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电刺激小脑顶核与局灶性脑缺血再灌注时钙蛋白酶活性的关系
目的观察电刺激小脑顶核( FN)对局灶性脑缺血再灌注后钙蛋白酶活性的影响,以阐明电刺激 FN在脑缺血再灌注中的神经保护作用机制.方法健康雄性 Wistar大鼠,共 120只,体质量 250～ 300 g.随机分入假手术组( PO)、 FN电刺激假手术组( PO- FN)、缺血 /再灌注组( I/R)及缺血 /再灌注- FN刺激组( I/R- FN),后两组又分为再灌注 1,3,6,12及 24 h组,每组 10只.建立大鼠小脑 FN电刺激及局灶性脑缺血再灌注模型,应用 Western印迹半定量钙蛋白酶介导的 150 RU胞衬蛋白降解产物含量(可表示钙蛋白酶活性)及尼氏体染色进行神经元数量及形态分级评分,观察电刺激 FN对缺血再灌注不同时间后,再灌注区钙蛋白酶活性及神经元损害程度的影响.结果再灌注 1～ 3 h, I/R组钙蛋白酶活性较 I/R- FN组增高更显著 [分别由( 6 310± 360),( 4 660± 310) /μ g总蛋白增高至( 7 060± 290),( 6 240± 310) /μ g总蛋白, t=7.776,P=0.000及 t=4.267,P=0.003].再灌注 6～ 24 h, I/R组钙蛋白酶活性不断增高,较 FN- I/R组相应时点相比差异有极显著意义(各组 P=0.000). I/R组从再灌注 1 h(2.1± 0.2)开始,神经元形态数量评分迅速增加,并随着再灌注时间延长,评分不断增高,至再灌注 24 h(4.0± 0.0)达高. I/R- FN组再灌注 1～ 3 h,神经元形态数量评分轻度增加,其后趋于稳定.至再灌注 24 h,神经元皱缩加重,神经元形态数量评分再次增加,但各组评分均显著低于 I/R相应时点组 (z=2.356,P=0.018; z=2.008,P=0.045; z=2.887,P=0.004; z=2.685,P=0.007; z=2.835,P=0.005).结论电刺激 FN可抑制局灶性脑缺血再灌注后钙蛋白酶活性,起神经保护作用.
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地塞米松诱导胸腺细胞凋亡在神经免疫性疾病研究中的意义
目的观察地塞米松诱导胸腺细胞 caspase- 3蛋白与 p38MAPK的表达变化,探讨地塞米松诱导胸腺细胞凋亡在神经免疫性疾病研究中的意义.方法采取体外细胞培养 Balb/c小鼠 (体质量 20 g左右的 Balb/c小鼠 , 雌雄不限 )胸腺细胞的方法,制备地塞米松诱导的细胞凋亡模型,通过流式细胞仪观察凋亡细胞数量的变化情况.运用 Western blotting技术检测地塞米松处理的 Balb/c小鼠胸腺细胞 0, 30, 60, 180 min时相点 caspase- 3蛋白与 p38MAPK的表达变化.结果地塞米松可以诱导 Balb/c小鼠胸腺细胞发生凋亡,发生的比例是 21.75%.随后的 western blot检测显示,伤后即刻 p38MAPK开始表达,并在 60 min达到高峰,随后有所减弱.而 caspase- 3蛋白的表达开始较弱呈逐渐升高的趋势,一直持续至伤后 180 min.结论 p38MAPK信号通路在地塞米松诱导的 Balb/c小鼠胸腺细胞凋亡过程中起重要作用.
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电刺激小脑顶核对持续局灶性脑缺血时钙蛋白酶活性的影响
目的观察电刺激小脑顶核( FN)对持续局灶性脑缺血钙蛋白酶活性的影响,以阐明其神经保护作用机制.方法健康雄性 Wistar大鼠,随机分为假手术组( PO)、 FN刺激假手术组( PO-FN)、持续缺血组( PI)及持续缺血-FN刺激组( PI -FN),后两组又分为缺血 1,3,6,12及 24 h组.建立大鼠电刺激 FN及持续局灶性脑缺血模型,应用 Western印迹半定量各组缺血核心区 Mr=150 000 FBDP含量(表示钙蛋白酶活性),并应用尼氏体染色对缺血核心区神经元数量及形态进行分级评分.结果 PO组及 PO-FN组钙蛋白酶活性相似( P >0.05),处于低水平. PI组钙蛋白酶活性从缺血 1 h[(3 670± 600) A/μ g 总蛋白 ]开始即显著增高( t=6.338, P< 0.001),以后随着缺血时间延长,钙蛋白酶活性不断增高,直至缺血 24 h[(9 180± 360) A/μ g 总蛋白 ]仍有持续增高趋势(缺血 12,24 h, t=14.673,16.632, P< 0.001). PI-FN组随着缺血时间的延长,钙蛋白酶活性从缺血 1 h[(2 510± 460) A/μ g 总蛋白 ]也开始增高,以后随着缺血时间延长,钙蛋白酶活性不断增高,但各时点组与其相应 PI组相比,其增高程度明显减低,差别具有显著意义(缺血 1,24 h,t=1.875,2.134, P< 0.05). PO组及 PO-FN组神经元形态及数量正常,评分均为 0分. PI组从缺血 1 h(0.8± 0.3)开始,神经元形态、数量即出现轻度改变,其评分增高( z=2.443, P< 0.01),以后随着缺血时间延长,评分不断增高,至缺血 24 h(4.0± 0.0),评分达高(缺血 3,24 h,z=2.621,2.965, P< 0.01). PI-FN组缺血 1～ 12 h内,各组评分均比 PI相应时点组显著降低(缺血 1,12 h, z=1.875,2.018, P< 0.05).但到缺血 24 h(3.9± 0.2),其评分与 PI相应时点组相比无显著意义( P >0.05).结论电刺激 FN可抑制局灶性脑缺血时钙蛋白酶活性,起神经保护作用.
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植物提取剂福司柯林对心房钠尿肽分泌的调节作用
目的:观察从植物中提取的腺苷酸环化酶直接激活剂--福司柯林对心房钠尿肽分泌的影响及其机制.方法:实验于2004-09/2005-09在吉林省延边大学医学部基础医学院生理学与病理生理学教研部完成.取大耳白兔26只,麻醉后立即开胸取出心脏,剥离左心房后固定心房灌流装置上,并给予适宜的电刺激使其搏动.利用体外灌流搏动的家兔心房做以下实验:①待心房搏动稳定之后,经过一个对照组循环(每12 min定为一个实验循环),处理福司柯林(1 μmol/L)3个循环.②经过一个循环对照组之后,先处理L-型Ca2+通道阻断剂硝苯地平(1 μmol/L)或蛋白激酶非选择性抑制剂staurosporine(1 μmol/L)3个循环,在硝苯地平或staurosporine存在下再处理福司柯林追加3个循环.以上实验均采用放射免疫技术和实时测定环-磷酸腺苷方法观察福司柯林对心房搏出量、环-磷酸腺苷逸出量及心房钠尿肽分泌的影响.结果:①福司柯林(1μmol/L)明显抑制心房钠尿肽分泌(P＜0.01),同时显著增加心房搏出量和环-磷酸腺苷逸出量(P＜0.01);在一定范围内,环-磷酸腺苷生成越多心房钠尿肽分泌越受抑制,并呈现线性关系(Y=-5.268 X+9.506,r2=0.971,P＜0.001).②硝苯地平(1μmol/L)未能改变福司柯林对心房钠尿肽分泌的抑制和促进环-磷酸腺苷的生成效应(P＜0.01),但显著抑制心房搏出量(P＜0.01).③staurosporine+福司柯林明显增加环-磷酸腺苷逸出量(P＜0.01)的同时显著抑制心房钠尿肽的分泌(P＜0.01),但心房搏出量并没有受到环-磷酸腺苷生成增多的影响,且心房钠尿肽的分泌与staurosporine(第3个循环)相比并没有显著性差异.结论:腺苷酸环化酶直接激活剂福司柯林主要通过蛋白激酶-依赖的信号转导途径抑制心房钠尿肽分泌.
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氯沙坦干预早期动脉粥样硬化家兔内膜增生的相关因素
目的:探讨血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂氯沙坦对加速性动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)早期家兔血管单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattract antprotein-1.MCP-1)及丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)蛋白表达的影响.方法:以家兔加速性动脉粥样硬化早期模型为研究对象,将24只家兔随机分成对照组、早期动脉粥样硬化组和氯沙坦干预组,每组8只,采用组织学、免疫细胞化学和生物化学方法评价加速性AS早期家兔血管组织学、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、MAPK和MCP-1蛋白表达和组织胆固醇含量的改变.结果:早期动脉粥样硬化组血管内膜与中膜厚度比值、内膜PCNA阳性细胞数明显增加,MAPK与MCP-1蛋白表达平均光密度值均显著增加(P＜0.001),氯沙坦干预组内膜与中膜厚度比值较早期动脉粥样硬化组显著下降(0.92±0.10和0.23±0.04,t=30.086,P＜0.001),PCNA阳性细胞数明显减少(t=23.944,P＜0.001),血管壁MAPK与MCP-1蛋白表达水平明显下降(0.025±0.006和0.054±0.007,0.057±0.006和0.205±0.019,F=265.14,410.55,P＜0.001),主动脉组织胆固醇含量明显降低(t=3.913,P＜0.05).结论:氯沙坦干预可抑制血管损伤时MCP-1及MAPK蛋白表达,减轻加速性AS病变血管内膜增生,减少胆固醇在血管壁沉积,从而可能在预防AS发生过程中起重要作用.
关键词： 动脉粥样硬化 单核细胞化学吸引蛋白质类 蛋白激酶类 抗高血压药 兔 -
不同胎龄胎儿皮肤内应激活化蛋白激酶基因的表达及其变化
目的:探讨应激活化蛋白激酶1,应激活化蛋白激酶2,应激活化蛋白激酶3及其上游信号分子(分子丝裂素活化蛋白激酶激酶4和分子丝裂素活化蛋白激酶激酶7)基因在不同胎龄的胎儿皮肤和出生后机体皮肤组织中的表达及其变化特征.方法:实验于2004-01/05在解放军军事医学科学院放射医学研究所毒理研究室完成.用病理学技术检测不同发育时期皮肤的结构特征后,提取18例不同胎龄(13～32周)的胎儿皮肤和6例出生后机体(4～16岁)皮肤组织的总RNA,分离mRNA,用反转录-多聚酶链反应方法检测这5种基因在不同组织中的表达变化规律.结果:在早期妊娠胎儿的皮肤组织中,应激活化蛋白激酶2,应激活化蛋白激酶3,分子丝裂素活化蛋白激酶激酶4和分子丝裂素活化蛋白激酶激酶7基因表达较弱,分别为0.277±0.084,0.077±0.020,0.004±0.005,0.060±0.012,随着胎龄的增加,皮肤组织内这4种基因表达水平逐渐升高,分别为0.383±0.072,0.168±0.078,0.046±0.005,0.105±0.052,在出生后机体皮肤中,这4种基因的转录含量升至高,分别为0.571±0.061,0.220±0.054,0.081±0.007,0.103±0.027,分别是早期胚胎皮肤的2.1,2.9,20.1和1.7倍(P＜0.01).应激活化蛋白激酶1基因表达水平在中期妊娠胎儿皮肤组织中升至大为0 307 ±0.028,然后随着胎龄的增加,该基因表达量逐渐降低,在出生后机体皮肤内该基因表达量是0.111±0.002,与早期妊娠胎儿皮肤相比基因表达水平显著降低(P＜0.05).结论:在早期胚胎皮肤组织中,应激活化蛋白激酶2,应激活化蛋白激酶3,分子丝裂素活化蛋白激酶激酶4和分子丝裂素活化蛋白激酶激酶7基因的低表达可能与皮肤细胞快速增殖、创面迅速愈合、细胞趋向凋亡减少相关.
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加味补肝汤对糖尿病周围神经病变大鼠背根节p38丝裂素活化蛋白激酶表达的干预作用
目的:观察中药加味补肝汤对链脲佐菌素致糖尿病周围神经病变大鼠背根节的保护作用.方法:实验于2005-02/09在湘雅医院中西医结合研究所完成.①选用健康雄性Wistar大鼠40只.随机抽取10只大鼠为正常对照组,给予等体积的枸橼酸缓冲液一次性腹腔注射.其余30只大鼠禁食12 h后腹腔内1次注射1%链脲佐菌素溶液50 mg/kg,3 d后血糖浓度＞16.7 mmol/L者确定为糖尿病模型造模成功.随机其分为3组:模型组、加味补肝汤组、牛磺酸组,每组10只.造模稳定1周后,加味补肝汤组应用加味补肝汤治疗,该方由枸杞15 g,木瓜15 g,当归10 g,川芎10 g,熟地12 g,白芍15 g,桑寄生15 g,麦冬15 g,天花粉15 g等组成,按13.6 g/(kg·d)灌胃,1次/d,连续8周.模型组及正常对照组大鼠自由进食水,牛磺酸组饮含1%牛磺酸的蒸馏水.②8周后应用计算机图像处理分析技术对免疫组化结果进行定量分析,通过Motic Images Advanced彩色图形处理分析系统,测定免疫反应产物p38丝裂素活化蛋白激酶的灰度值,测定结果扣除背底及阴性值,免疫组化产物染色越深,灰度值就越小,抗原物质的含量就越高,表达强度越高.采用免疫组化方法检测各组大鼠背根节内p38丝裂素活化蛋白激酶表达,化学比色法测定血清丙二醛含量.③计量资料差异比较采用t检验.结果:整个观察过程中,正常对照组无动物死亡,加味补肝汤组死亡3只,牛磺酸组、模型组各死亡2只,终进入结果分析正常对照组10只,加味补肝汤组7只,牛磺酸组和模型组各8只.①大鼠背根节内p38丝裂素活化蛋白激酶表达强度及血清丙二醛水平:模型组明显高于正常对照组(P＜0.01),加味补肝汤及牛磺酸组低于模型组(P＜0.05～0.01).②正常对照组未见或者及少量可见p38阳性表达,模型组、牛磺酸组、加味补肝汤组可见p38阳性细胞,以模型组阳性表达细胞多且着色深.结论:中药加味补肝汤具有抗氧化损伤、明显保护链脲佐菌素致糖尿病周围神经病变大鼠背根节的作用,可能与其能抑制p38丝裂素活化蛋白激酶通路、抗脂质过氧化反应有关.
关键词： 糖尿病神经病变/中药疗法 蛋白激酶类 神经节 脊 -
砷剂防治哮喘气道炎症的分子机制:砷剂对丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶基因表达作用的研究
目的:研究三氧化二砷对T细胞丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶(mitogen-activated protein kinase phosphatase,MKP-1)基因表达的影响,探讨砷剂治疗哮喘气道炎症的分子机制.方法:本研究采用定量PCR的技术研究Hut-78 T细胞在不同浓度三氧化二砷(5 μmol/L和1 μmol/L)作用下,在不同时间段(3 min,10 min,20 min,30 min及1 h),T细胞内MKP-1 mRNA的表达水平.结果:Hut-78细胞在经过砷剂处理后,细胞内MKP-1 mRNA水平在10min即呈现上升的趋势,5 μmol/L砷剂20 min组和1 μmol/L砷剂20 min组细胞内MKP-1mRNA水平均明显高于对照组(t=5.947,P=0.001;t=2.561,P=0.035),而在30min时,所诱导MKP-1 mRNA水平均达到高峰,其后均呈下降的趋势.而在时间段20 min和1 h,5μmol/L砷剂组要高于1 μmol/L组(t=3.056,P=0.022 3;t=3.501,P=0.012 8).结论:三氧化二砷对MKP-1的基因表达具有上调作用;MKP-1为三氧化二砷作用的早期反应基因之一;砷剂对MKP-1的作用呈时间和剂量相关;小剂量的砷剂可能在哮喘的治疗和预防上具有重要的应用价值.
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PKA-CREB信号通路在大鼠纹状体边缘区及海马空间学习记忆过程中的作用
目的:观察PKA-CREB信号通路在大鼠纹状体边缘区空间学习记忆过程中的作用,以及在学习记忆过程中PKA及CREB之间的可能关系.方法:实验于2003-06/10在解放军第一军医大学神经科学研究所神经生物学实验室进行.取健康雄性Sprague-Dawley大鼠48只,随机分为6组:0 h实验组,1 h实验组,3 h实验组和相应的3个对照组各8只.采用western blotting结合显色带吸光度分析方法观察比较水迷宫定位航行训练后大鼠纹状体和海马胞核内PKAcα及pCREB表达的动态情况.结果:定位航行训练后0 h和1 h大鼠纹状体和海马组织的胞核内PKAcα和pCREB表达均有明显升高(PKAcα分别升高到82.89和86.25以上;pCREB分别升高到88.27和85.75以上),而3 h后均降到正常范围.结论:PKA-CREB信号通路可能参与了大鼠纹状体边缘区及海马的空间学习记忆功能.
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丝裂原活化蛋白激酶在肿瘤坏死因子α诱导滋养层细胞MMP-9基因表达中的作用
目的探讨早孕滋养层细胞有节制地侵入机制,研究肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导滋养层细胞基质金属蛋白酶-9(MMP-9)基因表达的调控机制.方法2004年南方医科大学南方医院将10-4g/L TNF-α分别处理滋养层细胞0、5、10、20、30min后,应用细胞ELISA法测定滋养层细胞中蛋白激酶的活性变化;预先给予丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的特异性抑制剂处理滋养层细胞30min,然后给予10-4g/L TNF-α处理滋养层细胞24h,应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测滋养层细胞MMP-9基因表达的变化.结果发现10-4g/L TNF-α均能迅速激活滋养层细胞的细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、c-jun氨基末端激酶(JNK)、p38 MAPK激酶活性.TNF-α刺激滋养层细胞引起MMP-9 mRNA表达显著增加,其能被ERK或p38 MAPK的特异性抑制剂所抑制.结论ERK和p38 MAPK可能是TNF-α诱导滋养层细胞MMP-9基因表达增加的重要调节物质.
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异丙肾上腺素对家兔心房钠尿肽分泌的影响
[目的]观察β肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素对心房钠尿肽(ANP)分泌的影响,探讨其机制.[方法]采用搏动的心房灌流模型及放射免疫技术观察异丙肾上腺素对ANP分泌、环磷酸腺苷(cAMP)逸出量及心房动力学变化的影响.[结果]异丙肾上腺素可明显抑制ANP的分泌,显著增加心房搏出量及环磷酸腺苷逸出量;蛋白激酶非选择性抑制剂Staurosporine可减缓异丙肾上腺素对ANP分泌的抑制效应.[结论]β肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素抑制ANP分泌作用由cAMP依赖性信号传导途径来实现.
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基质金属蛋白酶-1/13与信号通路激酶ERK1/2 在兔骨关节炎软骨中的表达
目的 利用家兔膝关节前交叉韧带切断(ACLT)及内侧半月板前1/3切除的方法制作骨关节炎(OA)模型,测定关节炎发病的不同时期,关节软骨中基质金属蛋白酶-1(MMP-1),基质金属蛋白酶-13(MMP-13)以及细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)蛋白表达水平的变化情况,探索它们之间的变化规律及关系.方法 实验组家兔30只行ACLT及内侧半月板前1/3切除术造模,分别于术后4 w、8 w、12 w处死10只,假手术对照组家兔10只于术后12w处死.进行股骨髁关节软骨退变的大体评分;取退变的软骨组织,用Western blot印记杂交方法测定软骨组织中MMP-1,MMP-13和ERK1/2的蛋白表达水平.结果 ACLT及内侧半月板前1/3切除术后4 w即可见软骨退变,8 w和12 w时退变进一步加重,对照组无明显软骨退变,不同组动物关节软骨评分差异有统计学意义.MMP-1和ERD1/2的蛋白表达在正常对照组水平均较低,造模4 w开始升高,到第8 w及第12 w持续升高;而MMP-13在造模4 w时表达开始升高,造模第8 w时持续升高,但在造模第12 w时MMP-13的蛋白表达下降.结论 家兔膝关节ACLT及内侧半月板前1/3切除制作OA模型的方法简便可行,MMP-1和MMP-13在骨关节炎的发病过程中有不同程度的升高,可以作为OA研究的评价指标.本实验结果提示,在OA发展的过程中,MMP-1和MMP-13的表达不平行,两者上游信号调控通路可能存在差异.蛋白激酶ERK1/2的表达水平从造模第4 w开始持续升高,说明ERK1/2信号转导通路在骨关节炎发病过程中持续发挥作用.
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紧密连接蛋白claudins磷酸化在胃肠屏障功能中的作用
上皮紧密连接(TJ)是由occludin、claudins、zonula occludens(ZOs)等构成的相邻细胞间连接复合体.TJ形成高选择性通透性屏障,调节溶质、免疫分子和药物的细胞旁转运,并能有效阻止肠内细菌和内毒素易位进入体循环.作为一类跨膜蛋白,claudins对TJ功能的发挥具有重要意义,其磷酸化是维持和调节细胞旁通透性的关键.本文就claudins的分子结构、组织分布、功能、调节claudins磷酸化的因素及其对胃肠屏障功能的影响作一综述.
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白花丹醌对肝纤维化大鼠磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号转导通路的影响
目的 研究白花丹醌对四氯化碳所致肝纤维化大鼠磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B (Akt)信号转导通路的影响.方法 40只雄性SD大鼠分成对照组、模型组、2mg/kg白花丹醌处理组和3mg/kg白花丹醌处理组,每组10只.对照组予0.9％氯化钠溶液2 mL/kg腹腔注射,其余3组均予60％四氯化碳花生油溶液2 mL/kg腹腔注射,均每周3次,共6周.造模后第3周开始,白花丹醌处理组分别给予2 mg/kg和3 mg/kg白花丹醌花生油剂腹腔注射,每周2次,共4周.常规检测大鼠血清ALT、AST、Alb,放射免疫法测定HA和LN,Western印迹检测肝组织中PI3K、Akt和磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)蛋白表达量,免疫组织化学法检测p-Akt表达.各组间均数比较采用单因素方差分析.结果 6周后成功建立肝纤维化大鼠模型.模型组大鼠ALT、AST、HA和LN均高于对照组,2mg/kg白花丹醌处理组和3 mg/kg白花丹醌处理组中的ALT、AST、HA和LN水平较模型组下降,差异均有统计学意义(均P＜0.05).各组PI3K、Akt蛋白表达差异均无统计学意义(均P＞0.05)；p-Akt蛋白表达主要集中在肝细胞核；对照组、模型组、2 mg/kg白花丹醌处理组和3mg/kg白花丹醌处理组大鼠p-Akt蛋白分别为0.0821±0.0003、0.7374±0.0037、0.3679±0.0332和0.1327±0.0561,模型组表达高于对照组(t=851.302,P＜0.05),白花丹醌处理后下降(t值分别=71.858和28.363,均P＜0.05).结论 白花丹醌具有抗肝纤维化作用.白花丹醌可下调肝纤维化过程中p-Akt的表达,这可能是其抗肝纤维化的机制之一.
关键词： 肝硬化 白花丹 醌类 1-磷脂酰肌醇3-激酶 蛋白激酶类 信号传导 大鼠 Sprague-Dawley -
丙型肝炎病毒核心蛋白下调沉默信息调节因子2相关酶1-AMP激活蛋白激酶信号通路活性致肝细胞能量代谢紊乱
目的 探讨沉默信息调节因子2相关酶1 (SIRT1)-AMP激活的蛋白激酶(AMPK)信号通路在HCV核心蛋白所致肝细胞能量代谢紊乱中的作用.方法 pcDNA3.1-core重组质粒转染HepG2细胞,流式细胞仪测定表达HCV核心蛋白的HepG2细胞的活性氧(ROS),液体闪烁计数仪测定ATP/ADP比例和AMPK α2酶活性,比色法测定烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化态与还原态之比(NAD+/NADH),荧光定量检测SIRT1酶活性,RT-PCR和Western印迹检测SIRT1、AMPK α2的表达.计量资料比较采用t检验.结果 Western印迹检测证实,HepG2细胞表达相对分子质量为22 000的HCV核心蛋白.与HepG2细胞相比,表达HCV核心蛋白的HepG2细胞ROS水平升高(1.0±0.1比4.0±0.5,t=14.411,P＜0.01)；ATP/ADP比例无明显变化(8.2±2.2比9.3±2.8,t=0.757,P＞0.05)；AMPK α2酶活性(0.8±0.2比0.2±0,t=7.345,P＜0.01)明显降低；NAD+/NADH比例明显降低(0.08±0.02比0.02±0,t=7.348,P＜0.01)；SIRT1酶活性[(0.30±0.05) pmol·μg 1·min-1比(0.15±0.04) pmol·μtg-1·min-1,t=5.738,P＜0.01)]明显降低；SIRT1 mRNA(0.8±0.2比0.4±0.1,t=4.382,P＜0.01)和AMPK α2 mRNA(0.9±0.3比0.2±0,t=5.715,P＜0.01)表达明显降低；SIRT1蛋白(0.8±0.2比0.3±0,t=5.941,P＜0.01)和磷酸化AMPK蛋白(0.5±0.1比0.1±0,t=9.608,P＜0.01)水平明显降低.结论 HCV核心蛋白能下调SIRT1-AMPK信号通路活性,导致肝细胞能量代谢紊乱.
关键词： 肝炎病毒属 病毒核心蛋白质类 能量代谢 沉默信息调节因子2相关酶1 蛋白激酶类 -
丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白激酶R的功能区域研究
目的构建并表达丙型肝炎病毒(HCV)不同病毒株:癌中心株(BT)、癌旁珠(BNT)、HCV-J及BT不同截短片段谷胱甘肽(GST)-核心融合蛋白;寻找核心蛋白(Core)与蛋白激酶R(PKR)相互作用区域,探讨它们在HCV持续感染及细胞癌(HCC)发病机制中的作用.方法用聚合酶链反应扩增不同片段HCV核心蛋白基因,并将7个不同的基因片段分别克隆到原核表达载体pGEX-4T-1,诱导表达并纯化表达蛋白,与两株细胞(HepG2和Huh-7)的PKR的进行相互作用试验.结果7个不同片段Core在体外都得到相应表达,不同片段结合PKR的能力存在一定差异.BT、BNT、C191的Core N端1～172氨基酸(aa)3个片段均能与PKP发生直接结合,BT与PKR结合的区域在Core N端的1～58aa.结论 不同片段Core在原核细胞中获得较好的表达;Core/PKP相互作,在HCV持续感染和HCC的发病机制中可能起重要作用.
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幽门螺杆菌对胃黏膜细胞DNA依赖蛋白激酶催化亚单位和Ku70/Ku80二聚体蛋白体内外表达的影响
目的 探讨H.pylori对胃黏膜细胞DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(DNA-PKcs)和Ku70/Ku80二聚体在体内外表达的影响.方法 应用Western印迹法检测H.pylori作用后1、3、6、12和24 h的胃黏膜上皮细胞(GES-1)和胃腺癌细胞(AGS)中DNA-PKcs和Ku70/Ku80二聚体的蛋白表达情况.采用H.pylori灌胃蒙古沙鼠,于感染第6和12个月处死动物,取胃黏膜组织行免疫组织化学染色,检测DNA-PKcs和Ku70/Ku80二聚体的蛋白表达情况.采用t检验和卡方检验进行统计学分析.结果 H.pylori作用后1h,DNA-PKcs蛋白在GES-1中的相对表达量为1.16±0.09,高于未感染H.pylori组的1.04±0.31,差异有统计学意义(t=4.67,P＜0.05).H.pylori作用后1、3、6、12和24 h,Ku70/Ku80二聚体蛋白在GES-1中的相对表达量分别为1.58±0.32、1.84±0.40、1.97±0.35、3.72±1.42和3.74±1.56,均高于未感染H.pylori组的1.24±0.31,差异均有统计学意义(t=3.57、4.20、5.03、8.11、8.14,P均＜0.05)；Ku70/Ku80二聚体蛋白在AGS中的相对表达量分别为4.69±0.87、3.67±0.67、2.41±0.24、1.35±0.35和1.32±0.10,均低于未感染H.pylori组的4.84±0.76,差异均有统计学意义(t=34.13、27.68、19.81、4.47、5.69,P均＜0.05).蒙古沙鼠模型中,DNA PKcs蛋白在未感染H.pylori组不表达(0/25),在感染H.pylori组中的总阳性率为98.1％(53/54),两组差异有统计学意义(x2=74.55,P＜0.01)；Ku70/Ku80二聚体蛋白在未感染H.pylori组中的总阳性率为92.0％(23/25),在感染H.pylori组中的总阳性率为68.5％(37/54),两组差异有统计学意义(x2=5.16,P＜0.05).结论 H.pylori感染在体内外能通过改变胃黏膜DNA PKcs和Ku70/Ku80二聚体蛋白的表达水平,影响细胞DNA损伤修复,导致胃黏膜病变.
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磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路对CD40介导胃癌细胞侵袭与转移的研究
目的 探讨可溶性CD40配体(sCD40L)联合磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(P13K/Akt)信号通路特异性阻断剂LY294002对胃癌AGS细胞体外增殖及侵袭、转移的影响;初步探讨其可能的作用机制.方法 将细胞分成对照组(仅加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液)、LY294002组(20μmol/L)、sCD40L组(2μg/ml)和LY294002+sCD40L组.四甲基偶氮唑盐法检测不同浓度sCD401,及联合LY294002对细胞增殖的影响;Transwell实验和划痕实验分析细胞侵袭、转移能力的改变;Western印迹检测细胞P13K、p-Akt、血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达的变化.结果 LY294002作用后细胞生存率为65.7%,sCD40L作用后为70.1%,LY294002+sCD40L组生存率为41.3 0A,差异有统计学意义(P<0.05).LY294002+sCD40L组细胞的划痕愈合速度较sCD40L和LY294002组明显减慢.LY294002+sCD40L组平均每个视野的细胞数较sCD40L和LY294002组明显减少.与对照组相比,sCD40L使P13K、p-Akt、VEGF蛋白表达升高,与LY294002联合作用后,P13K,p-Akt、VEGF蛋白表达明显降低.结论 阻断P13K/Akt信号途径可显著增强sCD40L对人胃癌AGS细胞增殖及侵袭、转移的抑制作用,为胃癌的生物治疗提供一种新的方法.
关键词： 1-磷脂酰肌醇3-激酶 蛋白激酶类 胃癌 肝瘤治疗方案 -
应用抑制消减杂交和cDNA表达谱芯片筛选肝星形细胞持续活化的相关基因
目的:利用抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)和cDNA表达谱芯片筛选早期活化的肝星状细胞与大鼠正常肝脏组织、轻度肝纤维化组织、重度肝纤维化组织中差异表达的基因.方法:从SSH构建的大鼠轻度和重度肝纤维化中两个差异cDNA文库中挑选1 000条上调显著的基因,与正常大鼠4 136条基因克隆制作成一张芯片,筛选持续期活化的肝星状细胞相关基因.结果:获得与HSC持续活化相关的上调基因633条,下调基因715条,其中血清和糖皮质激素调节蛋白激酶(SGK)在正常大鼠基因克隆和2、8周SSH上调差异基因中均呈上调信号.结论:联合应用SSH和cDNA表达谱芯片是筛选和鉴定不同样本中差异表达基因的快速、经济和有效方法;SGK可能作为多种细胞信号传导通路和细胞磷酸化级联反应的一个功能性交汇点,参与了肝星状细胞的早期活化和信号传导.
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MAPK与乳腺癌细胞凋亡关系研究进展
促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是一类细胞内丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶.目前已发现存在着多条并行的MAPK信号转导通路,不同的细胞外刺激可以激活不同的MAPK信号通路,许多生长因子、细胞因子、G蛋白偶联受体、应激信号及有丝分裂原等均可激活MAPK信号转导通路.MAPK信号转导通路在细胞的增殖、分化和凋亡中起着关键作用,本综述主要论述如何通过MAPK信号转导系统诱导乳腺癌细胞凋亡.
