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银杏酮酯EGb50对缺氧/复氧损伤后SH-SY5Y细胞线粒体功能的影响
缺血性脑血管病,尤其是脑缺血后的再灌注损伤会严重危害人类生命健康,探讨银杏酮酯(Ginkgo biloba extract 50,EGb50)对缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤后人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞线粒体功能的影响及可能机制,将为缺血性脑血管病的治疗提供新的思路.该研究以SH-SY5Y细胞建立H/R损伤模型,给予EGb50,流式细胞仪测定线粒体膜电位和胞内钙离子浓度,并以免疫荧光、Western blot法检测线粒体融合、分裂相关蛋白即视神经萎缩相关蛋白1(optic atrophy1,Opa1)和类动力蛋白1(dynamin-like protein 1,Drp1)的表达水平.结果表明,H/R损伤后,细胞线粒体膜电位明显降低,胞内钙离子浓度升高,线粒体融合相关蛋白Opa1表达水平降低,线粒体分裂相关蛋白Drp1表达水平升高;EGb50干预后,线粒体膜电位显著升高,胞内钙离子浓度显著降低,Opa1表达水平显著升高,Drp1表达水平显著降低.研究提示,EGb50对H/R损伤的SH-SY5Y细胞线粒体功能有明显的保护作用,可减轻细胞能量代谢紊乱,改善线粒体功能,其作用机制可能与调节线粒体的融合、分裂有关,从而为EGb50治疗缺血性脑血管病提供数据支持.
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Aβ1-42对SH-SY5Y细胞T514位点磷酸化CRMP2表达的影响
目的 探讨β淀粉样蛋白1-42(Aβ<,1-42>)对成神经瘤细胞SH-SY5Y轴突生长状态、细胞微管结构及T514位点磷酸化脑衰蛋白反应调节蛋白2(CRMP2)表达的影响.方法 用全反式维甲酸诱导SH-SY5Y细胞,细胞外给予聚集态Aβ<,1-42>越致细胞损伤;用MTT法检测细胞存活率;用细胞化学法测量细胞轴突长度;免疫荧光法观察细胞微管结构及T514位点磷酸化CRMP2的分布;Westen blot分析T514位点磷酸化CRMP2在细胞内的表达.结果 0.1与1 μmol/L聚集态Aβ<,1-42>使诱导后SH-SY5Y细胞存活率显著减低(P<0.01);以1 μmoL/L Aβ<,1-42>处理后,细胞轴突长度缩短(P<0.05).0.1和1 μmol/L Aβ<,1-42>处理后细胞微管结构模糊,T514位点磷酸化CRMP2在细胞内荧光分布面积扩大(P<0.05),强度增加(P<0.01);用0.1和1 μmol/L聚集态Aβ<,1-42>处理后细胞内T514位点磷酸化CRMF2表达量显著增加(P<0.01).结论 Aβ<,1-42>可增加SH-SY5Y细胞内T514位点磷酸化CRMP2的表达,损害微管结构,抑制轴突生长.
关键词： β淀粉样蛋白 脑衰蛋白反应调节蛋白2 SH-SY5Y细胞 全反式维甲酸 -
肿瘤抑制剂GA对SH-SY5Y细胞凋亡的影响及分子机制研究
为了探讨 HSP90特异的功能抑制剂geldanamycin(GA)能否用于神经母细胞瘤的临床治疗,通过检测未分化的和全反式维甲酸(RA)诱导分化的神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞在不同浓度GA处理后的细胞存活率,发现GA呈剂量依赖性诱导SH-SY5Y细胞凋亡, 但是分化细胞对同样剂量的GA不是很敏感[细胞存活率依次为(82.0±6.0)%比较(65.0±3.0)%, P＜0.02; (67.9±3.1)%比较(43.4±3.9)%, P＜0.03; (4.3±0.8)%比较(0.4±0.1)%, P＜ 0.05].Western印迹分析和免疫荧光实验显示,GA能抑制细胞中c-Jun和c-Fos的表达,并且GA剂量越高,其抑制越明显;同时GA也诱导了p53的核聚集.与未分化细胞相比,在相同剂量GA处理后分化细胞中c-Jun和c-Fos的表达均比未分化细胞略高;但是分化细胞中p53的核聚集却不如前者明显.提示未分化细胞对同样剂量的GA比分化细胞更敏感,可能与分化细胞能抵抗GA引起的c-Jun、c-Fos的降低以及p53的核聚集有关.
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单纯疱疹病毒2型潜伏感染激活模型的建立及潜伏相关转录子开放读码框架抑制后对潜伏相关转录子基因表达的影响
目的 研究单纯疱疹病毒2型(HSV-2)潜伏感染激活中潜伏相关转录子(LAT)开放读码框架(ORF)抑制后对LAT基因表达的影响。方法 建立HSV-2潜伏感染复发的神经细胞(SHSY5Y)模型。运用相差显微镜观察HSV-2潜伏及激活后SH-SY5Y细胞形态的变化。对病毒在细胞中的潜伏及激发进行PCR验证并测序。设计3对siRNA，激活诱导后转染SH-SYSY细胞，相差显微镜观察细胞形态变化，RT-PCR半定量检测转染前后LAT ORF表达的改变。结果在存在60 μmol/L阿昔洛韦(ACV)的环境，HSV-2在SH-SY5Y细胞中建立潜伏状态。病毒在SH-SY5Y细胞中长可潜伏14d。43℃ 1.5 h诱导病毒潜伏激发，而相差显微镜观察发现，病毒激发后细胞病变从24h到72 h，细胞变性、坏死的程度、数量随感染时间延长而增加。HSV-2 LAT、糖蛋白G(gG)基因PCR扩增及电泳结果证实病毒在细胞中的潜伏及激活。LAT ORF-siRNA转染细胞后，LAT ORF mRNA的表达水平在转染后24、36和48 h分别减少了39％、51％和60％。结论 抑制LAT ORF后能够抑制HSV-2 LAT基因的表达，为进一步研究LAT ORF在病毒潜伏感染复发中的作用提供了依据。
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低浓度活性氧对多巴胺能神经元增殖的影响
目的 探讨低浓度活性氧对多巴胺能神经元增殖的影响.方法 实验组分别用低浓度(10、20和30 μmol/L)过氧化氢(H2O2)干预人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y 24 h,对照组加入等体积培养基.应用MTT法检测各组细胞活性;比色法测定各组细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放率.结果 低浓度H2O2干预SH-SY5Y细胞24 h后,10 μmol/L H2O2组、20 μmol/L H2O2组和30 μmol/L H2O2组吸光度A570值分别为1.011 2±0.015 3、1.119 1±0.035 3和1.027 1±0.035 2,与对照组(0.959 0±0.034 7)比较,差异均有统计学意义(均P＜0.05);10、20和30 μmol/L H2O2组之间两两比较,差异均有统计学意义(F=18.727,P＜0.05),其中20 μmol/L H2O2组促进SH-SY5Y细胞增殖效果为明显.10、20和30 μmol/L H2O2组LDH释放率分别为(26.00±1.09)％、(24.62±0.77)％、(25.88±0.95)％,与对照组LDH释放率(27.86±1.31)％相比,差异均具有统计学意义(均P＜0.05);10、20和30 μmol/L H2O2组之间两两比较,差异无统计学意义(F=3.254,P=0.074).结论 低浓度活性氧可能对多巴胺能神经元的增殖有促进作用.
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miRNA370靶向FOXO1对流行性乙型脑炎病毒感染神经元细胞的调控作用
目的 探讨miRNA 370在流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)感染神经元细胞过程中的调控作用及其对病毒复制的影响. 方法 将SH-SY5Y细胞以MOI=1感染JEV,分别在感染后12、24、48 h收集细胞,通过计数空斑数量计算病毒滴度,采用2-△△Ct法测定miRNA 370相对表达水平;将SH-SY5Y细胞转染miRNA 370mimics后感染JEV,检测miRNA 370表达变化对病毒复制变化的影响;采用双荧光素酶报告系统验证miRNA 370对其预测靶基因Forkhead box protein O1 (FOXO1)的直接靶向性;转染miRNA 370 mimics/inhibitors后检测FOXO1表达变化. 结果 SH-SY5Y细胞感染JEV后miRNA 370表达显著降低.miRNA 370 mimics/inhibators转染后检测显示,miRNA370能影响JEV的复制水平.FOXO1作为miRNA370潜在靶基因,在SH-SY5Y细胞感染JEV后表达降低.双荧光素酶报告系统验证,miRNA370通过直接与FOXO1 3'-UTR区结合发挥作用.miRNA 370 mimics/inhibators转染后检测显示,miRNA 370能影响FOXO1的表达和JEV的复制. 结论 miRNA 370作为JEV感染的关键分子,在FOXO1相关免疫调节中发挥重要作用,具有潜在的开发应用价值.
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miR-1976在帕金森综合征中的作用
目的 探讨miR-1976在帕金森综合征(PD)中的作用.方法 选取人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y,随机将细胞分为四组,空白对照组、模型组、miR-1976抑制剂(inhibitor)转染组和空白转染组.空白对照组常规培养,不做处理,模型组采用1-甲基-4-苯基吡啶离子诱导SH-SY5Y细胞建立PD细胞模型,miR-1976 inhibitor转染组转染miR-1976 inhibitor质粒,空白转染组转染空白质粒.采用MMT法检测各组细胞增殖,流式细胞仪检测各组细胞凋亡,荧光定量PCR检测自噬相关基因Beclin1、LC3 Ⅰ/ⅡmRNA表达,Western blot检测各组Beclin1、LC3 Ⅰ/Ⅱ蛋白表达.结果 模型组和miR-1976 inhibitor转染组培养24h、48 h和72 h时OD值明显低于空白对照组和空白转染组(P＜0.05);模型组和miR-1976 inhibitor转染组细胞凋亡率分别为(14.221±2.816)％和(11.016±2.910)％,明显高于空白对照组和空白转染组(P＜0.05);模型组和miR-1976 inhibitor转染组Beclin1 mRNA和LC3 Ⅰ/ⅡmRNA相对表达明显高于空白对照组和空白转染组(P＜0.05),而miR-1976相对表达量明显低于空白对照组和空白转染组(P＜0.05);模型组和miR-1976 inhibitor转染组Beclin1、LC3 Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白相对表达明显高于空白对照组和空白转染组(P＜0.05).结论 miR-1976在PD中有重要作用,miR-1976低表达可抑制神经细胞增殖,促进细胞凋亡及自噬.
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丁苯酞通过混合谱系激酶3信号通路对1-甲基-4-苯基-吡啶离子诱导的SH-SY5Y细胞增殖和凋亡的影响
目的 探讨丁苯酞对1-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP+)诱导的SH-SY5Y细胞混合谱系激酶3(MLK3)通路的影响,及其对细胞增殖与凋亡的作用机制.方法 对数生长期SH-SY5Y细胞分为对照组、MPP+组、丁苯酞组和URMC-099组,对照组正常培养,MPP+组加1 mmol/L MPP+培养24 h,丁苯酞组予10μmol/L丁苯酞预处理3 h后,加入MPP+培养24 h,URMC-099组予200 nmol/L MLK3通路特异性抑制剂URMC-099预处理3 h后,加入MPP+培养24 h.倒置相差显微镜观察细胞形态,噻唑蓝比色法检测细胞活性,Annexin-V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率,Hoechst33342荧光染色法观察凋亡细胞,Western blotting检测MLK3磷酸化蛋白(p-MLK3)、c-Jun氨基末端激酶磷酸化蛋白(p-JNK)和细胞外调节蛋白激酶磷酸化蛋白(p-ERK1/2)的表达.结果 MPP+组细胞存活率低于对照组(P<0.05),丁苯酞组和URMC-099组细胞存活率高于MPP+组(P<0.05);MPP+组细胞凋亡率高于对照组(P<0.05),丁苯酞组和URMC-099组细胞凋亡率低于MPP+组(P<0.05);与对照组相比,MPP+组p-MLK3、p-JNK蛋白表达量增加(P<0.05),p-ERK1/2蛋白表达量降低(P<0.05);与MPP+组相比,丁苯酞组和URMC-099组p-MLK3、p-JNK蛋白表达量降低(P<0.05), p-ERK1/2蛋白表达量升高(P<0.05).结论 丁苯酞可减少MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡,促进细胞增殖,其机制可能是通过抑制MLK3通路,调节下游p-JNK、p-ERK1/2蛋白表达.
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丁苯酞对1-甲基-4-苯基吡啶离子诱导细胞自噬的影响
目的：研究丁苯酞对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导的SH-SY5Y细胞自噬相关因子的影响，探讨丁苯酞对帕金森病细胞模型的神经保护作用机制。方法将SH-SY5Y细胞分为空白对照组(A组)、MPP+组(B组)、雷帕霉素预处理+MPP+组(C组)和丁苯酞预处理+MPP+组(D组)。采用噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞相对存活率，倒置相差显微镜观察细胞形态的变化，Western blotting检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)-Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1蛋白表达，RT-PCR检测LC3-Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1 mRNA表达。结果 B组SH-SY5Y细胞存活率显著低于A组(t=20.270, P<0.001)，C组和D组显著高于B组(t>8.770, P<0.001)，且C组和D组间无显著性差异(t=2.270, P=0.064)。与A组相比，B组LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1蛋白和mRNA表达明显增加(t>6.647, P<0.01)；C组和D组明显高于B组(t>3.630, P<0.01)，C组与D组间无显著性差异(t<2.238, P≥0.05)。结论丁苯酞可以提高MPP+诱导的SH-SY5Y损伤细胞存活率，其可能通过诱导帕金森病模型细胞自噬，发挥治疗作用。
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丁苯酞对SH-SY5Y细胞凋亡的影响
目的：探讨丁苯酞对l-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP+)诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的影响。方法 SH-SY5Y细胞加入1μmol/L、10μmol/L、20μmol/L丁苯酞培养2 h，加入MPP+培养24 h。台盼蓝染色检测SH-SY5Y细胞存活率；罗丹明123染色检测线粒体膜电位的变化；ELISA检测胞浆P53的含量；Western blotting检测胞浆细胞色素C (CytC)、P53的表达。结果随丁苯酞剂量提高，SH-SY5Y细胞存活率提高(P<0.05)，线粒体膜电位降低(P<0.05)，P53和CytC蛋白表达下降(P<0.05)。结论丁苯酞能够抵抗MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡，其机制可能是通过抑制P53、CytC的表达，增加细胞线粒体膜稳定性。
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APP5肽类似物165对链脲佐菌素损伤SH-SY5Y细胞的保护作用
目的 探讨体外APP5肽类似物165(下称P165)对链脲佐菌素(STZ)损伤SH-SY5Y细胞的保护作用.方法 STZ 0.8mmol/L作用于SH-SY5Y细胞的损伤模型.通过测定噻唑蓝(MTT)代谢率、乳酸脱氢酸(LDH)漏出率,瑞氏染色观察细胞形态,Western blot检测相关蛋白,观察P165的保护作用.结果与正常对照组细胞的MTT代谢率(1.00±0.01)和LDH漏出率(201.56±47.54)比较,STZ损伤组细胞MTT代谢率降低(0.84±0.01),LDH漏出率升高(317.83±76.95),差异有统计学意义(P<0.05),细胞胞体面积缩小,胰岛素信号通路相关蛋白IRS-1、PI3K表达减少;P165 30μmol/L组细胞MTT代谢率升高(0.91±0.01),LDH漏出率降低(228.53±35.65),细胞形态恢复正常,胰岛素信号通路相关蛋白IRS-1、PI3K表达恢复正常.结论 体外STZ与SH-SY5Y细胞共孵育,可能影响胰岛素/胰岛素受体信号转导系统对细胞的促生长作用,而P165可能通过激活该信号通路逆转这种损伤,可作为一种神经营养因子起到保护作用.
关键词： APP5肽类似物165 链脲佐菌素 SH-SY5Y细胞 胰岛素信号通路 -
神经节苷脂(GM-1)对体外培养SH-SY5Y细胞兴奋性氨基酸毒性损伤的作用
目的探讨神经节苷脂(GM-1)对体外培养 SH-SY5Y 细胞兴奋性氨基酸毒性损伤的保护作用. 方法采用细胞培养法,以神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系为材料,制备兴奋性氨基酸Glu毒性损伤的离体细胞损伤模型.通过细胞形态学观察、MTT法测定细胞存活率观察不同浓度及不同时间GM-1对上述损伤细胞的保护及治疗作用.结果 GM-1可增强SH-SY5Y细胞的存活,抑制兴奋性氨基酸对细胞的损伤.与损伤组相比GM-1治疗组均好于损伤组,且GM-1高浓度组好于低浓度组.GM-1对损伤SH-SY5Y细胞MTT代谢率的影响显示,相同浓度GM-1作用不同时间相比较12 h优于6 h,24 h与12 h无明显差异.结论 GM-1可促进神经细胞生存, 对神经细胞具有明显保护作用.
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远志寡糖酯化合物的神经保护作用及初步构效关系研究
目的 研究远志中寡糖酯类化合物的神经保护作用和探讨化合物的初步构效关系.方法 采用MTT法和BrdU标记法评价寡糖酯单体化合物对神经细胞的保护作用.结果 在体外皮质酮诱导的SH-SY5Y神经细胞损伤模型上,化合物tenifoliside A、tenuifoliose J、tenuifolioses A、1-o-(E)-Benzoyl-[ 3-o-(E)-Alphatolluyl]-β-D-fructofuranosy-(2→1)-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)]-α-D-gluc-opyranosid表现出了很好的神经保护作用,并呈一定的剂量依赖性.结论 远志寡糖酯类化合物对皮质酮诱导损伤的SH-SY5Y神经细胞有保护作用,其保护作用强弱与化合物类型及其浓度,化合物的母核结构,取代基位置和取代基种类有关.
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广藿香醇对β-淀粉样蛋白神经毒性的抑制作用
目的 研究雌激素受体β亚型(estrogen receptor β,ERβ)选择性激动剂广藿香醇(patchouli alcohol,PA)对β-淀粉样蛋白(β-amyloid peptide,Aβ)片段神经毒性的体外抑制作用.方法 Aβ25～35位氨基酸片段(Aβ25～35 )作用于人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)之前不同浓度PA预防给药,荧光探针法检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平和细胞内钙离子浓度([Ca2+]i),流式细胞术检测细胞凋亡率.结果 PA (0.05、0.5、5 μg · ml-1)能够抑制Aβ25～35引起的细胞内ROS水平和[Ca2+]i升高,使细胞凋亡减少.结论 PA对Aβ25～35的神经毒性具有抑制作用.
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黄芩苷通过上调SIRT1保护SH-SY5Y氧化应激的损伤
观察黄芩苷(baicalin,BL)对过氧化氢诱导SH-SY5Y细胞损伤的作用,并初步探讨SIRTI是否是其发挥作用的靶点及其可能机制.培养的人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞加入黄芩苷(25、50及100 μmol·L-1)预孵育12h,加入H2O2(150 μmol·L-1)作用24 h诱导产生氧化损伤,应用MTT比色法检测细胞存活率,测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、一氧化氮(NO)含量；并采用流式细胞仪检测细胞凋亡及应用免疫荧光组化法检测Caspase-3的活性、RT-PCR检测SIRT1水平.结果表明,与H2O2模型组比较,黄芩苷(50和100 μmol·L-1)组的细胞存活率增高(p＜ 0.05、P＜ 0.01),而LDH、NO的释放量及细胞凋亡数(p＜0.05、p＜0.01)、Caspase-3的表达量均减少;SIRT1 mRNA表达明显(P＜ 0.05、P＜ 0.01).黄芩苷对H2O2损伤的SY5Y细胞具有保护作用,可减轻神经细胞的损伤、抑制细胞的凋亡,其作用机制可能是通过上调SIRT1水平而抑制Caspase-3表达实现的.
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蜗牛多肽混合物抗过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞损伤的作用
目的 观察蜗牛多肽混合物对过氧化氢(H2O2)诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤的抑制作用及其可能机制.方法 用H2O2诱导SH-SY5Y细胞损伤,MTT法测定细胞存活率；39～ 1250 mg·L-1蜗牛多肽混合物处理后,Hoechst染色检测细胞凋亡；罗丹明123染色检测线粒体通透性；细胞免疫化学技术和Westernblot技术分别检测增殖细胞核抗原(PCNA)和脑源性神经营养因子(BDNF)的表达.结果 1.54 mmol· L-H2 02可诱导SH-SY5Y细胞凋亡.用39 ～ 156 mg·L-1浓度的蜗牛多肽混合物处理后,H2O2诱导的SH-SY5Y细胞凋亡数量明显减少,同时可减少H2O2引起的线粒体通透性增加,升高PCNA与BDNF的表达(P＜0.01).结论 蜗牛多肽混合物可抑制过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞凋亡,其作用机制可能与其增加细胞PCNA与BDNF的表达有关.
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丁氟螨酯对SH-SY5Y细胞的毒性作用及其机制
目的 研究丁氟螨酯对人经神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞的毒性作用及其机制.方法 加入丁氟螨酯0.03,0.06,0.125,0.25,0.5,1,2,2.6,4,6,8和16 mmol·L-1处理SH-SY5Y细胞48 h,MTT法测定细胞存活;DCFH-DA荧光探针标记法检测细胞内活性氧(ROS)水平;JC-1标记法检测细胞线粒体膜电位;Hoechst 33258染色观察细胞核形态;碘化丙啶(PI)染色和流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡;Western蛋白印迹法检测磷酸化P38蛋白(p-P38)和磷酸化Jun激酶(p-JNK)表达水平.结果 与溶剂(DMSO)对照组相比,共孵育48 h后,丁氟螨酯≥0.06 mmol·L-1时可降低细胞存活率(P<0.05),且随浓度增高细胞存活率有降低趋势,IC50为2.6 mmol·L-1;丁氟螨酯1,2,4和6 mmol·L-1组细胞ROS水平升高(P<0.01),线粒体膜电位下降(P<0.01).Hoechst 33258染色结果显示,丁氟螨酯2,4和6 mmol·L-1组SH-SY5Y细胞出现颗粒状荧光,细胞核固缩和崩解;流式细胞仪检测结果显示,丁氟螨酯2,4和6 mmol·L-1组细胞凋亡率由DMSO对照组的(0.7±0.1)%分别上升至(6.7±0.1)%,(72.4±8.6)%和(90.7±3.2)%(P<0.01);丁氟螨酯4和6 mmol·L-1组G1期细胞较DMSO对照组明显增加(P<0.01);Western蛋白印迹结果表明,丁氟螨酯4和6 mmol·L-1组p-JNK表达均升高(P<0.01),丁氟螨酯6 mmol·L-1组p-P38表达水平增加(P<0.01).结论 丁氟螨酯可能通过氧化损伤、激活P38蛋白和JNK蛋白诱导SH-SY5Y细胞G1期阻滞和凋亡.
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丹酚酸C对Mpp+损伤的SH-SY5Y细胞氧化应激和凋亡的抑制作用
目的 研究丹酚酸C对Mpp+诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用.方法 SH-SY5Y细胞与丹酚酸C(0.1,1.0和5.0 μmol·L-1)或阳性药N-乙酰半胱氨酸(NAC)5 mmol·L-1孵育2h后加入MPP+ 500 μmol·L-1,继续培养24 h.MTT法检测细胞存活率,AO/EB染色观察细胞形态及凋亡,应用DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧(ROS)水平,线粒体超氧化物指示剂(MitoSOX)特异性探针检测线粒体超氧化物水平,JC-1检测线粒体膜电位,免疫荧光法测定NADPH氧化酶2(NOX2)的表达,免疫荧光和Western蛋白质印迹法检测细胞色素c,Bcl-2,Bax和活化的胱天蛋白酶3的表达水平.结果 MPP+ 500 μmol· L-1损伤导致细胞存活率显著降低(P＜0.01),丹酚酸C(1.0和5.0 μmol· L-1)及NAC(5 mmol·L-1)能够逆转Mpp+损伤,显著提高细胞存活率(P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01).丹酚酸C(1.0和5.0 μmol· L-1)能够显著减少Mpp+诱导的细胞总ROS增加(P＜0.01),维持Bax/Bcl-2表达平衡(P＜0.01),减缓线粒体膜电位降低(P＜O.05,P＜0.01),减少细胞色素c的释放(P＜0.01)及胱天蛋白酶3的活化(P＜0.05,P＜0.01).同时,丹酚酸C(0.1,1.0和5.0 μmol· L-1)能够明显抑制NOX2的表达(P＜0.01),降低线粒体内超氧化物水平(P＜0.01),改善Mpp+引起的细胞氧化应激状态.结论 丹酚酸C能够抑制Mpp+诱发的SH-SY5Y细胞氧化应激及其介导的细胞凋亡.
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肌肽对高糖诱导SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用
目的 探讨肌肽对高糖诱导的人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞凋亡的保护作用及其机制.方法 SH-SY5Y细胞用含葡萄糖50 mmol·L-1的高糖培养液和肌肽0.6,3和15 mmol· L-1的培养液培养48 h,相差显微镜下观察细胞形态的变化;MTT比色法测定细胞存活率;Hoechst33258染色观察细胞核形态的变化;流式细胞仪检测细胞凋亡率;CDFH-DA探针法检测细胞中活性氧(ROS)的水平,酶联免疫吸附法检测细胞上清液中8-羟基脱氧鸟苷酸(8-OHdG)的含量.结果 与正常组(低糖培养基)相比,高糖组细胞存活率明显降低(P ＜0.01);Hoechst33258染色发现细胞核固缩裂解,呈凋亡特征性改变;细胞凋亡率、细胞中ROS的水平、上清液中8-OHdG的分泌量明显升高(P＜0.01).与高糖组相比,肌肽0.6,3和15 mmol·L-1组细胞存活率明显升高(P＜0.01);Hoechst33258染色发现细胞核核固缩裂解减少,形态明显改善;细胞凋亡率分别降低至(20.65±1.13)％,(14.95±0.64)％和(9.95±0.61)％(P＜0.01);细胞中ROS的水平分别降低至(182±16)％,(168±15)％和(140±10)％(P＜0.05);上清液中8-OHdG的分泌量均明显降低,分别为2.780 ±0.154,2.136 ±0.100和(1.864 ±0.151)μg·L-1(P＜0.01).单纯肌肽组的细胞存活率、细胞核形态以及细胞凋亡率与正常组相比无显著差异,细胞中ROS水平和上清液中8-OHdG的分泌量均有所降低,分别为(88±9)％和(0.380 ±0.023)μg·L-1(P＜0.05).甘露醇组的各项指标与正常组相比无显著差异.结论 肌肽对高糖诱导的SH-SY5Y细胞凋亡具有保护作用,其机制可能与肌肽的抗氧化作用有关.
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梓醇对乳胞素诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用
目的 探讨梓醇对蛋白酶体抑制剂乳胞素诱导的人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞损伤的保护作用及其可能机制.方法 梓醇10 μmol·L-1预处理SH-SY5Y细胞lh后,加入乳胞素10 μmol·L-1继续处理24 h.倒置显微镜下观察细胞形态的变化,MTT比色法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Hoechst33258染色观察细胞核形态的变化,酶联免疫吸附检测细胞内20S蛋白酶体含量.结果 与正常对照组相比,梓醇10 μmol·L-1对细胞存活率、形态和凋亡及20S蛋白酶体含量无显著差异；乳胞素10 μmol·L-组细胞存活率为(72.0±1.8)％,明显降低(P＜0.05),细胞凋亡率为(64.7±2.6)％,明显增高(P＜0.05).Hoechst33258染色发现梓醇细胞核形态改变,出现凋亡小体；细胞内20S蛋白酶体含量降低60％,差异具有统计学意义(P＜0.05).与乳胞素10 μmol· L-1组相比,梓醇10μmol· L-1预处理组细胞存活率(87.9±2.2)％明显增高(P＜0.05),细胞凋亡率为(51.4±1.5)％,明显降低(P＜0.05).Hoechst33258染色发现,梓醇细胞核形态明显改善；细胞内20S蛋白酶体含量升高了1.9倍,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 梓醇对乳胞素诱导的SH-SY5Y细胞损伤具有保护作用,其机制可能与梓醇提高SH-SY5Y细胞内20S蛋白酶体含量有关.
