缺氧诱导的肝癌靶向性基因治疗载体的构建和检测

目的:构建缺氧诱导的AFP基因启动子(HRE-AFPp)调控的基因表达载体,并检测该调控元件的特异性和对缺氧诱导的反应性.方法:用PCR方法从人类基因组中扩增VEGF基因缺氧反应元件(HRE)和AFP基因启动子(AFPp),将上述片段与含有报告基因(强化绿色荧光蛋白基因)载体pEGFP-1的多克隆位点连接,构建成为缺氧诱导的AFP基因启动子调控的基因表达载体(pEGFP-[HRE]AFPp).用脂质体法将表达载体转染表达或不表达AFP的细胞系,G418筛选阳性克隆,荧光显微镜观测重组AFPp的活性,并用流式细胞术检测缺氧诱导是否对其有调控作用.结果:成功地将HRE、AFPp克隆到报告基因载体pEGFP-1的多克隆位点,酶切鉴定和DNA序列分析无误,荧光显微镜观测证实EGFP能在AFP阳性肝癌细胞特异性表达,流式细胞术检测证实,16 h缺氧诱导能增强EGFP的表达(P＜0.01).结论:缺氧诱导的AFP顺式作用元件修饰的基因治疗载体,在基因转录水平特异性调控目的基因的表达,为下一步将其作为肝癌基因治疗载体奠定了基础.

小鼠淋巴细胞减少症模型的建立及其免疫学意义

目的:以放射线处理建立小鼠淋巴细胞减少症模型并探讨其免疫学意义.方法:1.25 Gy放射剂量照射C57BL/6小鼠,不同时间点计数外周血、脾脏和淋巴结中免疫细胞数,FACS动态分析各淋巴细胞亚群比例改变,RT-PCR检测淋巴细胞中转录因子T-bet、GATA-3的表达.进一步以DC-gp100瘤苗免疫放射处理小鼠,B16F10黑素瘤细胞攻击,观察肿瘤生长的大小.结果:放射线处理后小鼠淋巴细胞数显著减少,CD4+CD25+T细胞比例明显降低;CD44highCD62low记忆样T淋巴细胞形成;T-bet表达明显上调,GATA-3表达无明显改变.与未照射组比较,放射处理小鼠经DC-gp100瘤苗免疫后具有增强抵抗B16F10黑素瘤细胞攻击的效应,肿瘤生长明显减缓.结论:以放射线处理成功建立淋巴细胞减少症模型,并具有增强免疫保护的效应.

Bcl-XL siRNA抑制人结肠癌细胞生长的研究

目的:探讨应用siRNA技术下调Bcl-XL对人结肠癌细胞生长的抑制作用.方法:采用人结肠癌细胞株DLD1,利用人工合成的Bcl-XL靶向小分子干扰RNA(siRNA)转染DLD1细胞,通过Western blot法检测转染细胞Bcl-XL蛋白的表达,流式细胞仪检测处理后细胞的凋亡情况,锥虫蓝染色法计数存活细胞.结果:与空白组和对照组相比,转染Bcl-XL siR-NA组的Bcl-XL蛋白表达显著性下降,凋亡细胞的数量显著增加(P＜0.05),细胞存活率显著降低(P＜0.05).结论:Bcl-XLsiRNA能显著降低人结肠癌细胞的Bcl-XL蛋白表达,有效抑制细胞的生长,为结肠癌的治疗提供了一种新的治疗策略.

RhoC小干扰RNA抑制胃癌细胞的迁移和侵袭

目的:研究Ras homology C(RhoC)在胃癌转移中的作用.方法:利用Vector NTI软件设计并构建RhoC的小干扰RNA(siRNA)载体,利用脂质体介导法将一组RhoC siRNA分别转染胃癌SGC7901细胞.筛选出稳定抗性克隆;Western blot检测RhoC siRNA转染后的抑制效应,Cell Counting Kit-8检测RhoC siRNA转染细胞株的生长速度;MTT法检测转染细胞株对化疗药物的敏感性;损伤刮擦实验和TRANSWELL小室实验分别检测转染细胞株的迁移与侵袭能力.结果:在计算机辅助下成功地设计并构建了5个RhoC的小干扰RNA载体,Western blot显示其中一个RhoC的小干扰RNA RhoC-s362对RhoC的表达有明显的抑制作用;尽管下调RhoC的表达对胃癌细胞的生长和药物敏感性无明显影响,但可显著抑制肿瘤细胞的迁移与侵袭.结论:RhoC siRNA RhoC-s362能够明显抑制胃癌SGC7901细胞中RhoC的表达,并进而抑制胃癌细胞的迁移与侵袭,提示RhoC可能在胃癌转移中发挥重要作用.

慢病毒导入的PLCγ1 siRNA对人大肠癌细胞增殖和黏附的影响

目的:制备在人大肠癌细胞系LoVo中稳定抑制PLCγ1(phospholiase C-gamma 1)的重组病毒,建立PLCγ1表达降低的细胞系,以便客观研究该基因的作用.方法:制备产生PLCγ1 siRNA分子的重组慢病毒,在慢病毒感染LoVo细胞后以杀稻瘟菌素筛选稳定表达细胞系.应用Western-blot和RT-PCR对细胞中PLCγ1的蛋白和mRNA表达水平进行分析,XTF法和黏附能力测定分别检测其对细胞增殖和黏附的影响.结果:PLCγ1 siRNA显著下调了LoVo细胞中PLCγ1的表达,所构建的重组慢病毒导入的siRNA有较高的沉默效率,LoVo细胞的黏附能力显著降低,细胞增殖无明显改变.结论:研究证实了PLCγ1基因可显著地影响大肠癌LoVo细胞的黏附能力,为利用PLCγ1介导的信号通路进行肿瘤基因治疗提供了实验依据.

HPV16Z-Hsp65-E6/E7无佐剂重组蛋白疫苗的研究

目的:研究治疗性HPV16Z-Hsp65-E6/E7无佐剂重组蛋白疫苗的抗肿瘤活性.方法:通过淋巴细胞增殖实验和细胞毒性杀伤实验研究该疫苗激发的细胞免疫反应及反应强度;观察该疫苗对小鼠TC-1肿瘤细胞移植瘤的体内治疗作用和对小鼠生存期的影响.结果:重组蛋白疫苗免疫小鼠后,小鼠脾淋巴细胞与该疫苗体外混合培养增殖明显,并可特异性地在体外杀伤TC-1细胞;体内抑瘤试验显示该疫苗对HPV16病毒转化的TC-1细胞小鼠移植瘤的生长有显著的抑制作用.结论:该疫苗能激发特异性细胞免疫反应;显著抑制HPV16转化的TC-1肿瘤细胞生长.

重组血管抑制剂CHM-Ⅰ对骨肉瘤的治疗作用

目的:观察重组人软骨调节素(chondromodulin,CHM)蛋白对骨肿瘤的治疗作用.方法:利用RT-PCR技术从人软骨组织中扩增出CHM-Ⅰ基因片段,并将其克隆到原核表达载体pET28a,在大肠杆菌中诱导表达和纯化重组人软骨调节素蛋白,将重组蛋白与人脐静脉上皮细胞或MG-63骨肉瘤细胞共培养,观察其对内皮细胞形成管样结构和MG-63骨肉瘤细胞生长的影响;将重组蛋白局部注射裸鼠皮下肿瘤,观察其对肿瘤形成的影响.结果:获得纯化的重组人软骨调节素蛋白,该蛋白在体外可以抑制血管内皮细胞管样结构的形成而对肿瘤细胞的生长无影响;重组蛋白瘤内注射可以抑制肿瘤在裸鼠体内的生长.结论:重组人软骨调节素蛋白通过抑制血管形成而抑制肿瘤生长,具有良好的临床应用价值.

Herceptin联合顺铂对高表达HER-2/neu卵巢癌移植瘤鼠的治疗作用

目的:建立高表达HER-2/neu的人卵巢癌细胞株SKOV3裸鼠腹腔移植瘤模型,探讨Herceptin联合顺铂(cisplantin,cDDP)的治疗作用及其机制.方法:将人卵巢癌细胞株SKOV3接种于裸鼠腹腔,96 h后随机分为4组进行腹腔内注射治疗:对照A组生理盐水,B组cDDP 3 mg/kg,C组Herceptin 1 mg/kg,D组cDDP 3 mg/kg加Herceptin 1 mg/kg,观察各组裸鼠成瘤率、生存期、生存延长率;采用流式细胞术检测不同治疗后肿瘤细胞中Fas、FasL的表达情况;分别取A、D组肿瘤组织予病理学检查及免疫组化染色,观察组织学变化.结果:SKOV3裸鼠腹腔移植瘤HER-2/neu免疫组化染色为++,联合用药后HER-2/neu染色减弱,且凋亡现象明显.Herceptin与cDDP联合用药可明显延长荷瘤鼠的生存期,与单药相比有显著性差异(P＜0.05).Herceptin、cDDP及联合用药后,Fas表达率均明显升高(P＜0.01),但以联合用药组表达率高;而FasL表达率各治疗组较对照组无显著性差异.结论:Herceptin、cDDP能有效抑制高表达HER-2/neu SKOV3裸鼠腹腔移植瘤的生长,延长荷瘤裸鼠的生存期,联合用药组疗效为显著,其机制与CD95调节有关.

用RNAi沉默survivin基因表达对前列腺癌细胞系PC3的影响

目的:运用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术阻断前列腺癌细胞系PC3中survivin基因的表达,并研究survivin基因沉默后对PC3细胞产生的影响.方法:用真核转录载体pSilencerTM3.1-H1 neo构建针对survivin基因的重组真核转录载体pSilencer 3.1-SVV1、pSilencer 3.1-SVV2和pSilencer 3.1-SVV3,并用脂质体法转染前列腺癌细胞系PC3,通过RT-PCR、蛋白印迹实验检测survivin的表达变化,并用流式细胞术、MTT法检测转染后PC3细胞的凋亡、细胞周期、细胞生长速度、对顺铂的敏感性等方面的变化.结果:重组载体pSilencer 3.1-SVV2和pSilencer 3.1-SVV3有效地阻断了PC3细胞中survivin基因在mRNA和蛋白水平上的表达(P＜0.01).重组载体转染PC3细胞后,与对照组相比,细胞的凋亡增加了10%～15%;细胞生长速度明显变慢,其细胞数在84 h时与对照组相比减少约30%;G1期细胞增加了10%,G2期和S期细胞减少了5%以上.加入顺铂后,pSilencer 3.1-SVV2、pSilencer 3.1-SVV3重组质粒转染的PC3细胞的存活数下降了35%～45%,细胞凋亡则增加了10%～14%.结论:初步证明了survivin基因在前列腺癌细胞分化增殖、抗凋亡等方面所扮演的重要角色,为进一步阐明survivin基因与前列腺癌的关系以及以survivin基因为靶点的前列腺癌基因治疗研究奠定了基础.

抗γ-精浆蛋白人-鼠杂合Fab噬菌体抗体库的构建及导向筛选

目的:建立人-鼠杂合Fab噬菌体抗体库,筛选抗γ-精浆蛋白(γ-sm)人源性抗体轻链.方法:PCR扩增前列腺癌患者外周血淋巴细胞人抗体全套轻链基因,克隆入含鼠源抗γ-sm抗体Fd基因的pComb3X噬粒中,建立人-鼠杂合Fab噬菌体抗体库.通过稀释滴定、限制性酶切等分别对库容、基因重组率和多样性进行鉴定.以M13K07辅助噬菌体超感染,利用纯化的γ-sm对杂合库进行筛选,对筛出的阳性克隆进行功能检测.结果:构建了库容量为1.2×107CFU、重组率为90%、多样性好的人-鼠杂合噬菌体抗体库.ELISA检测出2个强阳性克隆,Western blot确证为抗γ-sm的人-鼠杂合Fab,竞争ELISA显示其表观亲和力约为亲本鼠抗体亲和力的71.8%.DNA测序显示筛到的人源轻链可变区基因属IGKV4-1*01胚系家族.结论:成功得到人源性抗γ-sm抗体轻链,为进一步获得全人源化抗体奠定了基础.

靶向生存素基因siRNA诱导骨肉瘤细胞株U-2OS的凋亡

目的:体外转录合成生存素(survivin)基因siRNA,观察其在骨肉瘤细胞株U-2OS中抑制survivin基因后细胞增殖及细胞凋亡情况.方法:将U-2OS细胞分为A组(空白对照组)、B组(非特异性转染组)、C组(特异性转染组),在荧光显微镜下观察转染前后细胞形态的改变,用RT-PCR和Western blot法分别检测转染前后survivin基因mRNA和蛋白的干涉效果,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,并比较各组结果.结果:荧光显微镜下可见转染后细胞增殖变慢,凋亡细胞增加;RT-PCR结果显示survivin siRNA明显抑制survivin基因mRNA表达.Western blot法检测C组蛋白阳性表达率比A、B两组显著降低(P＜0.01);特异性转染组的细胞增殖缓慢,与其它两组比较有显著性差异(P＜0.01).流式细胞仪检测C组细胞凋亡率与其他两组比较有显著性差异(P＜0.01).结论:体外转录合成特异性survivin siRNA能有效抑制U-2OS细胞中survivin mRNA及蛋白表达,从而抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡.RNA干扰技术为骨肉瘤的基因治疗提供了一种新策略.

硫代修饰脂质体包裹反义VEGF寡核苷酸对肺癌血流的影响

目的:探讨硫代修饰脂质体包裹的反义VEGF寡核苷酸对肺癌血流的抑制作用.方法:40只C57BL/6小鼠右腋皮下接种Lewis肺癌细胞后,随机分为4组:VEGF反义寡核苷酸组(ASODN)、VEGF正义寡核苷酸组(SODN)、VEGF错义寡核苷酸组(MODN)及对照组.接种24 h内,4组小鼠分别皮下注射经脂质体包裹的ASODN、SODN及MODN进行治疗,对照组只注射脂质体,每周2次,连续4周.观察各组小鼠肿瘤的生长情况,超声检测肿瘤血管的收缩期峰值速度(PS)及阻力指数(RI),原位杂交法及RT-PCR法对肿瘤内VEGF mRNA表达水平进行检测.结果:ASODN组小鼠肿瘤生长受到显著抑制,PS、RI与其它各组相比有明显差异(P＜0.01),VEGF mRNA表达水平亦有明显降低.结论:硫代反义VEGF寡核苷酸能明显抑制肺癌血流,从而抑制肿瘤生长.

γ-干扰素增强他莫昔芬抗乳腺癌作用的体外研究

目的:研究γ-干扰素(γ-IFN)对他莫昔芬(TAM)抗乳腺癌细胞的增强作用.方法:在体外培养条件下,分别或联合应用γ-干扰素、TAM或雌二醇(E2)作用于雌激素受体(estrogen receptor,ER)阳性的MCF-7和ER阴性的MDA-MB-231人乳腺癌细胞株,用MTF比色法分析细胞生长抑制作用,流式细胞仪检测细胞周期分布,DNA凝胶电泳和流式细胞仪检测细胞凋亡.结果:TAM能抑制ER阳性和阴性的乳腺癌细胞的生长,阻滞细胞周期于G0/G1期,并可诱导细胞凋亡;相同浓度条件下,TAM对ER阳性乳腺癌细胞的抑制作用强于对ER阴性的乳腺癌细胞.同时,TAM能拮抗外源性雌激素对MCF-7细胞的促生长作用,而对MDA-MB-231细胞的生长抑制作用与雌激素的存在与否无关.γ-干扰素预处理细胞24 h后,TAM抗乳腺癌细胞的作用增强.结论:体外条件下,TAM有抗ER阳性和阴性乳腺癌细胞作用,作用机制是通过影响细胞周期,诱导细胞凋亡,γ-干扰素能加强TAM的抗乳腺癌作用.

作为免疫相关性疾病靶点的DcR3的研究进展

诱骗受体3(decoy receptor 3,DcR3)是肿瘤坏死因子受体超家族的新成员.它通过拮抗Fas/FasL系统及LIGHT/LTβR、LIGHT/HVEM/TR2系统的作用,在肿瘤及免疫性疾病中发挥重要作用.DcR3的基因位于20q13.3,在人肿瘤细胞中会发生基因扩增和重排;在多种肿瘤、自身免疫疾病中高表达;作用机制有LIGHT和配体FasL途径等;促肿瘤发生;可下调宿主免疫功能,能降低T细胞对同种抗原应答,有重大开发潜能.

4-1BB/4-1BBL介导DC和T细胞共刺激作用的研究进展

4-1BB(CD137)和4-1BB配体(4-1BBL)属于肿瘤坏死因子/肿瘤坏死因子受体(TNF/TNFR)超家族成员,在树突状细胞(DC)及部分T细胞上表达.4-1BB和4-1BBL相互作用,通过一系列信号转导,激发未成熟DC的分化成熟,并且通过TRAF2和MAPK途径,使未成熟DC介导初始型T细胞活化进而向Th1型细胞转化,从而产生有效的记忆性CTL和效应性CTL.深入探讨4-1 BB和4-1 BBL的作用机制,可能为肿瘤等疾病的治疗提供新思路.

肿瘤的单抗靶向疗法在国内的研究和应用进展

随着生物技术的发展,单抗靶向治疗肿瘤显示了良好前景.在基础研究领域,主要集中在将抗体与化学药物、酶、放射性核素、毒素和生物诱导剂等偶联后直接杀伤肿瘤或者利用抗体促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤血管生成等方面.在临床已有多种单抗药物投入使用,其中用于造血系统肿瘤的治疗效果较好,治疗实体肿瘤方面也取得了进展.

抗体治疗造血系统肿瘤的临床效果

肿瘤的抗体治疗指用特异性抗体或抗体片段治疗肿瘤,是当前医药学研究的热点之一.造血系统肿瘤包括淋巴瘤和白血病,虽然放疗和化疗可缓解大多数造血系统肿瘤,但仍存在复发和治疗无效(难治)的患者.抗体治疗以其较高的有效率和安全性为复发和难治的患者提供了一种选择.

奥曲肽对裸鼠皮下胃癌种植瘤生长及侵袭转移的影响

近年来研究表明胃癌的生长分化受多种胃肠肽类激素的调控,生长抑素(somatostatin,SST)可能起重要的作用.本研究旨在探讨SST类似物奥曲肽(octreotide,OCT)对胃癌裸鼠种植瘤生长及侵袭转移的影响.

原位杂交检测白血病细胞表皮生长因子受体基因的表达及其临床意义

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜表面受体,其介导的信号转导效应具有多向性,包括细胞增殖分化、迁移和内环境的稳定,并与细胞的再生和恶性转化密切相关[1],在人类多种恶性肿瘤中存在高表达.近年的研究进一步表明,某些实质性肿瘤如喉癌,其EGFR表达随肿瘤的恶性程度和浸润转移性而增强,且与肿瘤的发生和预后明显相关[2].在造血肿瘤细胞SKT6中也发现EGFR的表达[3].本课题应用敏感性高、特异性强的检测基因mRNA序列的原位杂交技术,检测急性白血病细胞EGFR基因的表达,探讨EGFR在急性白血病中的作用及其临床意义.

RAd-ODC/Ex3as对肺癌A-549细胞的抑制作用

鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase,ODC)是多胺生物合成途径中的第一个限速酶.据报道,ODC的含量在许多肿瘤中增高,并与肿瘤的复发有一定的关系.为探讨以ODC为靶标进行反义基因治疗的可行性,本实验利用表达ODC第三外显子反义RNA的腺病毒介导的rAd-ODC/Ex3as,将腺病毒介导的ODC反义RNA转入肺癌A-549细胞中,观察其体外抑制肺癌细胞的作用.

活化型抗CD40抗体对人成熟和未成熟DC的不同作用