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乙型肝炎病毒感染诱发肝细胞癌机理的研究进展
原发性HCC的发生是一个多因素、多阶段极其复杂的过程,HBV长期慢性感染是其致病因素之一.HBV感染引起肝细胞的反复损伤坏死和增生、HBV DNA基因整合到肝细胞基因组、HBV基因表达产物HBx反式激活作用以及HBx和M-HBst引发细胞内ROS水平的升高等原因,都会引起HCC的发生.了解HBV引起肝细胞癌的致病机理,对于肝细胞癌的治疗和预防乙肝患者发展为肝细胞癌将有很大的帮助.
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乙型肝炎病毒X蛋白在乙型肝炎病毒感染血清学阳性患者肾组织中的表达及意义
目的 通过观察乙型肝炎病毒相关性肾炎(HBV-GN)患者临床及肾组织的病理特点,分析乙型肝炎病毒X蛋白(HBx蛋白)在HBV-GN中的病理诊断价值.方法 选取2014年6月至2017年6月大同市第五人民医院收治的51例HBV-GN患者,对其肾穿刺活检组织进行免疫组织HBx蛋白表达的观察分析,并与间接免疫荧光法乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎核心抗原(HBcAg)表达情况进行比较,评价HBx蛋白在HBV血清学阳性患者肾组织中的表达及意义.结果 51例患者,乙型肝炎病毒相关性膜性肾病(HBV-MN)12例;不典型膜性肾病(UAMN)9例;膜性肾病(MN)12例;IgA肾病(IgAN)8例;微小病变(MCD)9例;局灶节段性硬化(FSGS)1例.不同病理类型患者肾组织中HBx蛋白及HBsAg,HBcAg的表达有差异.其中UAMN患者HBx蛋白的阳性率高于HBsAg,HBcAg表达的阳性率.IgAN患者、MCD患者HBx蛋白的阳性率均高于HBsAg,HBcAg表达的阳性率.结论 HBV-GN临床易误诊漏诊,在临床基础上结合肾组织中HBx蛋白的检测及病理特点可以提高HBV-GN的诊断准确率.
关键词： 乙型肝炎病毒相关性肾炎 乙型肝炎病毒X蛋白 病理特点 -
健脾解毒方对过表达HBx肝癌HepG2细胞PI3K/AKT通路的影响
目的 观察健脾解毒方对过表达乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)的肝癌细胞增殖及PI3K/AKT信号通路相关因子表达的影响.方法 构建过表达HBx肝癌的HepG2细胞,给予不同浓度健脾解毒方药物血清进行干预,实验分为肝癌细胞空白组、pcDNA3.1组、pcDNA3.1-HBx组和健脾解毒方低、中、高剂量组.采用MTT法及流式细胞仪检测细胞增殖及凋亡水平,采用Western blot检测肝癌细胞p-PI3K、p-AKT蛋白表达.结果 成功构建过表达HBx的肝癌HepG2细胞,发现有促进肝癌细胞增殖及上调p-PI3K及p-AKT表达的作用.健脾解毒方药物血清干预后,可不同程度抑制肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞凋亡,以及下调p-AKT、p-PI3K表达的作用,而健脾解毒方低剂量组对p-PI3K表达作用不显著.结论 健脾解毒方有抑制肝癌细胞增殖及促进凋亡的作用,其机制与下调PI3K/AKT通路相关因子表达有关.
关键词： 肝癌细胞 PI3K/Akt信号通路 乙型肝炎病毒X蛋白 健脾解毒方 -
乙型肝炎病毒X蛋白与内质网应激关系的研究进展
乙型肝炎病毒X蛋白是由乙型肝炎病毒X区转录翻译而成的多功能调节因子,与多种肝脏疾病的发生发展关系密切.近有研究表明,内质网应激受到乙型肝炎病毒X蛋白的调控,促进细胞存活.本文就研究现况对乙型肝炎病毒X蛋白和内质网应激的相关性进行总结,以期为进一步研究提供参考.
关键词： 乙型肝炎病毒(HBV) 乙型肝炎病毒X蛋白 内质网应激 -
乙型肝炎病毒X蛋白稳定表达株的构建及沉默效果观察
目的 构建稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白(HBX)基因的HepG2-HBX细胞系,观察小分子干扰RNA(siRNA)对HBX基因的特异性抑制效果.方法 用脂质体将含有HBX序列的真核表达质粒pCDNA3.1(+)/HBX-Flag转染人HepG2细胞系,通过G418筛选后,分别经RT-PCR和免疫组化对HBX的表达进行验证;化学合成靶向HBX的siRNA(即siHBX),转染入HBX稳定表达株,分别以RT-PCB和实时荧光定量RT-PCR检测HBX mRNA表达水平,Western blot检测HBX蛋白表达水平以验证siHBX对HBX基因的沉默效应,流式细胞仪检测细胞周期变化.结果 成功构建表达HBX基因的HepG2-HBX细胞系;siHBX可以高效特异抑制HBX表达,并抑制细胞周期进展.结论 siHBX可作为一种靶向抑制肝癌细胞系内HBX表达的策略,为后续HBV感染相关性肝癌的治疗奠定了实验基础.
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小发夹RNA体外抑制乙型肝炎病毒X蛋白表达的实验研究
目的 构建靶向乙型肝炎病毒X基因(HBX)的shRNA表达载体pSilencer3.1-shHBX,观察其体外抑制HBX在HepG2细胞中表达的作用,为应用RNA干扰技术进一步研究HBX基因的功能奠定基础.方法 设计并构建靶向HBX的shRNA表达载体pSilencer3.1-shHBX,脂质体转染法将HBX表达载体pcDNA3.1-HBX与pSilencer3.1-shHBX共转染人肝癌HepG2细胞,培养72 h后以RT-PCR检测HBX基因表达情况,以Western blot检测HBX蛋白的表达量.结果 经酶切和测序鉴定,构建的重组质粒pSilencer3.1-shHBX与设计一致.该质粒使HBX基因mRNA表达量降低47.1%,使HBx蛋白表达量降低58.9%,而阴性对照质粒无此作用.结论 成功构建靶向HBX shRNA表达载体pSilencer3.1-shHBX,该质粒可体外抑制HBX在HepG2细胞中的表达.
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乙型肝炎病毒X蛋白的研究进展
乙型肝炎病毒X基因编码的X蛋白是一种反式作用因子,具有调控细胞周期、胞内信号转导和凋亡以及诱导癌基因激活等多种生物学作用,对肝脏慢性炎症和肝细胞癌的发生有重要意义.本文就X蛋白在调控细胞凋亡、促进病毒复制和诱导肝细胞癌变方面的研究进展作一综述.
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乙型肝炎病毒X蛋白与线粒体延长因子G1相互作用
目的 研究乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)与线粒体延长因子G1(EFGI)在酵母细胞及肝癌细胞内的相互作用.方法 CytoTrap酵母双杂交法验证HBx蛋白与EFG1蛋白发生相互作用后,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增EFG1基因,并克隆于真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)A,确定测序正确并确认EFG1蛋白可在Huh7肝癌细胞表达后,将HBx及EFG1真核表达载体共转染Huh7肝癌细胞,48 h后裂解细胞,免疫共沉淀法(CO-IP)确证HBx蛋白与EFG1蛋白的相互作用.结果 CytoTrap酵母双杂交法证明HBx蛋白与EFG1蛋白存在相互作用;此外成功构建真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)A-EFG1,与真核表达载体pFLAG-CMV-2-HBx共转染Huh7肝癌细胞后,HBx蛋白与EFG1蛋白可以相互沉淀.结论 本研究证实HBx蛋白与EFGI蛋白存在直接相互作用,为研究HBx蛋白对线粒体蛋白表达的影响提供理论基础,为研究HBx蛋白在肝癌发生过程中的作用提供依据.
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乙型肝炎病毒cccDNA与HBx蛋白在肝细胞性肝癌中表达的关系及意义
目的:探讨肝细胞性肝癌中乙型肝炎病毒(HBV)occDNA与HBx蛋白表达的关系及其意义.方法:取42例肝细胞性肝癌患者的癌和癌旁组织,采用SABC法检测组织中的HBx蛋白;采用RT-PCR法检测组织中的HBV CCCDNA水平.结果:HBx蛋白在癌及癌旁组织中的阳性例数分别为31例(73.8%)和35例(83.3%),无显著性差异;癌旁组织中cccDNA水平较癌组织中的高,但是统计学检验无显著性差异;癌组织和癌旁组织中HBx蛋白(+)者的cccDNA水平均明显高于HBx蛋白(-)者(P＜0.05).HBx蛋白表达与cccDNA水平呈正相关(r=0.778,P＜0.01).结论:HBx蛋白的表达与cccDNA水平明显相关,他们相互作用、相互影响并在肝癌的发生发展中起重要作用.
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乙型肝炎病毒X蛋白对人肝L-02细胞中COX-2表达的影响
目的:研究在人肝细胞L-02中乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对环氧化酶2(COX-2)表达的影响.方法:构建HBx基因表达载体pIRES2-AcGFP-HBx,转染入人肝细胞L-02中,RT-PCR和western blot检测HBx对COX-2表达的影响;通过细胞生长曲线和细胞周期变化,检测HBx蛋白对细胞分裂增殖的作用.同时将含有COX-2启动子核心片段的荧光素酶报告载体pGL3-COX-2转染入上述转染细胞,检测细胞荧光素酶荧光值以观察HBx蛋白对COX-2启动子活性的影响.结果:RT-PCR结果显示仅在HBx基因转染组细胞中有HBx mRNA的表达,且该组细胞中COX-2 mRNA相对表达量显著高于空载体对照组和空白对照组(0.76±0.12 vs 0.28±0.04,0.25±0.03,均P＜0.01);Westem blot结果显示,仅HBx基因转染组可见HBx蛋白有明显印迹条带,且该组细胞中COX-2蛋白免疫印迹较两对照组深；细胞生长曲线测定表明HBx基因转染组细胞在第3、4、5天的生长较两对照组显著加快(P＜0.05)；细胞周期测定显示与两对照组相比,HBx基因转染组G0-G1期比例显著降低,S期和G2-M期比例显著增加(P＜0.05).HBx基因转染组COX-2启动子荧光素酶荧光值显著高于空载体对照组和空白对照组(1 675.2±84.9 vs 657.7±34.7,739.3±45.3,均P＜0.05).结论:HBx蛋白可增强人肝L-02细胞中COX-2的表达水平,对L-02细胞分裂增殖、生长有明显促进作用;HBx蛋白可通过提高COX-2启动子的活性以增强COX-2的表达.
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乙型肝炎病毒X蛋白与肝细胞内质网应激
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染与持续性肝损伤和原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)关系密切.我国是HBV感染的高流行区,给人群带来的健康威胁和损害是关注的热点问题.HBV感染是HCC的主要病原学因素之一,但其诱导肿瘤形成潜在的分子机制依然存在争议.其中HBV的X蛋白(HBV X protein,HBx)在HBV致肝细胞损伤、诱导肝细胞恶性转化、与环境因素暴露协同诱导肝致癌作用等过程中所起的作用都是研究的焦点.HBx作为多功能调控蛋白调控大量细胞信号转导通路,包括内质网(endoplasmic reticulum,ER)应激反应,值得关注的是近几年已有文献报道HBx表达对肝细胞ER应激的诱导作用,但对调控的分子机制的认识还不明确.因此,本文综述了HBx影响肝细胞ER应激的研究进展,为HBV感染诱导肝损伤和疾病的分子机制提供线索.
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HBx在肿瘤微环境中的作用及其对肝癌发生发展的影响
乙型肝炎病毒x蛋白(hepatitis B X protein,HBx)是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)所编码的一种多功能潜在性肿瘤蛋白,其在慢性乙型肝炎,肝硬化及肝癌过程中发挥着极其重要的作用.既往研究表明慢性炎症能形成一种有利于肿瘤生存的微环境.肝癌是一种典型的慢性炎症相关性肿瘤,炎症是肝癌侵袭进展的主要危险因素.作为乙型肝炎病毒的主要激活子,HBx可通过与肿瘤微环境中的肿瘤细胞及肿瘤周围基质成分相互作用在肝脏炎症反应的激活及维持中发挥重要作用.HBx与这些细胞成分之间复杂的相互作用将调控肿瘤的生长、侵袭、转移以及血管形成.本文将就此领域相关内容作一述评.
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HBxAg蛋白反式激活基因5的生物信息学分析及真核表达载体的构建
目的 对HBxAg蛋白反式激活基因5(XTP5)进行生物信息学分析,并构建其真核表达载体.方法 利用生物信息学软件对XTP5基因进行CpG岛、启动子活性、转录终止信号和氨基酸的一、二级结构以及信号肽、跨膜特性和功能基序进行预测.构建XTP5基因的真核表达载体pcDNA3.1-XTP5和pGBKT7-XTP5.结果 生物信息学分析发现XTP5基因有200 bp左右的CpG岛,有高启动子活性序列、转录终止信号位点,二级结构以Helix为主,存在信号肽的概率为0.0000A,无跨膜区域信号,存在数个功能基序.成功构建了XTP5基因的真核表达载体pcDNA3.1-XTP5和pGBKT7-XTP5.结论 为深人研究XTP5结构和功能、进一步探讨乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)发病机制创造了条件.
关键词： 乙型肝炎病毒X蛋白 XTP5基因 次要组织相容性抗原基因 生物信息学 表达载体 -
乙型肝炎病毒X蛋白对DNA甲基转移酶3A/3B表达的影响
目的 观察乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对QSG7701细胞中DNA甲基转移酶(DNMT)3A/3B表达的影响.方法 本研究室前期构建好的重组表达质粒pcDNA-X及空载体pcDNA3.0分别转染QSG7701细胞,经含G418的选择性培养基筛选获得稳定转染HBV-X基因的细胞克隆(pcDNA-X/QSG7701)及稳定转染空载体pcDNA3.0的细胞克隆(pcDNA3.0/QSG7701).采用RT-PCR、Western blot分别检测转染细胞中HBx mRNA和HBx蛋白的表达.Real-time PCR检测3种细胞DNMT3A/3B mRNA的表达情况.免疫组织化学法检测3种细胞DNMT3A/3B蛋白的表达情况.结果 RT-PCR、Western blot 检测结果显示pcDNA-X/QSG7701细胞中有HBx mRNA及HBx蛋白的表达.Real-time PCR结果显示pcDNA-X/QSG7701中DNMT3A/3B mRNA表达水平显著高于pcDNA3.0/QSG7701及未转染的细胞QSG7701(P< 0.05).免疫组织化学检测结果显示pcDNA-X/QSG7701细胞中DNMT3A/3B 蛋白表达水平显著高于pcDNA3.0/QSG7701及QSG7701细胞(P< 0.05).结论 稳定转染HBV-X基因的人源性永生化非瘤性肝细胞QSG7701中DNMT3A/3B mRNA和蛋白的表达水平均显著升高,提示HBV-X基因在mRNA及蛋白水平能上调转染细胞中DNMT3A/3B的表达,而细胞中DNMT3A/3B表达的增加是否一步影响癌基因、抑癌基因的表达水平,从而导致细胞癌变,尚有待进一步研究.
关键词： 乙型肝炎病毒X蛋白 乙型肝炎病毒 癌 肝细胞 DNA甲基化转移酶3A/3B -
乙型肝炎病毒X蛋白对血管内皮生长因子的调节通路研究
目的 研究NF-kB信号转导通路在乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)调节血管内皮生长因子(VEGF)表达中的作用.方法 建立稳定转染HBx基因的L02细胞系(L02-HBx),用不同浓度的NF-kB信号转导通路阻断剂吡咯二硫氢基甲醋酯(PDTC)阻断NF-kB信号转导通路,荧光双标激光扫描共聚焦显微镜观察转染前后及PDTC加入前后NF-kB信号转导通路的激活及失活情况,同时用实时荧光定量PCR和Western blot技术检测转染前后及PDTC加入前后VEGF在mRNA及蛋白水平的表达变化.结果 以L02细胞为参照,转染HBx基因后的L02-HBx细胞NF-kB信号转导通路被激活,VEGF mRNA和蛋白水平分别增加(4.07±0.31)和(4.34±0.64)倍,差异有统计学意义(P<0.05);加入25.0和50.0μmol/L的PDTC作用24 h后,L02-HBx细胞NF-kB信号转导通路被阻断,VEGF mRNA表达水平分别增加(2.33±0.22)和(1.86±0.18)倍;VEGF蛋白表达水平分别增加(2.52±0.29)和(2.17±0.34)倍,与未加入PDTC的L02-HBx细胞的差异有统计学意义(P<0.05).12.5μmol/L PDTC作用24 h后,VEGF mRNA和蛋白水平的变化无统计学意义(P>0.05).结论 NF-kB信号转导通路是HBx上调VEGF表达、促进肝癌血管生成的途径之一.
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乙型肝炎病毒X蛋白对人肝癌细胞hsp90α基因表达调控机制研究
目的:探讨乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)参与人肝癌细胞hsp90α基因表达的调控机制.方法:采用半定量RT-PCR、蛋白质印迹法及荧光素酶活性检测技术,检测不同剂量HBx表达载体转染的HepG2细胞中hsp90α基因mRNA和蛋白表达及启动子活性的变化,并观察转录因子c-Myc阻断剂10058-F4对上述效应的影响.采用启动子实验分析c-Myc对hsp90α基因启动子的激活作用.RT-PCR和蛋白质印迹法检测表达HBx的HepG2细胞中c-Myc mRNA和蛋白表达情况;蛋白质印迹法及ELISA分析细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)表达水平及内源性ERK的活性.结果:HBx基因转染HepG2细胞中hsp90α基因的mRNA和蛋白表达水平以及启动子活性呈剂量依赖性增强,P=0.006 1;c-Myc阻断剂抑制了HBx对hsp90α基因表达的上调效应.c-Myc通过与c-Myc位点(-1094/-1088)结合转录激活hsp90α基因启动子活性.HBx使HepG2细胞中c-Myc mR-NA和蛋白表达增强,并伴有ERK1/2蛋白磷酸化水平增加,ERK活性明显提高,P=0.032.结论:HBx通过ERK信号通路反式激活肝癌细胞c-Myc介导的hsp90α基因启动子活性,从而上调hsp90α基因表达.
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新基因XTP11表达蛋白在酵母细胞中的转录激活功能研究
目的构建乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP11的酵母表达载体,探索应用酵母双杂交系统克隆与XTP11蛋白结合的肝细胞蛋白的可行性.方法用聚合酶链反应(PCR)扩增XTP11编码基因,并在其5'端引入Nco I/BamH I酶切位点,连接入酵母表达载体pGBKT7中,构建编码XTP11全序列与酵母蛋白GAL4 DNA结合域融合蛋白的酵母表达质粒,转化酵母细胞AH109并应用Western blot方法检测XTP11蛋白表达.然后铺于含有X-α半乳糖的SD/-Trp和SD/-Trp-His-Ade营养缺陷型培养基上进行自激活验证(蓝/白筛选).结果成功地构建了XTP11的酵母表达载体并在酵母细胞中表达相应的融合蛋白,转化了pGBKT7-XTP11的AH109酵母细胞在两种营养缺陷型培养基上均可正常生长,并且可以产生α-半乳糖苷酶,从而在铺有X-α半乳糖的培养基上呈现蓝色,表明XTP11蛋白代替了酵母GAL4蛋白的DNA激活域发挥作用,从而激活下游报告基因(ADE2,HIS3,MEL1和LacZ)的表达.结论全序列XTP11蛋白与GAL4 DNA结合域的融合蛋白在酵母细胞中呈现转录激活功能,限制了应用酵母双杂交系统研究XTP11的肝细胞结合蛋白.
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不同基因型HBx对乙型肝炎病毒复制的影响
目的 探讨A、B、C和D四个基因型乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)复制的影响.方法 构建含A、B、C和D四种基因型HBx的真核表达载体和提前终止HBx表达的突变型单倍体HBV表达系统,共转染至人肝肿瘤细胞系HepG2细胞,利用荧光素酶报告系统检测不同基因型HBx对HBV 核心启动子的激活作用,利用酶联免疫法(ELISA)检测培养上清中HBV表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的表达情况,利用特异性引物PCR方法检测细胞中HBV前基因组RNA(pgRNA)和总RNA(pgRNA,2.2 kb和0.8 kb RNA)的转录情况.结果 A、B、C和D四种基因型HBx的表达均可显著激活HBV核心启动子活性,但不同基因型HBx的激活作用不同.除C基因型外,A、B和D三种基因型HBx均可显著增强HBsAg和HBeAg的胞外分泌水平.检测HBV复制中间产物发现,C基因型HBx 对HBV pgRNA和总RNA转录水平的影响显著低于A、B和D基因型.结论 不同基因型HBx对HBV复制的影响不同,为进一步研究HBV基因型与HBV复制能力以及临床病理表现的关系打下基础.
关键词： 乙型肝炎病毒X蛋白 病毒复制 基因型 单倍体HBV表达系统 -
HBx诱导p16INK4a高甲基化在Chang细胞株恶性转化倾向中的作用
目的:探讨乙型肝炎病毒X(HBx)蛋白对p16INK4a表达和甲基化的影响,以及其在肝细胞癌早期发生中的作用机制.方法:采用脂质体法将真核表达载体pcDNA3.1B-HBx和pcDNA3.1B质粒分别稳定转染Chang细胞,构建表达HBx的细胞株Chang-HBx和不表达HBx的细胞株Chang-vector;半定量RT-PCR和Western blot法分别在mRNA和蛋白质水平上检测Chang-HBx、Chang-vector和Chang细胞株中的p16INK4a表达；甲基化特异性PCR检测HBx对细胞中p16INK4a启动子甲基化的影响；CCK-8溶剂检测3种细胞株的增殖曲线,流式细胞仪观察3种细胞的细胞周期和细胞凋亡率,重复3次.结果:成功构建了Chang-HBx和Chang-vector稳定细胞株,Chang-HBx细胞生长速度增快,Chang-HBx细胞的S期平均比率明显高于Chang-vector细胞和Chang细胞(28.96％ vs.21.53％,P＜0.001; 28.96％ vs.21.5％,P＜0.001),而且Chang-HBx细胞的细胞凋亡率平均值明显低于Chang-vector细胞和Chang细胞(2.71％vs.3.69％,P＜0.001；2.71％ vs.3.36％,P＜0.001).初步机制研究证实HBx蛋白介导肝细胞的p16INK4a高甲基化,进而导致p16INK4a在mRNA和蛋白水平上表达均下降.结论:HBx通过诱导p16INK4a高甲基化下调后者的表达水平,可能在Chang细胞的恶性转化倾向中发挥作用.
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ASPP2抑制HBx引起细胞自噬的实验研究
目的 观察ASPP2对HBx引起的细胞自噬的改变.方法 运用Hbx转染HepG 2细胞,ASPP2过表达与对照情况下,采用免疫印迹技术检测内源性自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ和P62的表达,采用免疫荧光方法检测LC3荧光颗粒表达水平,采用RT-PCR技术检测自噬相关基因Beclin-1的mRNA转录水平.结果 免疫印迹技术显示转染HBx质粒比转染空载组的LC3Ⅱ量增多,但是在加入ASPP2腺病毒组比空载组的LC3Ⅱ表达量减少.免疫荧光显示转染HBx质粒比转染空载组的LC3荧光颗粒多,但是在共转染ASPP2质粒组比空载组的LC3荧光颗粒减少.RT-PCR方法显示转染HBX质粒比转染空载组的表达增多,但是在加入ASPP2腺病毒组比空载组表达量减少.结论 ASPP2可以抑制HBx引起的细胞自噬.
