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Ⅱ型胶原的制备方法及其在生物医学领域的应用进展
Ⅱ型胶原为胶原中一类重要的纤维形成结构蛋白,其分子由3条完全相同的α1(Ⅱ)链以三股螺旋结构的方式构成,是关节软骨的基本组成之一.文章综述了其制备方法,包括碱法、中性盐法、酸法和酶法等.着重介绍了Ⅱ型胶原在人工皮肤、软骨组织的构建、骨关节炎的诊断治疗、药物输送系统、角膜及基因传送载体等方面的应用前景.
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Ⅱ型胶原在颞下颌关节骨关节病髁突软骨的表达
目的:观察Ⅱ型胶原(CⅡ)在颞下颌关节骨关节病(TMJOA)髁突软骨的变化特征,探讨CⅡ在TMJOA髁突软骨破坏中的作用.方法:采用部分切除关节盘的方法诱发TMJOA动物模型,应用免疫组织化学的方法检测CⅡ在不同病变时期髁突软骨的表达.结果:关节盘部分切除后,CⅡ在不同病变时期髁突软骨的表达均有所增强.结论:CⅡ可能在骨关节病髁突软骨的破坏过程中起代偿作用.
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痹痛康丸治疗大鼠类风湿关节炎的病理学观察
目的:探讨痹痛康丸对大鼠牛Ⅱ型胶原诱导的关节炎(CIA)的作用机制.方法:牛Ⅱ型胶原与完全弗氏佐剂(CFA)诱发CIA,观察痹痛康丸对CIA大鼠踝关节肿胀、胸腺与脾脏的重量、滑膜组织病理改变的影响.结果:痹痛康丸可明显减轻CIA大鼠关节肿胀、胸腺与脾的重量,减轻滑膜组织的病理改变.结论:痹痛康丸具有良好的抗炎镇痛和免疫抑制作用.
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髁突增殖层细胞在颞下颌关节适应性改建中的作用
目的探讨颞下颌关节盘前移位后髁突软骨增殖层细胞在关节适应性改建中的作用.方法 32只日本大白兔,在全麻下建立关节盘前移位动物模型,术后1周、2周、4周、6周、8周处死,HE染色、Ⅱ型胶原和蛋白多糖聚合体mRNA原位杂交染色观察.结果正常髁突的增殖层浅层有蛋白多糖聚合体 mRNA的少许表达,但无Ⅱ型胶原表达.增殖层深层Ⅱ型胶原和蛋白多糖聚合体mRNA均有大量表达.术后1周,受力区软骨组织变薄,尤以增殖层明显.蛋白多糖聚合体mRNA表达开始下调.2周后Ⅱ型胶原mRNA表达也开始下降.4周后蛋白多糖聚合体mRNA表达开始回升,增殖层浅层也可见表达,但Ⅱ型胶原mRNA表达继续下降.术后8周两基因表达水平恢复至正常. 结论增殖层细胞具有向软骨细胞分化的潜能,成年兔髁突软骨增殖层具有再生能力,但损伤过度,可导致骨关节病样改变.
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胶原蛋白在大鼠失用性骨质疏松中的骨代谢变化
目的：通过对雄性大鼠后肢体一侧制动建立骨质疏松模型，探讨胶原蛋白在大鼠失用性骨质疏松中的骨代谢变化。方法本研究采用随机、平行、自身对照研究，选取4周龄健康雄性SD大鼠25只，随机分为对照组（N=5，未进行处理）和实验组（N=20，一侧后肢体固定），20只雄性S D大鼠右侧肢体固定建立失用性骨质疏松模型，右后肢制动固定作为实验组，未固定的对侧肢体为对照组。2周后麻醉下建模动物处死后截取相同长度后肢股骨标本，进行标本处理。采用微量羟脯氨酸测定法及酶联免疫法检测总胶原及Ⅰ型、Ⅱ型胶原含量。结果实验组总胶原、Ⅰ型、Ⅱ型胶原含量及Ⅰ型/Ⅱ型胶原比值均显著低于对照组（P<0.05）。结论通过一侧后肢体制动可以导致大鼠固定侧股骨总胶原、Ⅰ型及Ⅱ型胶原蛋白的数量和结构发生变化，Ⅰ型/Ⅱ型胶原比值的下降，构成了失用性骨质疏松的生物化学基础，导致骨钙、骨磷减少形成局部性骨质疏松。
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抗CB10抗体在类风湿关节炎患者中的意义
目的 检测抗Ⅱ型胶原抗原表位的多肽片段(GPAGTAGAR)抗体,即抗CB10抗体在类风湿关节炎(RA)中的阳性率,探讨抗CB10抗体在RA中的意义.方法 以人工合成CB10多肽为抗原.用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测164例RA、40例系统性红斑狼疮(SLE)、55例骨关节炎(OA)、66例强直性脊柱炎(AS)、63名正常人血清及19例RA和14例AS关节液中抗CB10抗体的水平.分析比较各组抗CB10抗体的水平及其与临床资料的关系.结果 RA患者血清中抗CB10抗体的吸光度(A)值水平明显高于其他风湿病组和正常对照组,差异有统计学意义(P＜0.01),其在RA、SLE、AS、OA及正常对照组中的阳性率分别为:71.3%、12.5%、30.3%、12.7%和3.2%,对RA的敏感性为71.3%.特异性为82.1%:阳性预测值为77.5%,阴性预测值为80.2%.病程≤2年的RA患者抗CB10抗体阳性率明显高于病程＞2年者,差异有统计学意义(P＜0.05).抗CB10抗体与病程及x线分期呈负相关(P＜0.05),与关节压痛数、关节肿胀数、晨僵、休息痛、健康评价问卷(HAQ)、类风湿因子(RF)、抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体、红细胞沉降率(ESR)等指标无明显相关性.结论 RA患者血清中抗CB10抗体明显升高,对RA诊断有较好的敏感性和特异性;抗CB10抗体与病程及X线分期呈负相关.
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膝三脏汤对大鼠膝骨关节炎软骨的影响及作用机制研究
目的:通过宏观与微观观察大鼠关节软骨改变情况、软骨退变情况、端粒酶活性改变、Ⅱ型胶原含量变化,探讨膝三脏汤对大鼠膝骨关节炎软骨的影响,以揭示膝三脏汤治疗膝骨性关节炎的作用机制.方法:80只健康Wisrar大鼠,参考随机数字表将大鼠分为空白对照组、模型组、硫酸氨基葡萄糖组和膝三脏汤组,每组20只.采用人与动物体表面积作为换算公式,计算出四组大鼠给药剂量,膝三脏汤组灌胃膝三脏汤,硫酸氨基葡萄糖组灌胃硫酸氨基葡萄糖液,模型组和空白对照组大鼠灌以等容积蒸馏水.6周后,取大鼠血清及关节软骨,测量大鼠血清中端粒酶活性以及Ⅱ型胶原含量,观察膝三脏汤对大鼠膝骨关节炎血清中端粒酶活性以及Ⅱ型胶原含量变化的影响.结果:膝三脏汤组和硫酸氨基葡萄糖组属于Ⅰ级模型组属于Ⅱ级,空白对照组属0级.膝三脏汤组和硫酸氨基葡萄糖组评分为3～7分,属轻中度退变,模型组评分为11～14分,属重度退变;空白对照组评分为0～1分,属正常.空白对照组Ⅱ型胶原全层软骨可见均匀染成棕褐色;模型组表、中层失染,而钙化层染色加深;硫酸氨基葡萄糖组表层失染,其余层可见不均匀着色;膝三脏汤组染色较硫酸氨基葡萄糖组均匀.膝三脏汤组、硫酸氨基葡萄糖组与模型组及空白对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).膝三脏汤组与硫酸氨基葡萄糖组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论:膝三脏汤能提高大鼠膝关节软骨型胶原含量,具有防治大鼠早中期胯骨性关节炎软骨退变的作用.
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Ⅱ型胶原对T-2毒素诱导关节软骨损伤拮抗作用
目的 观察Ⅱ型胶原干预T-2毒素诱导大鼠关节软骨早期损伤的作用,为探讨关节软骨损伤的防治措施提供理论依据.方法 Wistar大鼠40只,随机分为4组,每组10只,对照组(常规成品颗粒料),T-2毒素组(含100 ng/kg T-2毒素饲料),Ⅱ型胶原0.5、5.0组(0.5、5.0 g/L)连续处理5个月,光镜下观察大鼠透明软骨组织病理学改变,用酶联免疫吸附试验检测大鼠血清Ⅱ型胶原羧基端端肽(CTX-Ⅱ)、软骨寡聚基质蛋白(COMP)及尿中吡啶啉(DPD)含量.结果 光镜下T-2毒素组大鼠关节软骨细胞排列紊乱,软骨细胞变形、变性,可见大面积软骨细胞坏死,而低、高剂量Ⅱ型胶原组表现为软骨表面原纤维形成,表层软骨细胞肿胀变圆,扁平的软骨细胞减少,软骨细胞簇集等骨关节炎早期病理改变.对照组,T-2毒素组,高、低剂量Ⅱ型胶原组大鼠血清CTX-Ⅱ、COMP含量分别为(25.07 ±9.17)、(39.17±10.49)、(28.20±9.74)、(29.73±9.32) μg/L与(6.38 ±2.23)、(24.53 ±4.26)、(20.32 ±4.74)、(19.44 ±4.92) μg/L,大鼠尿液DPD含量分别为(4.14±1.06)、(4.33±3.43)、(5.72±3.89)、(4.23±2.90) μg/L.与对照组比较,模型组大鼠血清CTX-Ⅱ、COMP含量明显升高(均P＜0.05),大鼠尿液DPD含量无明显改变;与模型组比较,Ⅱ型胶原组大鼠血清CTX-Ⅱ、COMP明显降低(均P＜0.05),大鼠尿液DPD含量无明显变化.结论 Ⅱ型胶原能拮抗T-2毒素所致软骨损伤作用,延缓关节软骨的破坏进程,其机制可能与降低大鼠血清中CTX-Ⅱ及COMP含量有关.
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痹痛灵颗粒对胶原诱导类风湿性关节炎大鼠原代滑膜细胞的影响
[目的]观察痹痛灵颗粒对胶原诱导类风湿性关节炎(CIA)大鼠关节原代滑膜细胞的影响.[方法]通过测量Ⅱ型胶原诱导大鼠类风湿性关节炎模型的足踝体积和关节肿胀评分,并对CIA大鼠原代滑膜细胞增殖能力的检测及滑膜细胞培养上清液IL - 1β、TNF -α含量的测定,观察痹痛灵颗粒对滑膜细胞及滑膜细胞培养上清液IL - 1β、TNF -α含量的影响.[结果]痹痛灵颗粒高、中剂量组大鼠滑膜细胞增殖小于模型组,与模型组相比有显著性差异；痹痛灵颗粒高、中、低剂量组与雷公藤多苷片组的细胞培养液中IL - 1β、TNF -α水平明显低于模型组,有显著差异.[结论]痹痛灵颗粒通过抑制CIA大鼠滑膜细胞病理性增生,降低滑膜细胞培养液中IL - 1β、TNF -α水平,对胶原诱导大鼠类风湿性关节炎产生一定的治疗作用.
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Caspase-3在Ⅱ型胶原所致大鼠自身免疫性内耳病的表达
目的 研究Caspase-3在Ⅱ型胶原所致大鼠自身免疫性内耳病的表达,探讨自身免疫性内耳病发病机制.方法 选用耳廓反射灵敏的健康雌性sD大白鼠60只,随机分成实验组(30只,皮下注射Ⅱ型胶原与弗式佐剂),佐剂组(15只,皮下注射弗氏佐剂),对照组(15只,予以等量生理盐水).免疫6周后,观察两周,于首次给药前一天和末次给药后一天行畸变产物耳声发射检测(DPOAE);处死动物,取耳蜗行基底膜铺片光学检查和切片免疫组织化学检测.结果 实验组Caspase-3在Colti器、螺旋神经节细胞、血管纹和螺旋韧带表达呈阳性,同时大鼠DPOAE幅值在1、2、4、6、8kHzt时较佐剂组和对照组明显下降(P＜0.01),并且毛细胞铺片可见毛细胞肿胀,结构混乱,排列不整齐,有多处散在空位,而佐剂组和对照组未见明显改变.结论 Ⅱ型胶原所致大鼠自身免疫性内耳病中有Caspase-3的表达.
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黄韧带退变与腰椎管狭窄症椎管形态的变化
背景:目前研究发现Ⅰ型及Ⅱ型胶原在结缔组织的增殖与分化、软骨的形成和吸收等过程中起十分重要的作用.目的:探讨腰椎黄韧带退变与腰椎管狭窄症椎管形态变化的相关性.方法:收集中央型腰椎管狭窄症36例和外伤性腰椎骨折20例患者的黄韧带标本分别为实验组和对照组,采用酶联免疫吸附法测定Ⅰ型和Ⅱ型胶原;CT测量腰椎硬膜横截面积;黄韧带行苏木精-伊红和Masson染色,观察组织病理学变化.结果与结论:实验组黄韧带厚度、Ⅰ型及Ⅱ型胶原含量高于对照组,腰椎硬膜横截面积和Ⅰ型/Ⅱ型比值低于对照组(P < 0.05);病理学显示实验组黄韧带弹性纤维排列紊乱,数量减少,胶原纤维增生.提示腰椎黄韧带Ⅰ型、Ⅱ型胶原含量及Ⅰ型/Ⅱ型比值发生改变,可能引起黄韧带厚度增加,导致椎管横截面积减小,参与腰椎管狭窄症的发生.
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改性聚乳酸-羟基乙酸/Ⅰ型胶原复合支架的细胞亲和性
背景:聚乳酸-羟基乙酸是一种较好的细胞支架材料,但细胞亲和性较差、机械强度不够等缺点又限制了它的应用.因此,聚乳酸类支架材料的改性是非常必要的.目的:研究改性聚乳酸-羟基乙酸/Ⅰ型胶原复合生物支架的细胞亲和性.设计、时间及地点:体外对比观察实验,于2005-02/12在遵义医学院中心实验室完成.材料:利用多聚赖氨酸对聚乳酸-羟基乙酸改性后与Ⅰ型胶原构成复合生物支架.方法:将改性聚乳酸-羟基乙酸/Ⅰ型胶原复合支架与聚乳酸-羟基乙酸支架各12块,分别放入2块24孔培养板中,每孔加1×1011 L-1 第2代兔耳软骨细胞悬液100μL.在37℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养4h后,每孔加1 mL含血清DMEM培养24 h.主要观察指标:①倒置显微镜下观察改性前后支架空间结构.②观察改性后支架吸附细胞的形态结构.③计算改性前后支架对兔耳软骨细胞的吸附率.结果:改性后复合支架的粗糙度增加,其细胞吸附率明显高于聚乳酸-羟基乙酸支架组(P＜0.05),细胞形态结构较好.结论:改性聚乳酸-羟基乙酸/Ⅰ型胶原复合生物支架具有较好的细胞亲和性.
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重建胶原纤维对细胞生长的影响
背景:胶原种类很多,而不同细胞只在特定类型的胶原环境中才表现出佳的增殖和表型.目的:观察Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原对小鼠皮肤成纤维细胞、人牙周膜成纤维细胞和兔软骨细胞生长的影响.设计、时间及地点:对比观察,细胞学体外实验,于2007-09/2008-09在四川大学生物材料工程研究中心胶原研究室完成.材料:自制达到中试水平的猪皮Ⅰ型胶原和猪软骨Ⅱ型胶原.方法:分别将3种细胞在猪皮Ⅰ型胶原和猪软骨Ⅱ型胶原环境中进行体外培养,比较不同细胞在材料上的行为差异.主要观察指标:傅里叶变换红外光谱、示差扫描热分析和凝胶动力学分析比较2种胶原的热变性温度及在结构和性质上的差异;MTT法观察细胞在2种胶原环境中的黏附、增殖情况.结果:猪软骨Ⅱ型胶原和猪皮Ⅰ型股原的热变性温度分别为105.8,87.5℃,2种胶原的官能团区相似.凝胶化曲线的对比中猪皮Ⅰ型胶原的成纤维过程较猪软骨Ⅱ型胶原迅速.MTT值显示细胞生长初期,小鼠皮肤成纤维细胞在软骨Ⅱ型胶原环境表现了较好的黏附性,但是更适于在猪皮Ⅰ型胶原上生长;人牙周膜成纤维细胞与小鼠皮肤成纤维细胞对胶原纤维的反应恰好相反.兔软骨细胞第2天在两种胶原上的黏附相似,第4天时在猪软骨Ⅱ型胶原环境中表现出较大的细胞生长密度.结论:不同细胞对Ⅰ,Ⅱ型胶原纤维表现了不同的时间依赖性,但猪软骨Ⅱ型胶原环境更接近于软骨生长的真实环境,更有利于软骨细胞朝特定方向分化,使软骨细胞维持稳定的表型.
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不同分离方法对骨髓间充质干细胞成软骨分化的影响
背景:目前并没有特定的实验对骨髓间充质干细胞分离的两种基本方法进行系统评估,所以贴壁分离法和密度梯度离心法对细胞诱导分化是否存在不同影响,尚无定论.目的:拟验证两种基本分离方法对骨髓间充质干细胞成软骨分化影响的差别.设计、时间及地点:对照观察实验,2005-03/09在中国医科大学附属盛京医院儿外实验室完成.材料:2～3月龄体质量1.2～2.0 kg的日本大耳兔20只用于抽取骨髓. 方法:用贴壁分离法和密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞.选择两组同代的骨髓间充质干细胞,用转化生长因子β1诱导其向软骨方向分化.主要观察指标:①倒置显微镜观察骨髓间充质干细胞的生长情况,绘制两组细胞生长曲线.②免疫组化检测两组Ⅱ型胶原表达.③原位杂交检测两组细胞Ⅱ型胶原mRNA表达.结果:绘制生长曲线表明两组细胞生长速度趋于一致.免疫组化法检测两种方法分离的骨髓骨髓间充质干细胞的软骨细胞分化率为76.1%和77.7%,原位杂交法检测的软骨细胞分化率为70.3%和71.0%,差异无显著性意义.结论:两种分离方法对骨髓间充质干细胞的生长和成软骨分化结果的影响无差异.
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转化生长因子β3基因转染兔骨髓间充质干细胞诱导其向软骨表型的分化
背景:内源性诱导软骨分为就是通过一定的载体将目的基因整合入干细胞内,使其自行分泌诱导因子诱导自身进行分化.目的:观察将转化生长因子β3 通过腺相关病毒载体转染诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨表型转化的能力.方法:取体外培养的第3 代骨髓间充质干细胞进行重组腺相关病毒转染,将转染后3,6,9,12 d 细胞裂解提取蛋白进行酶联免疫检测目的蛋白转化生长因子β3 的体外表达.RT-PCR,免疫印迹western blot 分别从基因和蛋白水平上检测1,2 周Ⅱ型胶原的表达,甲苯胺蓝染色检测1,2 周蛋白多糖的表达.结果与结论:重组腺相关病毒转染后,骨髓间充质干细胞可以较稳定的表达目的蛋白转化生长因子β3,并且转染成功的骨髓间充质干细胞较阴性对照组能够更好的向软骨表型转化.证实转化生长因子β3 可以腺相关病毒为载体转染骨髓间充质干细胞并诱导其向软骨表型分化.
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Ⅱ型胶原C端肽与椎间盘退变及骨性关节炎的相关性
背景:软骨退变标志物是近年来的研究热点,Ⅱ型胶原C端肽是可以通过无创方法检测软骨退变的较好指标.目的:观察Ⅱ型胶原C端肽与椎间盘退变及骨性关节炎的相关性.设计、时间及地点:回顾性分析,于2008-03/06在郑州大学第一附属医院骨科完成.对象:选择椎间盘退变和骨性关节炎患者各15例分别作为椎间盘退变组和骨性关节炎组,其中椎间盘退变组男7例,女8例,平均年龄(62±7)岁;骨性关节炎组男6例,女9例,甲均年龄(61±8)岁;另选末患骨性关节炎及椎间盘退变的非骨科疾病患者15例作为对照组,男8例,女7例,平均年龄(57±6)岁.方法:3组患者分别取第2次晨尿10 mL,尿样置-20℃冰箱保存.尿样收齐后,用人骨退化特异标志物酶联免疫分析试剂盒检测每例标本的Ⅱ型胶原C端肽值,同时检测每例标本的尿肌酐浓度,并对Ⅱ型胶原C端肽值进行校正.主要观察指标:尿Ⅱ型胶原C端肽在椎间盘退变及骨性关节炎患者中的水平及相关性.结果:45例患者均进入结果分析.与对照组相比,椎间盘退变组和骨性关节炎组患者尿中Ⅱ型胶原C端肽明显升高,差异有显著性意义(P<0.05).椎间盘退变组和骨性关节炎组Ⅱ型胶原C端肽水平相比,差异无显著性意义(P>0.05).椎间盘退变组椎间盘退变分级与Ⅱ型胶原C端肽水平呈正相关(r=0.592,P=0.020).骨性关节炎组膝关节退变分级与Ⅱ型胶原C端肽水平也呈正相关(r=0.719,P=0.003).结论:椎间盘退变患者及骨性关节炎患者尿中Ⅱ型胶原C端肽水平均有升高,且Ⅱ型胶原C端肽与椎间盘退变及骨性关节炎具有正相关性.
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结缔组织生长因子对体外培养的兔关节软骨细胞增殖和表型的影响
背景:在关节软骨损伤修复的过程中,由于目前实验室中常用的细胞因子存在半衰期短、价格昂贵等缺点,不能广泛应用于临床.目的:假设结缔组织生长因子对体外培养的兔关节软骨细胞增殖和表型有一定的影响,为组织学方法修复关节软骨缺损寻找新的细胞因子.设计、时间及地点:随机区组设计对照实验,于2007-08/2008-02在深圳龙岗中心医院完成.材料:健康1月龄新西兰大白兔2只:结缔组织生长因子为Propetech公司产品.方法:获取兔关节软骨组织,将其剪碎,Ⅱ型胶原酶消化法原代分离培养兔关节软骨细胞,待细胞铺满瓶底80%胰酶消化传代,取其第2代,细胞贴壁后随机分组,实验组分别加入30,50,100,150 μ g/L的结缔组织生长因子,对照组仅加入DMEM培养液进行体外培养.主要观察指标:采用倒置相差显微镜下观察细胞形态及数量改变,采用四唑盐(MTT)法检测不同浓度的结缔组织生长因子对软骨细胞增殖的影响,免疫组织化学法(SABC法)检测Ⅱ型胶原的表达情况.结果:①结缔组织生长因子作用下的兔关节软骨细胞生长迅速,呈典型的软骨细胞形态,部分细胞聚集成团,形成软骨结节.②结缔组织生长因子能显著促进兔关节软骨细胞增殖,与对照组相比差异具有显著性意义(P<0.01).不同质量浓度的结缔组织生长因子均能促软骨细胞增殖,100μg/L为佳作用质量浓度(P<0.01).③结缔组织生长因子作用下的兔关节软骨细胞Ⅱ型胶原表达增多,且始终为阳性.结论:结缔组织生长因子可以刺激体外培养的兔关节软骨细胞增殖,促进软骨特异性Ⅱ型胶原表达,维持软骨表型.结缔组织生长因子可能用来作为组织工程学修复软骨缺损,治疗骨关节炎的新的生长因子.
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转腺病毒-人骨形态发生蛋白7软骨细胞分泌的透明质酸和Ⅱ型胶原
背景:软骨细胞自身分裂能力不强和去分化现象限制了其在组织工程中的应用.目的:观察腺病毒-骨形态发生蛋白7转染兔软骨细胞后骨形态发生蛋白7的表达及其对软骨细胞分泌Ⅱ型胶原和透明质酸功能的影响.方法:包装骨形态发生蛋白7腺病毒载体,将其转染至兔第2代软骨细胞.检测骨形态发生蛋白7 mRNA及蛋白的表达;检测软骨细胞中Ⅱ型胶原和透明质酸的变化.结果与结论:转染腺病毒-骨形态发生蛋白7后48,72 h,RT-PCR和Western blot方法显示软骨细胞表达的骨形态发生蛋白7 mRNA和蛋白均明显增加,RT-PCR和ELISA显示软骨细胞分泌的Ⅱ型胶原和透明质酸也显著增加.说明应用腺病毒可成功将骨形态发生蛋白7转染至兔软骨细胞,并能促进软骨细胞分泌Ⅱ型胶原和透明质酸.
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体外培养人退变髓核细胞的生物学性状
背景:椎间盘退行性变后很难自行修复,研究退变髓核细胞的生物学特性可为研究椎间盘退变机制、组织工程椎间盘构建、基因治疗等提供理论基础.目的:观察体外培养的人退变髓核细胞的生物学特性.方法:分离培养人退变椎间盘髓核细胞,采用光镜、电镜观察细胞的形态和超微结构,荧光定量PCR技术检测髓核细胞Ⅱ型胶原和糖胺多糖mRNA的表达.ELISA法检测细胞培养上清中人Ⅱ型胶原水平,DMMB比色法检测细胞培养上清中糖胺多糖水平.结果与结论:体外培养的传2代内的退变椎间盘髓核细胞结构与原代细胞相似,传3代后的细胞出现退变及凋亡改变.对体外培养第1代的退变髓核细胞和正常髓核细胞的Ⅱ型胶原和糖胺多糖进行检测发现,退变髓核细胞Ⅱ型胶原、糖胺多糖mRNA水平及细胞外基质中Ⅱ型胶原和糖胺多糖的表达均明显低于正常髓核细胞,呈现去分化趋势.
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海藻酸钠三维培养SW1353人软骨瘤细胞株:表型标志物Ⅱ型胶原的生物动力学特征及超微定位
背景:软骨细胞在体外单层培养的去分化改变及其来源困难是目前软骨细胞研究领域中的两大难题,目前关于SW1353人软骨瘤细胞表型和生物学特点及三维培养的相关报道较少.目的:观察SW1353人软骨瘤细胞在海藻酸钠三维培养体系中表型标志物Ⅱ型胶原的生物动力学及超微定位特点.设计、时间及地点:材料-细胞学体外观察,于2004-08/2006-01在中南大学湘雅医学院完成.材料:SW1353人软骨瘤细胞株由ATCC公司提供.方法:细胞复苏后接种,加入含胎牛血清、维生素C的DMEM培养基进行单层贴壁培养.离心后将细胞团块悬浮于低黏性海藻酸钠溶液中,细胞终浓度为2×10~9 L~(-1),滴入凝胶溶液,聚化获得细胞凝珠,每个凝珠约含20 000个细胞.藻酸盐凝胶三维体系培养8周后,柠檬酸钠分解凝胶,收获培养的软骨细胞及上清,并与单层培养的细胞进行比较.主要观察指标:细胞形态及表型变化,细胞生长曲线,细胞上清和海藻酸钠基质中Ⅱ型胶原的表达,细胞超微结构及Ⅱ型胶原的定位,同位素脉冲追踪活细胞Ⅱ型胶原的合成分泌.结果:①单层培养时,细胞由1周时的多角形变为8周后的条梭状或不规则形,三维培养条件下细胞形态始终以多角形为主.甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组化染色结果显示,单层培养1周时均呈强阳性表达,8周后转为弱阳性,而三维培养8周后仍均呈强阳性表达.②三维培养条件下细胞生长曲线无明显增殖高峰,单层培养的细胞第8~10天达增殖高峰.③ELISA检测结果显示,单层培养8周后细胞上清中Ⅱ型胶原的表达明显高于第1周(P<0.05),同时也明显高于三维培养条件下细胞上清及海藻酸钠基质中Ⅱ型胶原的表达(P<0.05).④透射电镜下细胞超微结构基本正常,免疫电镜下可见细胞内Ⅱ型胶原主要定位于粗面内质网膜内,少数分布在线粒体.⑤~(14)C标记的脯氨酸干预后180 min,是细胞内合成及向细胞外分泌Ⅱ型胶原的高峰期.结论:SW1353人软骨瘤细胞在体外长期单层培养会发生细胞表型改变,其在藻酸盐凝胶三维培养体系中生长状态良好,细胞内软骨细胞标志物Ⅱ型胶原表达丰富,提示SW1353可以作为软骨细胞功能研究的良好模型.
