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Ⅱ类组蛋白去乙酰化酶与临床
Ⅱ类组蛋白去乙酰化酶(HDACs)及其相互作用分子在与临床相关的生物学过程中发挥着重要作用.近年来发现,Ⅱ类组蛋白去乙酰化酶与临床心血管疾病、呼吸系统疾病和骨软骨疾病的发生、肿瘤进展以及药学研究等密切相关.本文就Ⅱ类HDACs与临床的关系进行了综述.
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蛋白质Nα-末端乙酰化的功能研究进展
蛋白质 Nα-末端乙酰化修饰是由 Nα-末端乙酰转移酶（NATs）所催化的酶促反应过程，其结果是蛋白质 N-末端的α氨基接受来自于乙酰辅酶 A（AcCoA）的乙酰基。在真核生物中 Nα-末端乙酰化是一种广泛存在的蛋白质修饰方式，大约有68%的酵母蛋白质和85%人蛋白质是 Nα-乙酰化修饰的[1]，但原核和古细菌蛋白却很少发生乙酰化。目前已发现在真核生物中存在6个 N ATs 亚型（NatA~NatF），每一亚型由一个或多个亚基组成，且各自都有其独特的底物特异性，如起始甲硫氨酸被切除后，N-末端的丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸、甘氨酸和缬氨酸都能够被NatA 催化乙酰化（N-末端第三个氨基酸为脯氨酸除外）[2]。尽管高等真核生物有更多蛋白质是 Nα-末端乙酰化修饰的，表达更多的 NATs，但是酵母等低等真核生物的 Nα-末端乙酰化模式和 NAT 催化机制与高等真核生物是相似的[3]。到目前为止，人们发现 Nα-末端乙酰化具有调节蛋白质降解、抑制内质网易位和调节蛋白质间相互作用等功能，但我们还没能完全了解 Nα-末端乙酰化的所有功能。本文主要对Nα-末端乙酰化和 Nα-末端乙酰转移酶的功能及其与病理联系的研究进展作一综述。
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磷酸化、乙酰化修饰对p53功能的影响
在人类基因组解码之后,将是对基因所编码蛋白质的研究.蛋白质在成熟的过程中乃至成熟之后需要经过一系列的修饰如甲基化、磷酸化、乙酰化、糖基化等使蛋白质的构象发生一定的变化,方可执行特定的功能.如组蛋白的乙酰化、一些转录因子的磷酸化或乙酰化等[1].因此,仅仅从基因的角度来研究并预测蛋白质的功能是远远不够的. p53是参与细胞周期调节、控制细胞增生、凋亡的一个中枢性调节分子,一直深受细胞生物学家和肿瘤生物学家的关注.以往的大量研究表明人类肿瘤半数以上存在p53基因突变,认为p53基因突变失活是导致这些细胞癌变的根本所在.但是实验发现,尚有众多人类肿瘤中没有p53基因突变,却有p53功能性灭活.研究还发现:转录因子p53同其他蛋白质一样,翻译后有极为丰富的加工与修饰,p53的这种修饰是调节p53活性与稳定性的重要机制[2].可见,翻译后修饰对p53功能至关重要,更可能与某些肿瘤的发生密切相关.因此,对p53翻译后修饰与功能的关系作一综述.
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白念珠菌HDAC家族RPD3／HDA1介导组蛋白乙酰化修饰作用方式的初步研究
念珠菌是真菌感染性疾病重要的致病菌之一，念珠菌病主要包括黏膜病变、皮肤病变、系统性感染等，近年来有研究开始尝试从表观遗传学角度来探讨疾病的发病机制和治疗途径，但在医学真菌包括念珠菌方面的研究很少。组蛋白的乙酰化程度由两类酶决定，即组蛋白乙酰基转移酶（ histone acetyltransferases ， HAT）和组蛋白去乙酰化酶（ histone deacetylases ，HDAC）。现已知编码白念珠菌 HDAC 的基因主要包括：HDA1、RPD3、HOS1、HOS2、HOS3和SIR2，主要分为3类，Ⅰ类以RPD3为代表，Ⅱ类以HDA1为代表，Ⅲ类以SIR2为代表。
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组蛋白乙酰化修饰在儿童哮喘中的作用及糖皮质激素治疗
支气管哮喘(哮喘)在儿童中发病率日趋增高,越来越多的研究发现表观遗传学在哮喘发病中起重要作用,其中重要的即为组蛋白乙酰化与去乙酰化修饰,分别由组蛋白乙酰基转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰基酶(HDAC)所催化,通过引起Th1/Th2失衡、增加气道高反应性、调节各种炎症介质等介导哮喘发病.该文综述HAT和HDAC介导哮喘发病的新及其他可能机制、糖皮质激素治疗儿童哮喘的表观学机制,以期能指导从组蛋白乙酰化作为切入点.
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乙酰化对鼠伤寒沙门菌酸耐受应答的影响
目的 研究乙酰化/去乙酰化酶Pat/CobB对沙门菌酸耐受应答的影响.方法 利用λ-Red同源重组系统分别敲除鼠伤寒沙门菌乙酰化酶/去乙酰化酶编码基因pat和cobB.利用生长曲线比较生长差异;Real-Time PCR检测参与酸应激的部分基因转录变化;采用Cfu计数法检验敲除株和野生株在对数期和平台期酸耐受应答中的差异.结果 成功构建了鼠伤寒沙门菌pat和cobB敲除株.pat和cobB敲除不影响细菌生长,也不影响对数期和平台期的鼠伤寒沙门菌对酸的耐受应答能力.结论 鼠伤寒沙门菌中编码乙酰化/去乙酰化酶的基因pat/cobB突变不会影响菌的生长,也不参与酸耐受应答.
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α-突触核蛋白乙酰化修饰在帕金森病中作用的研究进展
帕金森病(Parkinson's disease,PD)是目前尚无法治愈的神经系统退行性疾病,严重影响患者的生活质量.多年来,研究发现α-突触核蛋白的过量产生或者结构异常会导致形成具有毒性作用的聚集体,这是PD发病的关键环节.α-突触核蛋白的异常修饰与其聚集状态密切相关,如蛋白磷酸化修饰、泛素化修饰、硝基化修饰等,但这些修饰的确切作用尚不确定.近年来的研究显示乙酰化修饰在α-突触核蛋白的异常聚集中发挥不可忽视的作用.该文就其研究进展进行综述.
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刘伟教授团队在《分子细胞》发表论文阐述细胞核内LC3蛋白脱乙酰化修饰在自噬泡形成中的作用
2015年1月15日，浙江大学医学院基础医学系刘伟教授团队在《细胞》（ Cell）子刊《分子细胞》（ Molecular Cell）在线发表了论文“Deacetylation of nuclear LC3 drives autophagy initiation under starvation”（http：／／www．cell．com／molecular－cell／abstract／S1097－2765（14）00962－9？＿returnURL），阐述了细胞核内LC3蛋白脱乙酰化修饰在自噬泡形成中的重要意义及其调控机制。
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乙酰化修饰枸杞多糖及其抗氧化、抗肿瘤活性研究
目的 观察分子结构乙酰化修饰对枸杞多糖(Lycium barbarum L.polysaccharide,LBP)体内抗氧化、抗肿瘤活性的影响.方法 通过分子结构乙酰化修饰得到枸杞多糖乙酰化衍生物LBPa;将昆明种小鼠随机分成空白对照组,阳性对照组(维生素C),LBP高、低剂量组及LBPa高、低剂量组,测定小鼠血清和肝脏丙二醛(malondialdehyde,MDA)、肝脏总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)和过氧化氢酶(catalase,CAT).复制H22荷瘤小鼠模型,灌胃给药LBP,考察LBPa和LBP对肿瘤细胞抑制率、脾脏指数、胸腺指数及血清肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)和白介素-2(interleukin,IL-2)含量的影响.结果 LBPa可以显著提高正常小鼠肝组织CAT活力及T-AOC,降低小鼠血清及肝脏MDA含量,其抗氧化效果优于维生素C及LBP,LBPa及LBP抗氧化活性均与剂量具有正相关性.LBPa可显著抑制H22肿瘤细胞增殖,提高免疫器官指数,提高血清IL-2及TNF-α含量;除IL-2含量外,对其他指标的影响均有剂量依赖性;LBPa抗肿瘤活性明显优于LBP.结论 乙酰化修饰可显著提高LBP的抗氧化及抗肿瘤活性.
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ALS小鼠脊髓组织GFAP蛋白赖氨酸的乙酰化修饰
目的 探讨肌萎缩脊髓硬化症(ALS)模型小鼠脊髓组织胶质纤维酸性蛋白(GFAP)中赖氨酸的乙酰化修饰.方法 对4个月左右的ALS模型小鼠进行麻醉处死,提取小鼠脊髓组织总蛋白,通过GFAP抗体和乙酰化抗体,运用免疫沉淀和免疫蛋白印迹技术鉴定GFAP蛋白的表达与GFAP蛋白赖氨酸的乙酰化修饰,通过液相二级质谱连用(LC-MS/MS)检测ALS模型小鼠脊髓组织中GFAP赖氨酸的乙酰化修饰位点.结果 免疫沉淀和免疫蛋白印迹方法发现ALS模型小鼠脊髓组织中GFAP蛋白存在赖氨酸乙酰化修饰;LC-MS/MS发现GFAP的394位和402位赖氨酸位点发生乙酰化修饰.结论 ALS小鼠模型脊髓组织中,GFAP的赖氨酸位点能被乙酰化修饰,该修饰可能参与了ALS的发生.
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蛋白质乙酰化修饰在肿瘤发生、治疗中的作用研究进展
蛋白质分子链在乙酰基转移酶的作用下嫁接一个乙酰基，此过程称为蛋白质的乙酰化修饰，是一种普遍存在的翻译后修饰现象。蛋白质（包括组蛋白和非组蛋白）的乙酰化修饰主要发生在赖氨酸上。随后的功能研究［1］显示，蛋白质乙酰化修饰对蛋白质的功能可以产生很大的影响，包括酶的活化与失活、蛋白质稳定性、亚细胞结构定位和特殊功能复合体的形成等。近有研究发现，大部分组蛋白在肿瘤细胞呈低乙酰化状态，组蛋白乙酰化修饰能够调控基因的表达，并且其在肿瘤发生、发展中扮演重要角色。蛋白质乙酰化修饰在肿瘤发生中的作用逐渐成为研究热点，已有研究者将其应用于肿瘤的临床治疗中。现将蛋白质乙酰化修饰在肿瘤发生、治疗中的作用综述如下。
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依泽替米贝通过SIRT1抑制血管平滑肌细胞源性荷脂细胞固醇调节元件结合蛋白1c的过度乙酰化
目的 探讨依泽替米贝对血管平滑肌细胞源性荷脂细胞目醇调节元件结合蛋白1c乙酰化水平的影响及其分子机制.方法 采用20 mg/L胆固醇:β-环糊精混合物处理原代培养的大鼠主动脉平滑肌细胞制备荷脂细胞模型,经30μmol/L依泽替米贝处理荷脂细胞24h后,通过Western blot检测固醇调节元件结合蛋白Ic的乙酰化修饰水平及脂肪酸合成酶表达的改变,免疫共沉淀技术检测固醇调节元件结合蛋白1c与SIRT1的相互作用,转染shRNA抑制SIRT1的表达研究SIRT1在依泽替米贝调节固醇调节元件结合蛋白1c乙酰化水平中的作用.结果 血管平滑肌细胞经20 mg/L胆固醇∶β-环糊精混合物处理48 h后,固醇调节元件结合蛋白1c的乙酰化修饰水平升高,脂肪酸合成酶的表达增加,固醇调节元件结合蛋白1c与SIRTI蛋白的相互作用降低,但依泽替米贝处理后能够改善胆固醇:β-环糊精混合物所引起的血管平滑肌细胞的这一系列改变.然而,若利用SIRT1 shRNA抑制细胞SIRT1的表达则能够废除依泽替米调节固醇调节元件结合蛋白1c过度乙酰化的作用.结论 依泽替米贝通过SIRT1抑制血管平滑肌源性荷脂细胞固醇调节元件结合蛋白1c的过度乙酰化.
关键词： 依泽替米贝 血管平滑肌细胞 固醇调节元件结合蛋白1C SIRT1 乙酰化修饰 -
THP-1源性巨噬细胞泡沫化过程中肝X受体-α乙酰化修饰改变与SIRT1有关
目的 为研究THP-1源性巨噬细胞泡沫化过程中,SIRT1与肝X受体-α是否发生相互作用、肝X受体-α的乙酰化修饰如何改变及其与细胞内胆固醇含量的关系.方法 采用体外培养的THP-1细胞构建泡沫细胞模型.高效液相色谱法检测细胞内胆固醇含量的变化,免疫共沉淀检测肝X受体-α与SIRT1是否结合,免疫印迹法检测肝X受体-α的乙酰化修饰改变及SIRT1的表达改变.结果 在氧化低密度脂蛋白诱导细胞分化12、24 h和48h后,细胞内胆固醇含量增加,SIRT1与肝X受体-α共沉降,去乙酰化的肝X受体-α蛋白水平升高,SIRT1蛋白的表达增加.结论 THP-1源性泡沫细胞形成过程中,肝X受体-α与SIRT1存在相互作用,肝X受体-α的乙酰化修饰逐渐降低,其机制与SIRT1的水平升高有关.
关键词： THP-1源性巨噬细胞 肝X受体-α SIRT1 乙酰化修饰 泡沫细胞 -
AF9促进心脏祖细胞的生成及机制研究
目的：组蛋白乙酰化修饰是表观遗传调控中重要的调控方式之一，组蛋白乙酰化与基因活化关系密切，其中一个重要环节是被特定阅读器结构域所识别，从而招募染色质调控因子到特定区域，协同完成基因表达调控。 AF9是这类阅读器之一，其
是否参与心脏发育分化还未清楚。因此本研究探讨心脏转录因子联合AF9是否对心脏祖细胞的产生具有促进作用。方法：采用蛋白重组表达方式获得心脏转录因子GATA4、NKX2．5、TBX5（GNT）及AF9，结合纳米转导技术高效转导到目的细胞BM－SCs细胞核内，检测细胞毒性，CPCs的生成效率，组蛋白H3K9乙酰化情况，ChIP－PCR技术检测H3K9ac的作用靶点。结果：心脏转录因子GNT联合AF9能提高BMSCs重编程生成CPCs的效率，在200μg／L／蛋白的工作浓度下，细胞生长良好，与GNT组相比，联合AF9组的H3K9ac表达明显增加，ChIP－PCR的结果显示H3K9ac富集在MEF2C的启动子区域。结论：心脏转录因子组合GNT联合表观遗传调控因子AF9通过纳米－蛋白转导方式，能高效重编程BMSCs得到CPCs，AF9通过上调H3K9ac来促进重编程过程。 -
LSD1调控hiPSCs高效定向分化为IPCs的作用及机制研究
目的：通过抑制或沉默人皮肤成纤维细胞来源的诱导性多能干细胞（ hiPSCs ）内赖氨酸特异性去甲基化酶1（ LSD1）基因的表达，建立一种hiPSCs高效、定向分化为胰岛素分泌细胞（ IPCs）的方案，并初步探讨其调控分化机制。方法：采用shRNA或LSD1抑制剂，沉默或抑制hiPSCs内LSD1基因表达，筛选出利于hiPSCs向定型内胚层分化的LSD1活性；利用四步法将hiPSCs诱导分化为IPCs，并对IPCs分化效率及成熟度进行检测；将IPCs移植到糖尿病模型免疫缺陷小鼠肾包膜下，评估其体内降糖疗效；ChIP－qPCR检测抑制LSD1前后hiPSCs细胞核内相应组蛋白水平的变化情况。结果：抑制LSD1可促使hiPSCs提前进入定型内胚层分化，终IPCs的效率由21．52％提高至39．32％；体外胰岛素分泌量由1／8提高到1／6；移植的IPCs可在1周内使糖尿病小鼠血糖恢复至正常水平；ChIP－PCR结果显示hiPSCs的分化基因启动子区域H3K4me2／me3和H3K9act水平提高，H3K9／H3K27me3和HDAC1水平下降，而多潜能基因表达情况相反。结论：适当抑制LSD1活性可显著提高hiPSCs向IPCs的分化效率和成熟度，并在体内发挥有效降糖作用；LSD1通过调控hiPSCs多能性基因和分化基因启动子区域组蛋甲基化、乙酰化修饰水平来影响IPCs分化效率。
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组蛋白去乙酰化酶抑制剂应用前景
组蛋白去乙酰化(HDACs)与组蛋白乙酰基转移酶(HATs)染色体由DNA、组蛋白和非组蛋白组成.染色体的基本结构单位是核小体,它由大约146 bp的DNA和组蛋白八聚体组成,组蛋白H2A、H2B、H3、H4各两分子组成八聚体包裹着DNA.40年前就有人提出组蛋白的乙酰化修饰在基因表达调控中发挥作用,现在有大量的证据表明包围DNA的染色质蛋白重建是基因调控表观遗传学的根本机制,这包括组蛋白尾部可逆的转录后修饰如:赖氨酸残基乙酰化、赖氨酸残基和精氨酸残基的甲基化、丝氨酸残基的磷酸化、赖氨酸残基的泛素化和类泛素化.HDACs和HATs决定组蛋白的乙酰化.
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人 ARD1在肿瘤发生发展中的作用研究进展
蛋白质的乙酰化修饰是由一类乙酰基转移酶完成的，已发现的乙酰基转移酶家族成员10多个，它们各自的作用靶分子有所不同，其生理意义也有所不同。 ARD1（ arrest defec-tive 1， ARD1）基因是 N-乙酰基转移酶（ N -acetyltran -sferase，NAT）家族成员之一［1］，近年来逐渐成为研究的热点。 ARD1基因初在酵母细胞中发现它与NAT1基因结合，生成NatA复合体，催化细胞内多种蛋白质乙酰化。其中NAT1是乙酰化的催化亚基，ARD1是调节亚基［2-3］。但近的报道认为ARD1蛋白单独也可能具有催化蛋白的乙酰化反应的活性［4］。人 ARD1（ human arrest defective 1， hARD1）在人类多种肿瘤疾病研究中，从基因至蛋白水平的研究均有所涉及，但现有实验结果提示，hARD1活性调节有着多样性，其对肿瘤发生发展的作用尚不清楚，有待深入研究。
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干扰组蛋白乙酰化引发间充质干细胞心肌定向分化特定蛋白的异常表达
目的 利用组蛋白乙酰化修饰关键因子Gcn5 shRNA重组质粒转染经5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-aza)诱导后的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)并检测心肌早期发育相关结构和功能蛋白表达情况,探讨组蛋白乙酰化修饰在MSCs定向分化过程中的调控作用.方法 ①以组蛋白乙酰化修饰关键因子Gcn5为靶点,用带绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GrP)基因的pGenSil-1作为载体,构建Gcn5 shRNA质粒.②MSCs体外扩增,5-aza诱导后,不同的时间点用脂质体包载Gcn5 shRNA共转染大鼠MSCs,24 h后相差显微镜下观察细胞生长状况,电镜下观察染色质的形态变化,采用Western blot法分别检测Gcn5、心肌结构重链蛋白(myosin heavy chain,MHC)和连接蛋白(Connexin 43,Cx43)的表达状况.结果 电镜示经通用阴性质粒HK转染的MSCs细胞,形态与正常MSCs无明显差别,染色质仍以边集状态为主;经干扰质粒转染的MSCs细胞在形态上与正常MSCs细胞无明显差别,但其染色质出现明显的浓缩紧密现象.以β-actin为内参,比较干扰组和阴性对照组Gcn5、Cx43、MHC蛋白,计算出沉默效率分别为86%、58%和67%.结论 转染Gcn5 shRNA质粒可干扰组蛋白乙酰化平衡,进而影响MSCs体外分化中心肌发育特定蛋白的表达.
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5-aza诱导干细胞经乙酰化特异RNAi后心肌细胞发育相关基因检测
目的通过组蛋白乙酰化作用相关shRNA质粒转染5氮杂胞苷(5-azacytidine,5-aza)诱导后不同时间段间充质干细胞心肌发育基因的检测,探讨乙酰化修饰在干细胞特化心肌样细胞转录调控中的作用.方法选择7条组蛋白乙酰化修饰关键因子Gcn5基因片段,用带有绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)基因的pGenesil-1作为载体,构建相应7个shRNA质粒.5-aza诱导大鼠间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)24 h、2、4、7 d,分别用重组shRNA质粒脂质体共转染后提取RNA,逆转录PCR检测Gcn5基因和心肌早期发育基因GATA4的表达.结果经特异性限制性内切酶酶切分析和DNA序列测定,质粒构建与设计符合;各个时间段对照组Gcn5和GATA4均有表达,而实验组却无相应表达.结论通过实验提示封阻干细胞染色质组蛋白乙酰化可以达到抑制干细胞特化心肌细胞转录过程的作用,这为进一步研究组蛋白末端乙酰化修饰与干细胞分化调节机制奠定实验室基础.
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Gcn5基因shRNA的载体构建及其对干细胞分化中组蛋白乙酰化修饰的干扰作用
目的构建组蛋白乙酰化酶转录辅激活酶Gcn5基因表达的干扰 shRNA质粒并初步检测其性质,为研究干细胞诱导分化过程中乙酰化修饰所起的调控作用奠定基础. 方法选择7条组蛋白乙酰化修饰关键因子Gcn5基因片段,用带有绿色荧光蛋白(green fluorescence protein, GFP)基因的pGenesil-1作为载体,构建相应7个shRNA质粒.脂质体共转染5-氮杂胞苷 (5-azacytidine, 5-aza)诱导的大鼠间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),利用乙酰化酶特异性抗体Gcn5(H75)对转染细胞进行免疫化学检测,荧光显微镜图象分析系统,记数细胞,在同视野中记数转染阳性细胞以及干扰的阳性细胞,初步计算出其转染率和干扰效率.结果通过限制性内切酶酶切和DNA序列分析,重组质粒shRNA与设计相吻合;免疫细胞化学检测,发现转染阴性对照HK的细胞显现"饱满核",乙酰化作用蛋白表达明显;转染shRNA质粒的细胞呈现十分明显表达减弱的"淡染核"或不表达的"空洞核",转染率和干扰效率分别为93.7%和46.6%.结论构建的shRNA质粒能够达到干扰乙酰化作用的目的,为深入研究乙酰化作用奠定了一定的试验基础.
