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口腔黏膜扁平苔藓差异基因筛选及其通路分析
目的 应用基因芯片技术筛选口腔扁平苔藓(OLP)差异表达基因及其相关通路分析.方法 分别从15 例患者OLP 组织和5 例健康者口腔黏膜组织中提取总RNA,随后用反转录的方法将两种组织的mRNA 分别进行荧光标记,与含有32 050 个基因的人类基因芯片进行杂交.探针长度为60 mer,杂交信号用Genepix 4000B 扫描仪扫描,用芯片图像分析软件(Genepix Pro V6.0 和Genesring)进行分析.结果 经过杂交筛选并与正常组织比较,从32 050 个基因中筛选出有统计学意义的差异表达基因142 个,其中上调表达基因25 个,下调表达基因117 个.有差异表达的通路8 个.与OLP 密切相关的通路有参与感染类疾病的幽门螺杆菌感染的上皮细胞信号传导通路(epithelial cell signaling in Helicobacter pylori infection)等.结论 应用基因表达谱芯片可初步筛选出OLP 差异表达基因和通路,OLP 发生、发展过程中存在着多个不同基因及多条功能通路表达调控的改变.
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Ras/Raf/MAPK信号通路与先天性心脏病发生学的研究进展
Ras/Raf/MAPK信号通路参与调控一系列重要的细胞活动,在细胞生长、发育、增殖、分化以及细胞间功能同步及细胞恶性转化等多种生理、病理过程中起重要作用.该通路成员的体细胞突变将会引起肿瘤的发生;生殖细胞突变将会影响胚胎发育过程,从而引起一系列先天性心脏病的发生,例如努南综合征等.
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机械负荷调节猪腰椎间盘细胞表达α5β1整合素的体外研究
目的研究α5β1整合素在体外培养的猪腰椎间盘细胞中的表达和机械负荷对其的影响.方法取10只年龄5～6周、体重25～30kg的猪,处死后12 h内,无菌条件下切取完整的腰椎,剔除腰椎周围的韧带和软组织,尤其是椎间盘周围的韧带.从腹侧一次性切开椎间盘取出髓核(nucleus pulpous,NP),仔细分离纤维环(anulus fibrous,AF),将两者立即置于Hanks平衡盐溶液中,制成细胞悬液.分别对腰椎间盘的AF和NP细胞施加1 Mpa、1 Hz,3 h/d,共3 d的周期性液压,通过对细胞的形态学观察、Western免疫印迹和免疫组织化学染色,检测α5β1整合素在正常腰椎间盘AF细胞和NP细胞中的表达及周期性压力对其的影响.结果经周期性液压后,NP细胞的存活率大于90%,AF细胞的存活率大于85%,加压后的AF细胞和NP细胞均可见体积缩小.α5β1整合素在正常腰椎间盘AF细胞和NP细胞中的表达呈强阳性.Western免疫印迹结果显示:加压后α5β1整合素在AF细胞中的表达均明显减少,P值分别为0.000、0.003,与对照组比较差异有统计学意义;α5β1整合素在NP细胞中的表达也明显减少,P值分别为0.001、0.015,与对照组比较差异有统计学意义.结论机械负荷可引起腰椎间盘细胞中α5β1整合素的变化,提示α5β1整合素在腰椎间盘细胞中可能发挥力学传感器的作用.
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甘草总黄酮对阿司匹林损伤人胃黏膜上皮细胞的保护作用及机制研究
目的 探讨甘草总黄酮对阿司匹林损伤人胃黏膜上皮细胞(GES-1)的保护作用及可能机制.方法2017年3—11月,选取GES-1细胞株,分为6组,对照组:加DMEM培养基;阿司匹林组:阿司匹林18.5 mmol/L与GES-1共同培养24 h;甘草总黄酮低组、甘草总黄酮中组、甘草总黄酮高组:GES-1分别以甘草总黄酮(3、6、12 mg/L)预处理2 h后再加阿司匹林18.5 mmol/L共同培养24 h;PD98059组:GES-1以甘草总黄酮12 mg/L预处理2 h后,加PD98059 10 μmol/L处理1 h,再加阿司匹林18.5 mmol/L共同培养24 h.采用MTT法检测细胞增殖抑制率,采用流式细胞术检测细胞凋亡率,检测乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量,采用Western blotting法检测细胞磷酸化细胞外调节蛋白激酶(p-ERK1/2)、B淋巴细胞癌2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达.结果 与对照组比较,阿司匹林组、甘草总黄酮低组、甘草总黄酮中组、甘草总黄酮高组、PD98059组细胞增殖抑制率、细胞凋亡率、LDH活性、MDA含量、p-ERK1/2、Bax表达升高,SOD活性、Bcl-2表达降低(P<0.05);与阿司匹林组比较,甘草总黄酮中组、甘草总黄酮高组、PD98059组细胞增殖抑制率、细胞凋亡率、LDH活性、MDA含量、p-ERK1/2、Bax表达降低,SOD活性、Bcl-2表达升高(P<0.05);与甘草总黄酮低组、甘草总黄酮中组、甘草总黄酮高组比较,PD98059组细胞增殖抑制率、细胞凋亡率、LDH活性、MDA含量、p-ERK1/2、Bax表达降低, SOD活性、Bcl-2表达升高(P<0.05).结论 甘草总黄酮可通过促增殖、抗凋亡、抗氧化应激等途径减轻阿司匹林诱导的GES-1损伤,其机制可能与抑制ERK1/2信号通路有关.
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基质金属蛋白酶-1/13与信号通路激酶ERK1/2 在兔骨关节炎软骨中的表达
目的 利用家兔膝关节前交叉韧带切断(ACLT)及内侧半月板前1/3切除的方法制作骨关节炎(OA)模型,测定关节炎发病的不同时期,关节软骨中基质金属蛋白酶-1(MMP-1),基质金属蛋白酶-13(MMP-13)以及细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)蛋白表达水平的变化情况,探索它们之间的变化规律及关系.方法 实验组家兔30只行ACLT及内侧半月板前1/3切除术造模,分别于术后4 w、8 w、12 w处死10只,假手术对照组家兔10只于术后12w处死.进行股骨髁关节软骨退变的大体评分;取退变的软骨组织,用Western blot印记杂交方法测定软骨组织中MMP-1,MMP-13和ERK1/2的蛋白表达水平.结果 ACLT及内侧半月板前1/3切除术后4 w即可见软骨退变,8 w和12 w时退变进一步加重,对照组无明显软骨退变,不同组动物关节软骨评分差异有统计学意义.MMP-1和ERD1/2的蛋白表达在正常对照组水平均较低,造模4 w开始升高,到第8 w及第12 w持续升高;而MMP-13在造模4 w时表达开始升高,造模第8 w时持续升高,但在造模第12 w时MMP-13的蛋白表达下降.结论 家兔膝关节ACLT及内侧半月板前1/3切除制作OA模型的方法简便可行,MMP-1和MMP-13在骨关节炎的发病过程中有不同程度的升高,可以作为OA研究的评价指标.本实验结果提示,在OA发展的过程中,MMP-1和MMP-13的表达不平行,两者上游信号调控通路可能存在差异.蛋白激酶ERK1/2的表达水平从造模第4 w开始持续升高,说明ERK1/2信号转导通路在骨关节炎发病过程中持续发挥作用.
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肝纤维化模型中Nogo-B参与转化生长因子-β1/Smad2信号通路的研究
目的 探讨在小鼠肝纤维化模型中Nogo-B与转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smad2信号通路的关系.方法 将24只健康雄性ICR小鼠分为正常对照组6只和肝纤维化模型组18只,模型组再按造模后不同时间点分为4、8和12周3个亚组.肝纤维化模型组皮下注射四氯化碳(CCl4)诱导小鼠肝纤维化模型,肝组织经HE和Masson染色后,光学显微镜下观察各组肝组织病理变化；RT-PCR方法检测各组肝脏Nogo-B、Smad2和TGF-β1 mRNA表达；Western印迹法、免疫组织化学法检测各组肝脏Nogo-B、Smad2、TGF-β1蛋白表达.组间均数比较采用单因素方差分析.结果 CCl4成功诱导肝纤维化模型.Nogo-B两种亚型Nogo-B1、Nogo-B2 mRNA在正常肝组织表达为0.140±0.050和0.104±0.023,在肝纤维化模型组肝脏中表达显著增加,造模12周时为1.054±0.040和0.500±0.057(F=431.41、135.46,均P＜0.01)；Nogo-B蛋白主要表达于肝脏间质中,肝细胞仅少量表达；且Nogo-B mRNA及蛋白的表达强度与参与肝纤维化信号通路相关因子Smad2、TGF-β1 mRNA及蛋白均呈正相关(均P＜0.01).结论 Nogo-B可能通过参与TGF-β1/Smad2信号通路在肝纤维化发展过程中起重要作用,促进肝纤维化的发展.
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初级纤毛细胞外氧感受器功能和机制研究
目的:探索初级纤毛是否为PC12细胞的细胞外氧感受器.方法:通过小干扰RNA(siRNA)干扰细胞纤毛内转运蛋白88的表达抑制体外培养PC12细胞初级纤毛的发生;免疫荧光染色法观察缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、核因子E2相关因子2(Nrf2)核转位和PC12细胞初级纤毛生长情况;实时定量RT-PCR法检测HIF-1α、Nrf2、血管内皮生长因子(VEGF)和超氧化物歧化酶(SOD)基因表达.结果:siRNA干扰组细胞的初级纤毛被抑制.与常氧对照组比较,缺氧对照组和阴性对照组细胞的HIF-1α和Nrf2发生了明显的核转位,细胞内HIF-1α、Nrf2、VEGF基因表达量增加,SOD表达量下降;siRNA干扰组细胞在缺氧状态下HIF-1α和Nrf2未发生核转位,细胞内HIF-1α、Nrf2、VEGF 基因表达受到抑制,而SOD 表达量升高.结论:PC12细胞的初级纤毛可能具有细胞外氧感受器的作用,可以感知细胞外环境中的缺氧和氧化应激状态,并通过一定途径将缺氧信号传导至细胞内,进而启动细胞抗缺氧机制.
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慢性乙型肝炎患者外周血细胞因子信号转导抑制因子-1、3表达与干扰素α疗效的关系
目的 观察慢性乙型肝炎(慢乙肝)患者外周血单个核细胞细胞因子信号传导抑制因子(SOCS)-1、3在干扰素α治疗前、后的表达变化,及其与血清HBV水平相关性.方法 选择50例HBeAg阳性慢乙肝患者予以普通干扰素α治疗,根据治疗24周时的生化学、病毒学应答进行分组.对治疗前及治疗后24周的50例慢乙肝患者采用实时荧光定量PCR检测外周血单个核细胞SOCS-1、3的mRNA水平；并同时检测血清HBV DNA水平和丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平.结果 治疗24周,ALT复常组SOCS-1表达较治疗前升高[(0.718±0.031)、(0.258 ±0.014)] (P ＜0.05),SOCS-3表达较治疗前下降[(0.658±0.032)、(0.707±0.088)](P＜0.05),而ALT未复常组SOCS-1、3水平差异无统计学意义(P＞0.05)；病毒学应答组SOCS-1较治疗前升高[(0.661 ±0.018)、(0.258±0.014)] (P＜0.05),SOCS-3表达较治疗前下降[(0.644±0.023)、(0.715±0.048)](P＜0.05),而病毒学未应答组的SOCS-1、3表达水平差异无统计学意义(P＜0.05).结论 干扰素治疗后单个核细胞SOCS-1 mRNA表达上调,SOCS-3 mRNA下调,可能参与了干扰素抗乙肝病毒过程.
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生理浓度丁酸钠对Caco-2细胞肠屏障作用中JNK通路的效应
目的 观察生理浓度丁酸钠作用Caco-2细胞肠屏障时JNK细胞信号通路的作用及与AMPK通路的关系.方法 建立Caco-2细胞单层肠屏障模型,分成不加药物的对照组(Con组)、仅添加2 mmol/L丁酸钠的生理浓度丁酸钠组(2BA组)、仅加入JNK特异性抑制剂的20μmol/LSP600125组(SP组)、20 μmol/L SP600125+生理浓度丁酸钠组(Mix组).检测各组处理后24、48、72 h跨上皮细胞电阻(TER)、CCK-8法吸光度及72 h菊粉-FITC透过率、流式细胞仪检测细胞凋亡水平、吖啶橙(AO)/碘化丙啶(PI)双染法荧光显微镜检测凋亡率、Western blot法检测JNK、AMPK、ACC等蛋白的表达.结果 2BA组TER在药物作用后24、48、72 h均明显高于Con组,以72 h时显著,此时2BA组为(509.64±12.62)Ω·cm2,而Con组为(459.30±7.62)Ω·cm2 (P＜0.05);Mix组TER为(261.01±9.22)Ω·cm2较2BA组(509.64±12.62)Ω·cm2低.Mix组72 h CCK-8吸光度为0.47±0.13、72 h菊粉-FITC为(7.89±0.80)cm/h、流式细胞仪凋亡水平为(61.23±1.54)％及AO/PI双染荧光显微镜凋亡结果为9.7±1.3,均比2BA组的0.98±0.08、(4.05±1.38)cm/h、(15.90±5.95)％、5.5±1.3高(P＜0.05).2BA组p-AMPK、p-ACC水平较Con组和Mix组上调(P＜0.05).Mix组p-JNK水平与2BA组相比显著下调(P＜().01).结论 生理浓度丁酸钠可增强肠屏障功能,而JNK特异性抑制剂可破坏这一作用,提示JNK在生理浓度丁酸钠增强肠屏障功能起协同作用,这一作用可能与AMPK活化有关.
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脂肪因子Chemerin体外表达与妊娠期糖尿病胰岛素抵抗研究
目的 探讨脂肪因子Chemerin与妊娠期糖尿病(GDM)胰岛素抵抗(IR)的内在联系.方法 复苏、传代及诱导分化GDM前脂肪细胞,构建Chemerin过表达载体,进行载体转化、培养和提取;以3个过表达梯度(1.0μg、2.5 μg、5.0 μg)转染传代脂肪细胞,以无转染组为对照;Q-PCR检测Chemerin、胰岛素受体底物-1 (IRS-1)、IRS-2磷脂酰肌醇-3激酶[PI3K(P85a)]mRNA表达,Western blot检测Chemerin、IRS-1、IRS-2、PI3K蛋白表达及IRS-1、IRS-2酪氨酸磷酸化水平,[3H]-2-脱氧-D-葡萄糖摄取测定法检测不同浓度转染组细胞葡萄糖摄取率的变化.结果 (1)Chemerin mRNA及蛋白表达随转染浓度梯度升高而表达量增加,所构建Chemerin过表达载体有效;(2)随Chemerin表达增加,IRS-1/2、PI3K mRNA及蛋白表达未出现明显变化,但存在IRS-1磷酸化程度稍有增加,IRS-2磷酸化程度变化不明显;(3)脂肪细胞葡萄糖摄取率与Chemerin过表达浓度变化无明显关系.结论 Chemerin在GDM血清及网膜脂肪组织中的高表达与GDM胰岛素抵抗的发生无必然联系.
