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人胚胎甲状腺褪黑素受体的鉴定及生物学特性
目的:应用免疫组化和核酸原位杂交技术检测人胚胎甲状腺的MEL受体及其亚型,为进一步研究MEL对甲状腺功能的调节作用提供证据.方法:1.研究对象:中期水囊引产人胎儿,取出甲状腺,立即用4%多聚甲醛+0.1%DEPC固定,石蜡包埋组织,4℃冰箱贮存待检测.
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特异、灵敏的人血清甲转状腺蛋白单克隆抗体ELISA方法的建立
目的:甲状腺球蛋白(thyroglobulin, Tg)是甲状腺滤泡上皮细胞合成的一种糖蛋白,分子量为660 kD,沉降系数为19S.在正常生理情况下有一小部分进入血液循环,在某些病理情况下,如甲状腺机能亢进、甲状腺癌、亚急性甲状腺炎及地方性甲状腺肿等症可因甲状腺滤泡上皮细胞被破坏或通透性增加,而引起血中Tg水平的增高.Tg在血中的含量甚微,目前多采用放射免疫技术检测,但因该法受到一些条件限制,不能广泛应用.本文建立了TgMcAb ELISA双抗体加心法,提高了检测的特异性,灵敏度.其灵敏度为1ng/mL;批内变异系数为5.30%±0.01%(n=40),批间变异系数为6.70%±0.02%(n=10),116名健康献血者有72.4%含有甲状腺球蛋白.该法操作简便,便于推广应用.对科研及临床上甲状腺的诊断和疗效判断上有一定的实用价值.
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双歧杆菌胞壁蛋白诱导人肠腺上皮细胞β- 防御素-2基因表达及其信号转导机制
目的:本项研究目的是检测双歧杆菌对人肠腺上皮细胞hBD-2基因的激活作用并分离其活性组分,进一步探讨其受体及其胞内信号传导通路.方法:厌氧培养长双歧杆菌,采用超声破碎细胞、超速离心、蛋白萃取方法获得双歧杆菌胞壁蛋白质成份,利用SepharylS-100HR分子筛分离细胞壁蛋白.分别利用活菌,热灭活全菌,全细胞壁组份和全细胞壁蛋白组分,刺激人肠腺上皮细胞Caco-2,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法、Northem杂交、免疫细胞化学染色和ELISA等技术在mRNA和肽水平上检测hBD-2基因的表达.应用Westem Blotting技术检测到IκB-α磷酸化和降解、NF-κBp65的核移位以及细胞内MAPKs蛋白分子ERK1/2、p38 MAPK和JNK的磷酸化.
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Tau蛋白在缺氧/复氧诱导的PC12细胞凋亡中的机制初探
目的:初步探讨缺氧/复氧( hypoxia/reoxygenation,H/R)诱导PC12细胞凋亡模型中tau蛋白及其磷酸化水平、凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达情况。方法:类神经元PC12细胞体外培养并传至第三代,进行相应处理,实验分组为正常对照组( control组)、模型组( H/R组)。 Annexin V-PI双染流式细胞术分别检测各组凋亡率以确定模型是否成功;造模成功后,使用RIPA裂解液提取蛋白;Western blotting技术检测各组tau蛋白及其磷酸化、Bax和Bcl-2的表达变化。结果:与control组相比,H/R组细胞凋亡率显著升高( P<0.05),提示模型构建成功;Westem blotting结果显示,与control组相比,H/R组中tau蛋白表达显著减少(P<0.05),且tau蛋白Ser202位点的磷酸化水平显著升高(P<0.05),Bax/Bcl-2显著升高(P<0.05)。结论:Tau蛋白可能参与了缺氧/复氧诱导的神经细胞凋亡,其机制有待深入研究。
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辣椒素改善高糖诱导的AD样tau蛋白磷酸化的作用及机制
目的:研究辣椒素对tau蛋白磷酸化的作用及机制。方法:40只小鼠随机分为4组:饲料+自来水饲养组、饲料+20%蔗糖水饲养组、含0.01%辣椒素的饲料+20%蔗糖水饲养组和含0.01%的辣椒素饲料+自来水饲养组。24周造模成功后,水迷宫实验检测学习记忆能力的改变;电生理技术检测长时程增强( LTP)的改变;免疫印迹和免疫组化检测GSK-3β、tau蛋白多个AD相关位点的磷酸化水平变化;检测GSK-3β活性。结果:长期高糖饮食造成:(1) tau蛋白的多个AD相关磷酸化位点的磷酸化水平升高;(2)LTP诱导障碍、突触可塑性减弱;(3)GSK-3β活性升高;(4)空间学习记忆障碍。同时长期给予辣椒素饮食,可减轻高糖饮食引起上述AD样变化。结论:长期高糖饮食可通过激活GSK-3β引起tau蛋白多个AD相关位点的磷酸化;长期给予辣椒素缓解AD样病理变化和症状。
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生物钟基因Clock通过调节前脂肪细胞增殖抑制脂肪形成的作用及机制研究
目的:探讨Clock蛋白通过对前脂肪细胞3T3-L1增殖的调节来促进细胞成脂的作用和机制。方法:利用RNAi或Clock的高表达病毒载体,分别在3T3-L1中低表达或高表达Clock基因。 CCK-8检测细胞增殖,利用RT-PCR和Western blot技术检测相关细胞周期蛋白和Clock蛋白的表达情况。利用染色质免疫共沉淀技术检测Clock蛋白对Wnt信号通路关键因子的转录调节作用。结果:Clock蛋白可以促进3T3-L1细胞的增殖;同时在Clock基因低表达的3T3-L1细胞和ClockΔ19小鼠脂肪组织中,促进细胞周期进行的关键调控因子细胞周期蛋白D1、c-Myc和增殖细胞核抗原( PCNA)的表达受抑制。低表达Clock基因的3T3-L1细胞中,β-连环蛋白(β-catenin)表达量降低;ChIP结果发现Clock蛋白可与β-catenin、Dvl2(dishevelled 2)和c-Myc上游启动子结合,调控其转录激活,Wnt信号通路抑制剂可以抑制Clock蛋白促进细胞增殖的作用。结论:Clock蛋白可以通过调控Wnt信号通路来促进前脂肪细胞增殖,并进一步抑制脂肪分化程序的启动,抑制细胞成脂。
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切应力诱导内皮细胞表达IL-8基因的信号转导
目的:现已确定动脉粥样硬化是一种炎症疾病,单核/巨噬细胞在动脉内膜下集聚是导致动脉粥样硬化损伤发展的基础;血流低切应力促进其损伤的发展.趋化细胞因子MCP-1对单核/巨噬细胞起强力趋化和激活作用,并有报告切应力可诱导其基因的表达.新近报道在层流作用下IL-8亦是单核/巨噬细胞与内皮细胞相互作用的重要调节因子.本研究旨在观察切应力诱导人脐静脉血管内皮细胞IL-8 mRNA的表达,探讨Toll/NF-κB信号转导通路对其基因激活的介导作用.方法:4.2 dyn/cm2层流切应力处理人脐静脉血管内皮细胞,提取总RNA,应用RT-PCR和Northern杂交技术检测切应力作用不同时间后IL-8、TLR-2和TLR-4 mRNA的表达.免疫印迹技术检测IκB磷酸化和降解.免疫荧光细胞化学染色检测NF-κB胞核易位.结果:切应力作用0.5 h后IL-8 mRNA表达逐渐增高,2 h时达到很高水平.胞浆蛋白IκB和磷酸化IκB的免疫印迹显示4.2 dyn/cm2层流切应力作用10 min后磷酸化IκB水平即显著增加,30 min后又逐渐下降,与之相应IκB含量随切应力作用时间而逐渐下降,到1 h时几乎测不出,表明在切应力作用下内皮细胞胞浆NF-κB抑制因子IκB发生了磷酸化和降解.NF-κBp65亚基免疫细胞化学染色显示在4.2 dyn/cm2切应力作用0.5 h后内皮细胞核逐渐着色,1.5 h时细胞核几乎全着色,表明胞浆NF-κB在切应力作用下发生了易位,从胞浆进入胞核.RT-PCR检测和Northern杂交分析显示内皮细胞固有表达TLR-2和TLR-4 mRNA,在4.2 dyn/cm2切应力作用1 h后TLR-4 mRNA的表达显著增强,而TLR-2 mRNA的表达变化不明显.结论:流体切应力可诱导血管内皮细胞表达IL-8,活化转录因子NF-κB.在切应力作用下内皮细胞TLR-4 mRNA表达增强,提示Toll/NF-κB信号转导通路可能参与动脉粥样硬化性炎症反应.
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甘氨酸对脂多糖诱导LBP/CD14 mRNA表达的影响
目的:内毒素是位于革兰氏阴性杆菌(G-)细胞壁外膜中具有高度生物学活性的以脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)为主的成分.LBP(lipopolysaccharide-binding protein)/CD14(cluster of differentiation 14)系统在识别和调控LPS作用方面起着关键作用.甘氨酸是体内固有的简单的氨基酸,本教研室在先前的研究中发现甘氨酸对LPS的致热性有良好的拮抗作用,体外研究发现甘氨酸能破坏内毒素的构型,抑制内毒素诱导单核/巨噬细胞分泌TNF、IL-1等细胞因子.本研究是在前面研究的基础上进一步探讨甘氨酸对内毒素体内作用过程的影响,从而为研制有效的内毒素拮抗剂提供理论依据.方法:用RT-PCR技术检测大鼠肝组织LBP mRNA表达水平,并在此基础上观察甘氨酸对内毒素诱导大鼠肝组织LBP mRNA表达的影响.用原位杂交方法检测小鼠腹腔巨噬细胞CD14 mRNA表达水平,并在此基础上观察甘氨酸对内毒素诱导小鼠腹腔巨噬细胞CD14 mRNA表达的影响.结果:比较5组大鼠肝组织LBP mRNA的表达水平,内毒素组显著高于其他各组(P<0.01),甘氨酸拮抗组显著低于内毒素组(P<0.01),但甘氨酸拮抗组仍高于对照组.比较5组小鼠腹腔巨噬细胞的CD14 mRNA表达水平,内毒素组小鼠腹腔巨噬细胞CD14 mRNA表达水平显著高于其他各组(P<0.01),甘氨酸拮抗组显著低于内毒素组(P<0.01).结论:(1)内毒素可诱导大鼠肝组织LBP mRNA的表达.(2)甘氨酸可抑制内毒素诱导大鼠肝组织LBP mRNA的表达.(3)内毒素可诱导小鼠腹腔巨噬细胞CD14 mRNA的表达.(4)甘氨酸可抑制内毒素诱导小鼠腹腔巨噬细胞CD14 mRNA表达.
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下调Sam68基因表达促进急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞凋亡
目的:探讨Sam68蛋白对白血病细胞Jurkat凋亡的影响。方法:针对Sam68靶点构建pLKO-Tet-On条件性真核表达干扰载体,制备慢病毒并感染Jurkat细胞,诱导干扰载体表达,筛选稳定表达shRNA细胞;采用实时荧光定量和免疫印迹技术检测干扰效率;应用流式细胞术检测细胞凋亡,采用免疫印迹技术检测凋亡相关蛋白表达水平变化情况。结果:Sam68基因表达下调的细胞凋亡数量增多,伴随caspase-3活化水平增加和PARP活化水平下降,Akt磷酸化水平下降,Erk和Bcl-xL表达水平无明显变化。结论:Sam68基因表达下调可通过影响Akt信号通路影响caspase-3和PARP蛋白表达,从而促进Jurkat细胞凋亡。
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银杏叶提取物EGb761诱导人结肠癌细胞凋亡的分子机制
目的:探究银杏叶提取物EGb761对人结肠癌细胞的增殖抑制、诱导凋亡及其作用机制。方法:体外培养12株人结肠癌细胞,给予不同浓度EGb761(0~600 mg/L)作用24 h,采用MTT、集落生成实验以及流式细胞术检测给药处理后结肠癌细胞的增殖和凋亡情况。通过Western blot技术检测RIP-1分子表达水平和凋亡标志物PARP的表达水平变化。利用ELISA技术检测NF-κB信号通路的活性。结果:EGb761在较低浓度(400 mg/L)可以抑制结肠癌细胞的增殖,并诱导肿瘤细胞发生凋亡。随着药物浓度的增加,EGb761诱导结直肠癌细胞凋亡率也随之增加。 EGb761作用于结肠癌细胞后可导致凋亡相关蛋白RIP-1的降解。同时 EGb761通过抑制 I-κB 磷酸化而抑制 NF-κB 信号通路促细胞增殖的作用。结论:银杏叶提取物( EGb761)能广泛抑制人结肠癌细胞的增殖,并诱导人结肠癌细胞发生凋亡,研究结果提示凋亡发生的机制与细胞内RIP-1的降解以及NF-κB信号通路的活性降低有关。
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4-HPR联合应用小白菊内酯对宫颈癌HeLa细胞凋亡的作用
目的:研究4-羟基维胺酯( N-4-hydroxyphenyl retinamide,4-HPR)联合应用小白菊内酯对宫颈癌HeLa细胞的生长抑制率及诱导凋亡作用,并探讨其凋亡机制。方法:体外培养宫颈癌HeLa细胞,实验分为4个组:对照组、单用小白菊内酯组、单用4-HPR组和4-HPR联合应用小白菊内酯组。采用MTT法检测药物对宫颈癌HeLa细胞的生长抑制率;在倒置显微镜下观察药物对宫颈癌HeLa细胞的形态学变化;利用流式细胞仪技术检测细胞凋亡率;Western blot方法检测内质网应激相关蛋白GRP78与GADD153的表达。结果:4-HPR联合应用小白菊内酯与单用药组相比有明显的抑制细胞增殖及促进细胞凋亡作用;联合用药与单用药组相比GRP78与GADD153蛋白表达明显上调。结论:小白菊内酯增强4-HPR诱导的宫颈癌HeLa细胞凋亡作用,其凋亡机制与可能与内质网应激相关。
目的:研究4-羟基维胺酯( N-4-hydroxyphenyl retinamide,4-HPR)联合应用小白菊内酯对宫颈癌HeLa细胞的生长抑制率及诱导凋亡作用,并探讨其凋亡机制。方法:体外培养宫颈癌HeLa细胞,实验分为4个组:对照组、单用小白菊内酯组、单用4-HPR组和4-HPR联合应用小白菊内酯组。采用MTT法检测药物对宫颈癌HeLa细胞的生长抑制率;在倒置显微镜下观察药物对宫颈癌HeLa细胞的形态学变化;利用流式细胞仪技术检测细胞凋亡率;Western blot方法检测内质网应激相关蛋白GRP78与GADD153的表达。结果:4-HPR联合应用小白菊内酯与单用药组相比有明显的抑制细胞增殖及促进细胞凋亡作用;联合用药与单用药组相比GRP78与GADD153蛋白表达明显上调。结论:小白菊内酯增强4-HPR诱导的宫颈癌HeLa细胞凋亡作用,其凋亡机制与可能与内质网应激相关。 -
sEH基因敲除小鼠脑缺血再灌注损伤过程中星形胶质细胞的活化和BDNF表达变化
目的:研究花生四稀酸代谢产物EET的水解酶( sEH)基因敲除对脑缺血再灌注损伤、星形胶质细胞活化和BDNF表达变化的影响。方法:分别对sEH-/-小鼠和野生型小鼠进行大脑中动脉栓塞(MCAO)2 h,再灌注24 h。用TTC染色,计算梗死体积。用TUNEL法对缺血皮层半影区凋亡细胞染色和计数。采用免疫组化染色检测BDNF、GFAP、PPAR-γ等分子表达。使用激光共聚焦技术检测BDNF与GFAP、PPAR-γ与GFAP在半影区的共定位。结果:sEH-/-小鼠脑梗死体积明显小于野生型,其半影区的凋亡细胞数量也明显少于野生型。 sEH-/-小鼠半影区的星形胶质细胞显著激活,BDNF表达显著增多,并与活化星形胶质细胞共定位,sEH-/-小鼠半影区高表达PPAR-γ,并与GFAP共定位。阻断BDNF信号通路后,sEH-/-小鼠脑梗死体积和半影区凋亡细胞数量与野生型相近。结论:sEH-/-小鼠缺血皮层半影区星形胶质细胞显著激活,通过合成和表达BDNF,减轻脑缺血再灌注损伤。
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AF9促进心脏祖细胞的生成及机制研究
目的:组蛋白乙酰化修饰是表观遗传调控中重要的调控方式之一,组蛋白乙酰化与基因活化关系密切,其中一个重要环节是被特定阅读器结构域所识别,从而招募染色质调控因子到特定区域,协同完成基因表达调控。 AF9是这类阅读器之一,其
是否参与心脏发育分化还未清楚。因此本研究探讨心脏转录因子联合AF9是否对心脏祖细胞的产生具有促进作用。方法:采用蛋白重组表达方式获得心脏转录因子GATA4、NKX2.5、TBX5(GNT)及AF9,结合纳米转导技术高效转导到目的细胞BM-SCs细胞核内,检测细胞毒性,CPCs的生成效率,组蛋白H3K9乙酰化情况,ChIP-PCR技术检测H3K9ac的作用靶点。结果:心脏转录因子GNT联合AF9能提高BMSCs重编程生成CPCs的效率,在200μg/L/蛋白的工作浓度下,细胞生长良好,与GNT组相比,联合AF9组的H3K9ac表达明显增加,ChIP-PCR的结果显示H3K9ac富集在MEF2C的启动子区域。结论:心脏转录因子组合GNT联合表观遗传调控因子AF9通过纳米-蛋白转导方式,能高效重编程BMSCs得到CPCs,AF9通过上调H3K9ac来促进重编程过程。 -
一氧化氮在防止内皮素-1诱导心肌细胞肥大中的作用
目的在培养的新生大鼠心肌细胞上,探讨一氧化氮(NO)在防止内皮素-1诱导的心肌细胞肥大反应中的作用.方法用Bradford法测定心肌细胞总蛋白含量,用血红蛋白分光分度法测定心肌细胞NOS活性,用硝酸还原酶-Griess试剂显色法测定培养液中NO浓度,用RT-PCR技术检测心肌细胞原癌基因c-fos的表达(以GAPDH为内标).
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血管紧张素Ⅱ、内皮素1及缺氧诱导因子1α在糖尿病肾病肾组织的表达及意义
血管紧张素(Ang)Ⅱ和内皮素1(ET-1)是重要的致炎及纤维化因子,且2者间存在交互作用[1],共同参与糖尿病肾病(DN)肾间质纤维化(RIF)的进程.缺氧诱导因子1α(HIF-1α)是组织缺氧时表达增多的产物.AngⅡ可使肾小管上皮细胞中HIF-1α的表达增加,而ET-1是HIF-1α的下游基因,3者之间密切关联.本研究采用免疫组化技术检测AngⅡ、ET-1及HIF-1α在DN患者肾组织中的表达,探讨其与肾脏损害的关系,为进一步阐明DN的发病机制提供依据.
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人类白细胞抗原Ⅱ类基因与天津汉族2型糖尿病肾病的相关性研究
人类白细胞抗原(HIJA)基因型是迄今为止所知复杂的遗传多态系统,目前l型糖尿病与HIJA-DQA1的关系已比较明确.近年研究显示,2型糖尿病(T2DM)与HLA也存在着一定的关联.本研究应用基因芯片技术检测HLA一Ⅱ类基因,探讨其与T2DM及糖尿病肾病(DN)的相关性.
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利用变性高效液相色谱技术检测PKD2基因多态性
与常染色体显性多囊肾病(ADPKD)相关的两个基因PKD1和PKD2已完成测序.我们利用变性高效液相色谱技术(DHPLC)对80名健康志愿者进行了PKD2基因多态性检测,检测到4个多态性.
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核磁共振波谱技术检测脑干病变1例
脑干恶性度低的胶质瘤在普通核磁共振(MR)上有时与脑干炎表现相似,表现为长T1长T2,难以鉴别.而核磁共振波谱技术(MRS)可通过测定脑中代谢物浓度的改变而鉴别之.N-乙酰天门冬氨酸盐(NAA)代表了神经元的密度,胆碱类化合物(Cho)代表了细胞增值情况.测得的数值反映了病灶里的神经元的数量和其它细胞的数量,对于鉴别脑干炎与低度恶性胶质瘤有明显的意义.本文报告1例MRS在脑干病变诊断中的应用.
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VEGF、Ki67及中期因子在垂体瘤中的表达
垂体肿瘤是成人常见的颅内肿瘤之一,其生物学特性可通过肿瘤的新生血管及增生进一步了解,增生细胞核抗原(Ki67)、血管内皮生长因子(VEGF)及中期因子(midkine,MK)可客观反映肿瘤的生长速度、增生能力和侵袭性.本文通过免疫组织化学技术检测垂体瘤中Ki67、VEGF及MK的蛋白表达,探讨其临床意义.
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心脏微小RNA与心肌肥厚显像
心肌肥厚的后转归是心力衰竭或猝死[1].目前对心肌肥厚的常规检查方法是心脏超声,但超声只在心肌发生形态学改变时才能诊断,而此时临床上对于心肌肥厚的治疗已经无法回到初的状态.近十几年来人们对心肌肥厚的分子病理学特性进行了大量的研究,发现微小RNA(miR)与心肌肥厚关系密切,miR可通过调节特定的信号通路和靶基因促进或抑制心肌肥厚,但目前研究主要集中于利用定量PCR、microarray等技术检测非活体的心肌miR表达量,尚未有利用活体外直观显像法监测miR的表达,实现早期诊断和治疗心肌肥厚.现就miR与心肌肥厚的关系, 以及miR核素显像在早期诊断心肌肥厚的可能性进行综述.