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伸长细胞促进中枢神经元轴突再生的研究
伸长细胞是中枢神经系统中一种主要位于第三脑室底部腹侧壁和正中隆起处室管膜上的特殊分化的胶质细胞,与局部的脑脊液、血液、神经元均有密切联系,是血-脑脊液屏障、脑-脑脊液神经体液回路和神经-免疫-内分泌网络共同的组成部分,并且参与成年哺乳动物下丘脑内自然发生的轴突再生过程.研究发现,伸长细胞具有促进中枢神经元轴突再生的功能,并有望成为继嗅球成鞘细胞之后又一种用于脊髓损伤修复的移植细胞.对伸长细胞的起源、特性、促进中枢神经元再生的实验研究及可能机制进行综述.
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嗅球成鞘细胞的分离培养与鉴定
目的:探讨一种获取高纯度嗅球成鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)的方法.方法:从新生SD大鼠(3d)嗅球中迅速分离嗅神经层和嗅颗粒层,采用酶消化法分离细胞,差速贴壁法纯化细胞,接种于多聚赖氨酸包被的培养板内培养2d,采用NGFRp75和S100蛋白双标免疫组化、以Hoechst33342复染鉴定OECs的纯度.结果:OECs的纯度为(95.64±2.76)%.结论:本法是一种相对简便易行且经济、稳定、有效的OECs分离方法.
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嗅球成鞘细胞移植对脊髓半横断后脊髓灰质内Ca2+荧光强度的影响
目的:研究嗅球成鞘细胞(OECs)的移植对脊髓半横断后脊髓灰质细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)的影响,探索OECs促进脊髓再生的机制.方法:将体外培养的OECs制成细胞悬浮液移植到上颈段脊髓半横断的动物模型中,用激光扫描共聚焦显微镜观察颈段脊髓厚片[Ca2+]i荧光强度的变化.结果:移植组与损伤组比较,损伤组损伤侧与非损伤侧[Ca2+]i荧光强度差异非常显著;而移植组损伤侧与非损伤侧[Ca2+]i荧光强度无显著差异.结论:(1)OECs对脊髓的再生有良好的促进作用;(2)OECs能够抑制[Ca2+]i的升高,改善损伤部位的微环境.
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大鼠嗅球成鞘细胞的体外原代培养、纯化及鉴定
脊髓损伤所致的瘫痪往往导致显著性的机体功能障碍乃至功能丧失,而脊髓损伤后轴突再生困难是引起上述结果主要原因之一,其治疗亦是医学界公认的难题.19世纪末期西班牙组织学家Blanes Viale首先描述:嗅神经鞘细胞(简称嗅鞘细胞,olfactory ensheathing cells,OECs)具有施旺细胞和星形胶质细胞双重特性[1].研究者们开始关注之并对其进行了研究.
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嗅球成鞘细胞的移植能够促进中枢神经再生
嗅球成鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)不同于星形胶质细胞,也不同于Schwann细胞,是性质独持的单独一类胶质细胞.实验证实,它的移植对中枢神经的再生有很好的促进作用,这使中枢神经的再生又有了一个新的研究思路.国外学者对它的特性、功能等方面做了一些探讨,并取得了一定的成绩,我们对此做了一个较全面的综述.
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周围神经组织工程中种子细胞的新研究进展
典型的组织丁程化人工神经主要包括种子细胞、支架材料以及有助于细胞生长、分化的细胞外基质,其中数量足够、不引起免疫排斥且有再生活力的种子细胞是其前提和基础.
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嗅球成鞘细胞的培养纯化及与功能相关的形态学研究
目的培养纯化嗅球成鞘细胞(Olfactory ensheathing cells, OECs)并对其进行免疫细胞化学研究,探讨其相关功能.方法分离嗅球嗅神经纤维层获得嗅球成鞘细胞,采用免疫溶解法对培养的嗅球成鞘细胞进行纯化,并利用免疫细胞化学方法和电镜技术进行形态学观察.结果通过纯化可以使培养的OECs纯度达95%以上,免疫细胞化学显示OECs表达P75NGFr、GAP43、N-CAM和GFAP;电镜结果显示OECs呈分叶状核,胞浆电子致密,胞膜有伪足样皱褶.结论免疫溶解法可以较好的纯化OECs并保持其良好的生长状态,培养的OECs表达P75NGFr、 GAP43、N-CAM可能与其促进轴突再生的功能相关.
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大鼠嗅球成鞘细胞的分离、培养与鉴定
目的探讨大鼠嗅球成鞘细胞(Olfactory ensheating cells,OECs)分离与培养的方法.方法无菌条件下嗅球置于少量人工脑脊液中,用眼科镊子直接将嗅球撕烂、挤压,得片状组织块,胰酶消化,吹打,细胞悬液进行培养.结果本方法分离、培养的OECs具有双极或多极突起,且突起十分细长,神经生长因子受体和胶质纤维酸性蛋白免疫组化呈阳性.结论该方法简便易行,为深入研究OECs神经生物学特性、阐明促进中枢神经元轴突生长的作用机制打下基础.
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OEC-SC-ECM-PLGA桥接体对大鼠坐骨神经缺损的解剖学修复作用
目的 研究OEC-SC-ECM-PLGA桥接体对大鼠坐骨神经缺损的解剖学修复作用.方法 建立15 mm的SD大鼠右侧坐骨神经缺损模型后,用OEC、SC、ECM以及自行制备的PLGA导管构成OEC-SC-ECM-PLGA桥接体进行修复,同时设OEC-ECM-PLGA组、SC-ECM-PLGA组、ECM-PLGA组、PLGA组和自体神经移植组进行对照.术后1、3、6、9周OEC-SC-ECM-PLGA组、OEC-ECM-PLGA组和SC-ECM-PLGA组行细胞示踪检测,在术后9周各组行神经连接率、再生神经相对直径恢复率及超微结构检测.结果 OEC和SC可在桥接体内至少存活6周,SC的存活率高于OEC,两者沿神经纵轴呈梭形分布,并向桥接体近心端和远心端坐骨神经内迁移至少2.5 mm,OEC-SC-ECM-PLGA组的神经连接率、再生神经相对直径恢复率、有髓神经纤维密度、总神经纤维数及有髓神经纤维成熟度优于OEC-ECM-PLGA组、SC-ECM-PLGA组、ECM-PLGA组和PLGA组,还未达到自体神经移植组水平.结论 OEC和SC可在缺损坐骨神经桥接体内存活,沿神经纵轴分布,并向桥接体两端坐骨神经内迁移.OEC-SC-ECM-PLGA桥接体对大鼠坐骨神经缺损具有显著的解剖学修复作用.
关键词： 嗅球成鞘细胞 雪旺细胞 聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物 坐骨神经缺损 -
外周神经损伤后嗅球成鞘细胞对神经元的保护作用
成年哺乳动物的嗅神经系统是极少数可以再生的中枢神经系统之一.研究表明,其再生能力与嗅球成鞘细胞(Olfactory ensheating cell,OECs)密切相关,在嗅神经再生的过程中OECs不仅可诱导再生神经纤维长入中枢的嗅球,对其具有机械保护作用,而且可分泌多种生物活性物质.本实验采用大鼠坐骨神经离断模型,用硅胶管套接坐骨神经断端,局部注射培养的OECs 细胞悬液,并以SAL进行对照,分别于术后7、14、30天取脊髓L4-6节段,应用尼氏染色观察脊髓前角运动神经元数目、形态的变化;应用亚铁氰化铜法进行胆碱酯酶(C hE)染色、硫化铝法进行酸性磷酸酶(ACP)染色,观察脊髓前角运动神经元ChE及 ACP的变化情况.尼氏染色结果示术后7、14、30天,SAL组脊髓前运动神经元的存活率分别为83.33%、78.61%和70.16%;OECs组脊髓前角运动神经元的存活率分别为90.86%、87.13%和82.69%,两组间存在显著差别.C hE染色结果显示术后7、14、30天,ChE酶实验侧和正常侧比例SAL组分别为 8 6.64%、81.59%和75.03%;OECs组分别为91.52%、86.84 %和81.82%,两组间有显著差别.ACP染色结果表明术后7、14、30天,AC P酶实验侧和正常侧比,SAL组分别为85.18%、81.23%和76.81%;O ECs组分别为90.70%、86.04%和81.10%,两组间有显著差异.从以上结果可以得出结论,嗅球成鞘细胞能减少脊髓修复侧前角运动神经元死亡的数目, 降低脊髓前角运动神经元ChE及ACP变化的幅度,这表明OECs能保护周围神经切断后引起的神经元损伤.
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嗅球成鞘细胞在坐骨神经损伤后功能恢复中的作用
目的探讨嗅球成鞘细胞(OECs)在坐骨神经损伤后促进神经功能恢复中的作用. 方法 SD大鼠30只随机分成对照生理盐水(SAL)组和实验(OECs)组,采用硅胶管套接大鼠切断的坐骨神经,硅胶管内对照组给予SAL,实验组给予培养成活的新生大鼠OECs悬液,分别于术后30或90天,应用电生理检测、HRP逆行示踪法及轴突图像分析检测损伤的神经在电传导轴浆运输、髓鞘再生等方面的恢复情况. 结果术后30和90天,OECs组与SAL组比较:① OECs组损伤侧下肢复合肌肉动作电位(CMAP)的潜伏期(LAT)分别缩短了0.60 ms和0.56 ms;神经传导速度分别加快了6.42 m/s和5.36 m/s;波幅分别增加了3.92 mv和5.84 mv;② OECs组损伤侧脊髓前角HRP阳性细胞率分别增加了11.63%和25.01%;③ OECs组坐骨神经纤维数目分别增加了1 047个/mm2和1 422个/mm2;神经髓鞘厚度分别增加了0.43 μm和0.63 μm. 结论嗅球成鞘细胞对周围神经损伤后的神经功能恢复有积极的促进作用.
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成年大鼠嗅球成鞘细胞的原代培养
本实验取材于成年Wistar大鼠嗅球的外两层,进行原代培养嗅球成鞘细胞,用胶质纤维酸性蛋白抗体免疫组化方法确认.结果显示:(1)培养至第10 d,原代培养物多见两种形态的细胞:一种为单极、双极或多极细胞,带有细长的突起;另一种为所谓"煎蛋样"细胞,扁平状,胞质少极化,边缘不规则;(2)胶质纤维酸性蛋白反应显示这两种细胞均呈阳性,Nissl法复染后,可计数其纯度为70%～85%.
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嗅球成鞘细胞在挫伤脊髓内的成髓鞘作用
目的 观察嗅球成鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)在损伤脊髓内的成髓鞘作用及其对髓鞘形成的影响. 方法 用NYU-Ⅱ型脊髓撞击器(强度为10 g×25 mm)损伤大鼠T10脊髓后1周,将绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)-OECs植入脊髓损伤部位及其首尾两侧,设为OECs移植组;以同量改良Eagle培养基(Dulbecco's modification of Eagle's medium,DMEM)注射作为对照组.移植后6周,取出脊髓做冰冻切片,行髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)、0蛋白(protein zero,P0)和S100蛋白(S100 protein,S100)免疫细胞化学染色,定性和半定量观察免疫染色情况;并行塑料包埋后半薄和超薄切片,先于光镜下进行定性和半定量观察,再于电镜下观察髓鞘的超微结构. 结果 OECs移植组S100、MBP、P0所显示的有髓神经纤维由正常组织向损伤区延伸,并可贯穿损伤区,所显示的纤维分别占损伤区面积的12.3％、11.6％和9.3％,且3种蛋白显示的神经纤维数量差异无统计学意义,但均显著高于对照组(2.89％)(P＜0.01).OECs移植组半薄切片上移植组损伤区内有髓神经纤维的数量为(354.67±59.00),较对照组的(167.33 ±42.16)明显增多(P＜0.01),OECs移植组形成的髓鞘较对照组直径小、髓鞘薄. 结论 OECs可以促进再生神经纤维髓鞘形成,部分OECs自身形成髓鞘,但髓鞘结构较薄.
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嗅球成鞘细胞对新生大鼠皮层神经元的影响
目的观察嗅球成鞘细胞(OECs)培养液对培养中的新生大鼠大脑皮层神经元的影响.方法原代培养新生大鼠OECs和大脑皮层神经元;收集含有OECs分泌物的培养液并以不同剂量添加到正在培养的神经元中,观察神经元正常及损伤时的生长情况.结果培养的OECs形态学观察及神经生长因子受体(p75NGFR)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、胶质细胞源性营养因子(GDNF)免疫组化阳性反应均与报道一致.OECs培养液(0.4～1.0ml)能明显促进神经元生长速度,并能有效地减少受损神经元的崩解.结论 OECs有促进正常神经元生长、保护损伤神经元的作用,这可能与OECs分泌多种生物活性物质有关.
