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铁皮石斛转录因子基因DoWRKY1的克隆与表达分析
WRKY转录因子是植物中发现的新型转录调控因子,在调控植物生长发育和代谢等生理过程中发挥重要作用.该研究采用RT-PCR和RACE技术从铁皮石斛Dendrobium officinale中克隆得到一个新的WRKY转录因子基因cDNA全长,命名为DoWRKY1,提交GenBank获得登录号KF716131.生物信息学分析表明,该基因全长cDNA为1 704 bp,其中开放阅读框(ORF)1 629 bp,编码1条由542个氨基酸组成的多肽,具有2个WRKY保守结构域,属于WRKY家族第Ⅰ类转录因子.酵母单杂交表明,DoWRKY1可以激活下游报告基因(His3,Ade2)的表达,具有转录激活功能,属于转录激活子.半定量RT-PCR显示,DoWRKY1在根、茎、叶和类原球茎中均有表达.qRT-PCR分析表明,DoWRKY1响应茉莉酸甲酯(MeJA)和壳聚糖(chitosan)诱导,分别在2h和1h,表达量达到高峰.研究结果为进一步研究其在铁皮石斛次生代谢过程的调控功能奠定基础.
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人参茎叶皂甙增强糖皮质激素受体转录激活效应的实验研究
目的探讨人参茎叶皂甙(ginsenosides-stem-leaves,GSL)对糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)转录激活效应的影响.方法将糖皮质激素受体荧光素酶报告基因pGRE-tk-Luc与内参照基因pRL-SV40共同瞬时转染细胞,利用双荧光素酶报告基因检测方法(Dual-Luciferase Reporter Assay),观察地塞米松(dexamethasone,Dex)和GSL对报告基因表达的影响.结果Dex诱导HL7702细胞内报告基因的表达呈剂量和时间依赖性,Dex的大诱导倍数达93倍.糖皮质激素受体的拮抗剂RU486可以阻断Dex对报告基因的诱导;GSL不能诱导报告基因的表达,但可使Dex对GR报告基因的诱导表达效应提高61.4%.结论在体外GSL能增强Dex对GR的转录激活效应.
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RelB对HIV-1 Vpr转录激活及诱导细胞G2/M期停滞功能影响的初步研究
Vpr是人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus type 1,HIV-1)的辅助蛋白之一,在病毒复制及AIDS进程中起重要作用.为了研究Vpr完成其生物学功能的分子机制,本研究利用酵母双杂交技术,从人的cDNA文库中筛选,并经免疫共沉淀技术证实NF-κB通路中的重要蛋白RelB与Vpr存在相互作用;发现RelB蛋白能促进Vpr介导的对NF-κB报告基因的激活,也能促进Vpr对HIV-1 LTR的反式激活作用.利用流式细胞技术发现RelB促进Vpr诱导细胞周期G2/M期停滞.上述结果表明,RelB辅助Vpr完成其转录激活以及调控细胞周期的功能.
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锌指蛋白ZNF580定位在MGC803细胞核
新基因(AF184939)ZNF580是由本组克隆并于Genbank 注册的C2H2型锌指蛋白转录因子基因,其cDNA 748~1266 bp之间的碱基构成一个完整的开放阅读框,编码172个氨基酸.蛋白功能基序分析表明:其羧基端序列中含有3个重复串联的C2H2型锌指蛋白主构域:CX2CX3FX5LX2HX3H(X代表保守性差的氨基酸),富含脯氨酸残基的氨基端序列为转录激活结构域[1].利用绿色荧光(green fluorescence protein,GFP)在活细胞内的示踪作用[2],我们将GFP与ZNF580cDNA开读框融合,导入胃癌MGC803细胞株中,直观地观察到ZNF580基因在细胞内的表达及亚细胞定位,为阐明新基因ZNF580的功能奠定了基础.
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Wnt5 a作用及信号转导通路研究进展
Wnt5a是Wnt家族成员之一。 Wong等[1]根据Wnt家族成员对小鼠细胞C57MG转化能力的高低将Wnt分为两组,其中高转化能力组Wnt可激活β-catenin依赖性通路,又称Wnt经典信号通路;弱或无转化功能的Wnt包括Wnt5 a等,不依赖β-catenin介导的转录激活,包含了多条信号通路,主要起调控细胞骨架、细胞的极性和迁移等作用,被称为非经典Wnt。近年来研究发现Wnt5 a参与众多的生理、病理活动,如胚胎发育、炎性反应和肿瘤发生发展等,在细胞的极性、定向运动、细胞骨架的变形运动及多种肿瘤的恶性进程中起重要作用。
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含HIV-1 Tat基因重组反转录病毒表达载体构建与表达Tat蛋白功能检测
目的构建含HIV-1 Tat基因重组反转录病毒表达载体及评价表达Tat蛋白的功能. 方法使用HindⅢ将HIV-1 Tat101蛋白编码基因从pEV质粒中切出,插入到表达质粒LZRSpBMN-Z中,构建成重组反转录病毒表达质粒LZRS-Tat101.采用磷酸钙转染法将重组质粒LZRS-Tat101转染进含反转录病毒env、gal和pol编码基因的包装细胞phoenix(ФNX)中,嘌呤霉素筛选获得稳定细胞系.免疫组化(IHC)染色检查Tat在临时转染和稳定转染ФNX细胞中的表达水平.收集临时转染和稳定转染包装细胞分泌的病毒上清,并分别感染293细胞,Western blot检测Tat在293中表达.与此同时,收集感染293细胞培养上清,加入到HL3T1细胞(HeLa-HIV-1-LTR/CAT报告基因)中,共培养72*!h后收集细胞,提取蛋白作CAT活性检测. 结果①含Tat101基因重组反转录病毒表达质粒转染包装细胞后,Tat在临时转染ФNX中表达水平显著高于在稳定转染中的水平;②临时转染病毒感染293细胞,Tat在感染细胞中得到了表达,且分泌至上清中的Tat蛋白能够激活靶细胞HL3T1中HIV-1的LTR启动子,使得其下游的CAT基因得到表达. 结论重组LZRS-Tat101反转录病毒能够在其感染靶细胞中表达Tat蛋白,且表达蛋白具有转录激活功能.
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p53结合蛋白对细胞周期阻滞与细胞凋亡调控的研究进展
p53基因是人体内重要的肿瘤抑制基因,位于人类染色体17p13.1,含有11个外显子,编码的野生型p53蛋白由393个氨基酸残基组成,包含N-末端的转录激活结构域、生长抑制结构域、序列特异的DNA结合结构域(DNA binding domain,DBD)、核定位信号(nuclear localization signal,NLS)、四聚体化结构域和C-末端非专一DNA调节结构域.p53在监视细胞基因组损伤及维持基因组的稳定性中发挥重要作用.当紫外线、电离辐射、氧化应激及癌基因表达等刺激因素引起细胞内DNA损伤时,p53蛋白迅速聚集活化,并作为序列特异性转录因子对一系列靶基因进行调控.
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丙型肝炎病毒核心蛋白与白介素-2启动子的调节
丙型肝炎病毒(HCV)持续感染,增加了肝纤维化和肝细胞癌(HCC)的危险性,其机制与HCV引起机体免疫调节障碍有关.HCV基因表达产物中,高度保守的HCV核心(core)蛋白具有免疫调节功能.辅助性T细胞产生白介素(IL-2),HCV患者IL-2表达分泌异常,与痊愈有明显相关性.研究表明HCV核心蛋白具有转录激活IL-2启动子的作用,本文对此方面的研究作一综述.
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缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞活性氧与缺氧诱导因子1α在细胞增殖中的作用
活性氧可介导基因转录激活的启动和转录因子活性的调节.缺氧诱导因子1α(HIF-1α)是一种核转录因子,在缺氧性肺动脉高压(HPH)形成中起关键作用[1].我们观察缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMC)的活性氧变化,探讨其与HIF-1α和细胞增殖的关系.
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新基因XTP11表达蛋白在酵母细胞中的转录激活功能研究
目的构建乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP11的酵母表达载体,探索应用酵母双杂交系统克隆与XTP11蛋白结合的肝细胞蛋白的可行性.方法用聚合酶链反应(PCR)扩增XTP11编码基因,并在其5'端引入Nco I/BamH I酶切位点,连接入酵母表达载体pGBKT7中,构建编码XTP11全序列与酵母蛋白GAL4 DNA结合域融合蛋白的酵母表达质粒,转化酵母细胞AH109并应用Western blot方法检测XTP11蛋白表达.然后铺于含有X-α半乳糖的SD/-Trp和SD/-Trp-His-Ade营养缺陷型培养基上进行自激活验证(蓝/白筛选).结果成功地构建了XTP11的酵母表达载体并在酵母细胞中表达相应的融合蛋白,转化了pGBKT7-XTP11的AH109酵母细胞在两种营养缺陷型培养基上均可正常生长,并且可以产生α-半乳糖苷酶,从而在铺有X-α半乳糖的培养基上呈现蓝色,表明XTP11蛋白代替了酵母GAL4蛋白的DNA激活域发挥作用,从而激活下游报告基因(ADE2,HIS3,MEL1和LacZ)的表达.结论全序列XTP11蛋白与GAL4 DNA结合域的融合蛋白在酵母细胞中呈现转录激活功能,限制了应用酵母双杂交系统研究XTP11的肝细胞结合蛋白.
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BRCA1对FHL2转录激活功能的影响
目的:进一步了解乳癌易感基因BRCA1与FHL2相互作用对FHL2转录激活功能的影响,为揭示BRCA1在肿瘤发生发展中的作用提供依据.方法:将BRCA1 C端缺失突变体BRCA1(△1443~1863 aa)和BRCA1 (△908~1863 aa)按正确读框插入到pCR3载体中,并在293T细胞中表达.利用GAL4荧光素酶报告基因检测野生型BRCA1以及肿瘤易感突变体BRCA1(P1749R),BRCA1(Y1853insA),BRCA1(△1443~1863 aa)和BRCA1(△908~1863 aa)对FHL2转录激活活性的调节作用.结果:野生型BRCA1能增强FHL2转录激活活性,且具有剂量依赖性.而4种肿瘤易感突变体增强FHL2转录激活活性的能力明显减弱.结论: BRCA1与FHL2相互作用可能对基因转录调节以及肿瘤发生、发展中起着重要作用.
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光诱导CRISPR/Cas9系统在基因表达调控中的研究进展
Cas9是CRISPR/Cas9系统中RNA引导的可切割双链DNA的核酸酶,野生型Cas9可通过基因剪切直接导致目的基因表达沉默.将Cas9蛋白D10A和H840A位点突变,可获得失去切割活性但仍保留与DNA结合能力的dCas9,其与转录激活因子连接后结合到DNA特定位点可实现转录激活;若dCas9直接与靶基因特定位点结合则可阻碍目的基因的转录.将光可调节物质引入CRISPR/Cas9可设计成光诱导CRISPR/Cas9系统.此系统在蓝光(470 nm)诱导下作用于靶DNA可实现人为可控的基因表达激活和抑制.本文主要介绍了光诱导CRISPR/Cas9系统的特性及其在基因表达调控中的运用.
关键词: 光 CRISPR/Cas9 dCas9 转录激活 转录抑制 -
非激动剂PPARγ配体的筛选方法建立和应用
建立体外活性评价方法考察化合物对过氧化物酶体增殖物激活受体γ (peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)转录激活活性和结合活性.首先通过质粒构建,分别建立PPARγ反应原件(PPARγ response element,PPRE)介导报告基因表达的转录激活筛选方法以及PPARγ配体结合区(ligand binding domain,LBD) 与酵母转录激活因子Gal4组成的嵌合受体在细胞水平的结合活性筛选方法.并采用基于时间分辨-荧光共振能量转移(time resolved-fluorescence resonance energy transfer,TR-FRET)技术的PPARγ竞争性结合检测方法,考察化合物或药物对PPARγ的亲和力.采用以上3种不同的体外活性评价方法,评价不同PPARγ配体的效能和作用特点,并发现了一个新的苯磺酰胺衍生化合物,ZLJ01,具有类似于已知PPARγ激动剂的结合活性及亲和力,但无PPRE介导的转录激活活性.初步体外降糖活性检测发现,ZLJ01可促进肝细胞胰岛素依赖的葡萄糖摄取.综上所述,结合转录激活活性和亲和力的评价方法,可用于筛选非激动剂PPARγ配体,以发现新型PPARγ调节剂.
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小果博落回的化学成分及苯菲啶生物碱的xbp1转录激活作用评价
采用溶剂提取、萃取粗分离和硅胶柱色谱纯化等天然药物化学研究手段,从罂粟科植物小果博落回的根中除得到部分已报道的苯菲啶型生物碱外,又进一步分离得到8个化合物.通过深入的波谱分析并参考文献数据鉴定其结构分别为1-氧代-2,22 (30)-何帕二烯-29-羧酸(1)、3-氧代-12-齐墩果烯-30-羧酸(2)、3α-羟基-12-齐墩果烯-30-羧酸(3)、3β-羟基-12-齐墩果烯-30-羧酸(4)、阿魏酸(5)、阿魏酸-4-O-β-D-葡萄糖苷(6)、3-O-阿魏酰奎尼酸(7)和3-O-阿魏酰奎尼酸甲酯(8).其中1为新的何帕烷型三萜类化合物,2~8为首次从该植物中分离得到的化合物.为寻找具有潜在抗溃疡性结肠炎活性的天然药物活性物质,本文采用特异的体外靶向xbp1高通量双荧光素酶报告基因药物筛选模型,对小果博落回所含主要成分进行了xbp1转录激活作用评价.实验结果首次阐明了二氢型苯菲啶生物碱类化合物,即二氢血根碱(9)和二氢白屈菜红碱(10),具有一定的xbp1转录激活作用,其作用强度分别为空载体对照组的1.76倍和1.77倍.
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类固醇受体辅激活因子3的促瘤作用研究
类固醇受体辅激活因子3(SRC-3)是一类与转录激活有关的蛋白辅助因子,通过与激素激活的核受体和其他一些特定的转录因子结合,参与调控机体的生长发育、能量代谢、细胞增殖、存活以及迁徙等过程.近年来,SRC-3广泛的促瘤作用更成为研究热点.SRC-3 蛋白不仅与核受体相互作用,还与多种转录因子结合,通过多条信号通路促进靶基因的转录,进而调控细胞生长、促进细胞增殖,在一些激素相关和非激素相关的癌症中发挥促瘤作用.该文就SRC-3作为促癌因子与肿瘤的相关性及其促增殖途径予以综述.
关键词: 类固醇受体辅激活因子3 转录激活 促瘤 增殖 -
IL-13及其变异体在呼吸道平滑肌细胞内对STAT6信号转导途径的影响
大多数学者认为IL-13主要是在细胞外通过与细胞膜上的IL-13Rα1受体、IL-13Rα2受体结合.IL-13与IL-13Rα1结合后,促使IL-13Rα1与IL-4Rα形成二聚体,从而激活JAK,随后一系列的信号途径被激活,包括胰岛素受体酶作用物(IRS-1,和IRS-2)、信号转导与转录(STAT)家族.STAT-6的SH2位点与IL-4R链酪氨酸磷酸化的残基结合,旦结合,STAT-6被JAK.磷酸化,而从此受体上释出来,与其他磷酸化的STAT-6分子形成二聚体,转运至核中,诱导基因转录激活,从而发生一系列信号转导,促使嗜酸细胞聚集,钙离子通道被激活,支气管平滑肌增生、再构杯状细胞增生,粘粹分泌增加等.因此IL-13及其受体在哮喘的发生和发展中起着重要作用.
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081 Janus激酶/信号转导蛋白和转录激活蛋白家族在人精子的表达与活性
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蛋白质组分析在医学中的应用
随着人类基因组计划(HGP)的实施和完成,基因研究以近顶峰而进入后基因时代,后基因组研究以基因组学为中心,同时分化出代表生命科学不同侧面的多种"组学"研究,如蛋白质组学(proteome)、药物基因组学、比较基因组学等[1],在这些领域中蛋白质作为生命活动的"执行者",参与了DNA的合成、基因转录激活、蛋白质翻译、修饰和定位以及信息传导等重要的生物过程,已经成为新的研究焦点.
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长链非编码RNA与肾脏疾病?
肾脏是人体的重要器官,其功能的多样性决定有关肾脏的研究一直是基础医学的重要方向。随着现代医学的发展,曾被认为是基因组转录“噪音”[1]的长链非编码RNA( lncRNA)得到越来越多的关注与研究,新近研究表明,lncRNA参与了X染色体沉默,基因组印记以及染色质修饰,转录激活,转录干扰,核内运输等多种重要的调控过程。虽然对lncRNA功能和作用机制的研究尚处于起步阶段,但已有不少研究证据表明lncRNA与肾脏有着密切联系。本文在介绍lncRNA的功能及特点基础上,对lncRNA与肾脏的关系作一综述。
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STAT6在哮喘小鼠肺组织的表达及激素的影响作用
目的 探讨信号转导和转录激活因子(STAT)-6在支气管哮喘发病机制中的作用及激素的影响作用.方法 经腹腔注射与鼻腔滴注卵白蛋白(OVA)制作小鼠哮喘模型,并设对照组和地塞米松干预组,激发后观察各组肺组织病理学改变,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组织化学检测肺组织STAT6 mRNA和蛋白表达.结果 OVA末次激发24 h后,病理组织学显示哮喘组小鼠肺组织可见大量炎细胞浸润,STAT6mRNA(2.46±0.24与1.41±0.26,P<0.01)及蛋白表达水平较对照组明显增加,地塞米松治疗后,小鼠肺组织炎细胞浸润减轻,STAT6 mRNA(1.80±0.36与2.46±0.24,P<0.01)及蛋白表达水平下降.结论 哮喘气道中STAT6过度表达,地塞米松可通过调控STAT6表达发挥抗炎作用.