,乙醇回流,DNase I酶RNase酶除去DNA和RNA,热酚水法去蛋白,氯仿甲醇去酚和脂质,得到粗制的脂多糖.经Sephacryl-100凝胶过滤层析分离纯化,得到LAM.将其作为抗原,通过免疫金渗滤法检测涂阳肺结核和对照血清标本中的LAM抗体.结果 所得LAM经SDS-PAGE银染,与对照标准品大小一致,为37kDa.血清LAM抗体检测对肺结核诊断的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、和涂片符合率分别为91.7%、87.8%、92.7%、86.2%、90.2%.结论 成功提取到LAM抗原,用其检测血清结核抗体显示出理想的敏感性和特异性,有望成为结核病血清学快速诊断方法之一.
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结核分枝杆菌在不同pH值液体培养基中对吡嗪酰胺敏感度的研究
目的 研究结核分枝杆菌在不同pH值液体培养基中对吡嗪酰胺(PZA)敏感度的影响,同时比较不同pH值下结核分枝杆菌对吡嗪酰胺的敏感度与测序结果的一致率,探讨适合对吡嗪酰胺进行药物敏感性试验(简称“药敏试验”)的pH值.方法 本研究采用简单随机抽样法中的直接抽选法,从2007年全国结核病耐药性基线调查的3929株结核分枝杆菌菌株中抽取348株;采用BACTEC MGIT 960系统在液体培养基pH值为5.3、5.5、5.7、5.9和6.1时,分别检测结核分枝杆菌对吡嗪酰胺的敏感度;同时对吡嗪酰胺耐药的结核分枝杆菌相关基因pmcA和rpsA进行测序,分析其突变特征;采用卡方检验统计2种方法检测吡嗪酰胺耐药率的差别,以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 在348株结核分枝杆菌中,用MGITTM 960 PZA试剂盒(pH值为5.9)检测的吡嗪酰胺总耐药率为14.4％ (50/348),DNA测序结果有43株耐药,其中有30(69.8％)株检测到吡嗪酰胺药物耐药相关基因pncA发生突变,1株(2.3％)耐药分离株仅在rpsA有突变.在液体培养基pH值为6.1、5.9、5.7、5.5和5.3时,DNA测序结果与所有菌株表型药敏试验结果的一致率分别为94.8％ (330/348)、95.1％ (331/348)、96.8％(337/348)、95.2％ (316/332)和93.5％ (287/307).并且pH值为5.7时2种方法的耐药一致率(92.1％,35/38)明显高于pH值为5.9(76.0％,38/50)时(x2=3.961,P=0.047);而pH值为6.1 (72.7％,40/55)、pH值为5.5(93.3％,28/30)和pH值为5.3(95.0％,19/20)时的耐药一致率与pH值为5.9时的耐药一致率相比,差异无统计学意义(x2 =0.147,P=0.702;x2 =0.366,P=0.545;x2 =3.410,P=o.065).结论 液体培养基pH值为5.7时,结核分枝杆菌对吡嗪酰胺耐药与遗传突变检测结果有较好的相关性.
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2009-2013年全国抗结核药物敏感性试验熟练度测试分析
目的 评价和分析2009-2013年全国抗结核药物敏感性试验(简称“药敏试验”)熟练度测试结果,改善我国结核病实验室药敏试验能力.方法 2009-2013年对全国有能力开展药敏试验的省级、地市级508个结核病实验室每年寄发30株Mtb菌株进行8种抗结核药物[异烟肼(H)、链霉素(S)、乙胺丁醇(E)、利福平(R)、卡那霉素(Km)、阿米卡星(Am)、卷曲霉素(Cm)、氧氟沙星(Ofx)]的药敏试验熟练度测试,药敏试验方法采用WHO推荐的基于罗氏培养基的比例法.共计收到508个实验室报告的一线抗结核药物药敏试验熟练度测试结果,445个实验室报告的二线抗结核药物药敏试验熟练度测试结果.结果统一由国家结核病参比实验室进行比对.评价指标为敏感度、特异度、重复性和一致性.2009-2013年各指标差异采用卡方检验,变化趋势采用Cochran-Armitage 趋势检验,以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 对于各个药物总敏感度、总特异度、总重复性和总一致性的范围是:H.91.88％～97.62％、92.01％～98.33％、86.55％～95.27％和91.40％～97.60％;S:88.79％～94.14％、87.59％～91.36％、77.37％～93.13％和88.20％～92.45％;E:66.24％～85.17％、83.22％～97.87％、63.46％～89.76％和75.78％～90.80％;R:78.54％～96.34％、96.19％～98.07％、79.11％～95.66％和90.72％～97.21％;Km:81.12％～95.46％、95.35％～98.86％、94.12％～96.84％和90.23％～97.77％;Am:93.14％～98.94％、96.16％～99.00％、93.52％～97.94％和95.59％～98.19％;Cm:52.45％～95.68％、89.68％～97.85％、89.48％～92.99％和89.08％～95.61％;Ofx:84.75％～94.38％、96.21％～98.90％、88.01％～94.41％和93.01％～96.90％.除S的总特异度、Km和Cm的总重复性每年差异无统计学意义外(x2值分别为8.49、4.1和7.78,P值均＞0.05),各个药物的总敏感度每年差异有统计学意义(H:x2 =134.76;S:x2=44.12;E:x2=266.22;R:x2=256.35;Km:x2=197.46;Am:x2=12.16;Cm:x2=433.50;Ofx:x2=47.38,P值均＜0.05);其他各个药物的总特异度每年差异有统计学意义(H:x2=67.69;E:x2=439.39;R:x2=16.61;Km:x2=94.97;Am:x2=52.96;Cm:x2 =139.51;Ofx:x2=11.66,P值均＜0.05);其他各个药物的总重复性每年差异有统计学意义(H:x2=61.82;S:x2 =127.15;E:x2=246.49;R:x2=180.03;Am:x2=21.65;Ofx:x2=28.49,P值均＜0.05);各个药物的总一致性每年差异有统计学意义(H:x2=162.05;S:x2x2=36.58;E:x2=369.11;R:x2=152.30; Km:x2=233.69;A:x2=32.55;Cm:x2=168.79;Ofx:x2=36.97,P值均＜0.05).除Am、Cm的总敏感度,Ofx的总特异度,Km、Am、Cm的总重复性逐年趋势检验无统计学意义外(Z值分别为0.46、0.99、-0.30、-0.85、0.09和-0.27,P值均＞0.05),其他各个药物总敏感度呈逐年提高趋势,趋势检验有统计学意义(H:Z=-11.06;S:Z=-6.39;E:Z=-12.39;R:Z=-11.17;Km:Z=-12.60;Ofx:Z=-4.40,P值均＜0.05);其他各个药物总特异度呈逐年提高趋势,趋势检验有统计学意义(H:Z=-3.85;S:Z=-2.14;E:Z=-12.30;R:Z=-3.31;Km:Z=-5.05;Am:Z=-5.43;Cm:Z=-8.90,P值均＜0.05);其他各个药物总重复性呈逐年提高趋势,趋势检验有统计学意义(H:Z=-5.36;S:Z=-9.11;E:Z=-7.76;R:Z=-8.52;Ofx:Z=-3.44,P值均＜0.05);各个药物总一致性呈逐年提高趋势,趋势检验有统计学意义(H:Z=-10.95;S:Z=-5.95; E:Z=-11.87; R:Z=-9.70; Km:Z=-14.11;Am:Z=-3.32;Cm:Z=-5.71;Ofx:Z=-3.40,P值均＜0.05).结论 开展熟练度测试工作是提高药敏试验能力的有效方法,对于提高我国结核病实验室药敏试验能力具有很大贡献.长期连续的做好实验室内部质量控制并开展药敏试验培训和熟练度测试工作可使全国结核病实验室药敏试验能力逐年提高.
