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兔外周血间充质干细胞的体外分离培养及诱导成骨
背景:研究证明外周血中存在间充质干细胞,但含量极少.目的:拟从兔外周血中提取间充质干细胞,并诱导其向成骨细胞分化.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-06/12在山东省立医院中心实验室完成.材料:新两兰大白兔6只,购自山东省农科院.α-MEM培养基、L-DMEM培养基为Hyclone公司产品.方法:每隔2 d从兔背部不同部位切去3 cm×3 cm的全层皮肤(保留背部肌层),所切皮肤做原何移植后包扎,每只兔连续创伤4次.分别于创伤前及末次创伤1周后从股静脉取外周血,采用密度梯度离心法获取间充质干细胞,设立2组,分别加入含体积分数为10%胎生血清的α-MEM培养基或L-DMEM培养基.细胞传至第2代以1×105cm2密度接种于12孔板,加入含成骨诱导剂的H-DMEM培养液进行成骨诱导.主要观察指标:创伤前后细胞形态观察,成纤维样细胞集落形成率,成骨诱导效果.结果:创伤前所获得的细胞首次换液后,未见有梭形细胞贴壁;创伤后所获得的细胞接种24 h即可见有短梭形及多角形细胞贴壁,五六天后出现细胞集落.与L-DMEM培养基组比较,α-MEM培养基组外周血成纤维样细胞集落形成率明显升高(P<0.05).外周血间充质干细胞成骨诱导后,呈梭形、三角形或多角形,有突起,可见两三个核仁和细胞分裂相,增殖速度缓慢,诱导7 d后碱性磷酸酶阳性率达80%以上,诱导21 d后茜素红染色形成钙结节.结论:皮肤损伤刺激后可成功从兔外周血中获取间充质干细胞,且具备成骨分化特性,α-MEM培养基较L-DMEM培养基更适合外周血间充质干细胞的体外生长.
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维甲酸诱导小型猪牙周膜干细胞的体外成骨
背景:近期研究发现维甲酸对胚胎干细胞及多种成体干细胞具有成骨方向诱导的作用.目的:观察维甲酸对小型猪牙周膜干细胞体外成骨作用的影响.方法:采用组织块法获得小型猪牙周膜细胞,有限稀释法纯化小型猪牙周膜干细胞,免疫荧光法检测STRO-1、免疫细胞化学法检测波形蛋白、角蛋白鉴定小型猪牙周膜干细胞.CCK8法测定小型猪牙周膜干细胞增殖曲线,检测小型猪PDLSC克隆形成率.使用维甲酸对第3代小型猪牙周膜干细胞进行成骨诱导,茜素红染色检测矿化结节,免疫细胞化学方法检测成骨相关基因骨桥蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达.结果与结论:有限稀释法分离纯化小型猪牙周膜干细胞STRO-1,波形蛋白阳性表达,角蛋白阴性表达,克隆形成率为2.8%,维甲酸诱导14 d后,碱性磷酸酶染色阳性,诱导21 d后茜素红染色阳性,免疫细胞化学法检测骨桥蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原阳性表达,Ⅲ型胶原阴性表达.结果表明小型猪牙周膜干细胞能够被维甲酸诱导向成骨样细胞分化.
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豚鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及成骨诱导
背景:利用骨髓间充质干细胞的取材灵活性及快捷性,对已掌握的培养技术及成骨诱导进一步探索性研究.目的:通过建立豚鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养法,探讨豚鼠骨髓间充质干细胞表型特征以及多项分化潜能.方法:利用贴壁培养法分离纯化豚鼠骨髓间充质干细胞,传代扩增,流式细胞分析检测细胞表面分子CD29、CD44、CD45的表达.分别采用成骨诱导培养液和成脂诱导培养液定向诱导骨髓间充质干细胞向脂肪细胞、成骨细胞分化.结果与结论:原代分离的骨髓间充质干细胞在接种后96 h贴壁,细胞形态为椭圆形,多角形及短梭形,8 d时细胞呈长梭形并达到90%单层融合.经传代扩增,细胞进一步纯化,细胞形态为均一的长梭形并呈漩涡状排列,而且生长速率加快.流式细胞检测 CD29、CD44阳性率分别为95.7%和65.7%.不同诱导剂定向诱导后,经油红O、茜素红S、碱性磷酸酶染色、免疫组织化学Ι型胶原酶鉴定,P3代骨髓间充质干细胞分别向脂肪细胞及成骨细胞分化.结果表明,通过贴壁筛选方法,体外分离培养的豚鼠骨髓间充质干细胞具有很强的增殖能力,并保持稳定的表型特征及多向分化潜能.
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聚乳酸/羟基磷灰石膜与人羊膜基质细胞联合构建骨组织工程细胞/支架复合体
背景 前期研究通过静电纺丝技术获得的聚乳酸/羟基磷灰石膜有利于细胞的贴附和生长.目的 分析电纺聚乳酸/羟基磷灰石膜和人羊膜基质细胞构建骨组织工程细胞/支架复合体的可行性.方法 利用MTT 法检测聚乳酸和聚乳酸/羟基磷灰石膜浸提液对人羊膜基质细胞增殖的影响;将第3 代人羊膜基质细胞培养于含聚乳酸和聚乳酸/羟基磷灰石膜的成骨诱导培养液中,进行组织学检查及免疫荧光细胞化学染色检测.结果 与结论 聚乳酸和聚乳酸/羟基磷灰石膜浸提液对人羊膜基质细胞均无明显细胞毒性.与两种膜材料复合培养后,人羊膜基质细胞细胞增殖明显,可观察到钙化结节的形成,钙化结节处细胞Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶表达阳性,且聚乳酸/羟基磷灰石膜组细胞钙化结节数量及成熟程度优于聚乳酸组.说明电纺聚乳酸/羟基磷灰石膜与人羊膜基质细胞可以共同构建成细胞/支架复合体,具有应用于骨组织工程的潜力.
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犬骨髓间充质干细胞分离纯化和成骨诱导分化:Ficoll液密度梯度离心法体外分离的可行性
背景:目前骨髓间充质干细胞较经典的分离方法是Percoll密度梯度离心法,以去除血细胞成分,但该法操作较为复杂,分离犬骨髓时需要配制密度,且离心次数较多,对细胞损伤大.目的:拟建立可靠、高纯度的犬骨髓间充质干细胞体外分离纯化方法,并观察其在体外扩增、成骨诱导分化的能力.方法:于犬髂后上棘抽取骨髓液10 mL,肝素抗凝,Hanks液稀释后,加入1.077 g/mL Ficoll液3 mL,2 000 r/min离心20 min,吸取有核细胞形成白色云雾状的分层界面,用含胎牛血清的DMEM离心2遍,按12×10~4/cm~2密度接种,于37 ℃、体积分数为5%的CO_2培养箱内培养.细胞传代后,加入含地塞米松、β-磷酸甘油钠、L-2-磷酸抗坏血酸的DMEM成骨条件培养液进行诱导.免疫细胞化学染色和免疫荧光染色检测成骨细胞特征性分泌蛋白骨钙素、骨桥蛋白的表达,以及Ⅰ型胶原的表达,并进行碱性磷酸酶染色与茜素红染色.结果与结论:1.077 g/mL Ficoll液密度梯度离心法分离所得的有核细胞层相对于Percoll液分层明显,可获得纯度较高的骨髓间充质干细胞,接种细胞生长良好,平均倍增时间为24 h.犬骨髓间充质干细胞体外成骨诱导培养后,骨钙素、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原均呈阳性表达,碱性磷酸酶染色后细胞胞浆呈蓝绿色,茜素红染色后细胞外基质中出现散在的红色结节,可在体外定向分化为成骨细胞.
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成骨诱导脂肪基质细胞在骨组织工程体内成骨中的作用
背景:以往研究认为,经过成骨诱导后的脂肪基质细胞通过转化为成骨细胞分泌骨基质进而修复骨缺损,然而并没有明确结论证实.目的:将经过体外成骨诱导的脂肪基质细胞复合支架材料分别植入骨缺损区和非骨区,根据是否成骨,验证经过成骨诱导后的脂肪基质细胞是否转化为成骨细胞.方法:取12 月龄犬背部皮下脂肪,经胶原酶消化法获得单个核细胞,将培养的第3 代细胞与双相磷酸钙陶瓷形成复合物.在犬下颌骨两侧制备长20 mm、高10 mm 的箱状缺损,拔除术区牙齿,将细胞支架复合物植入一侧术区,空白侧留作对照;另外在犬背部皮下肌肉区植入细胞支架复合物及骨诱导性磷酸钙陶瓷材料,术后6 周及12 周经组织学检测骨缺损修复情况.结果与结论:脂肪基质细胞复合双相磷酸钙陶瓷在骨缺损区成骨,在肌肉区未形成新骨;骨诱导性磷酸钙陶瓷在肌肉区形成新骨.提示成骨诱导并不能将脂肪基质细胞转化为成骨细胞,其确切机制有待进一步研究.
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骨髓间充质干细胞复合可注射型geneX及转化生长因子β2的成骨诱导效应
背景：单一支架材料在不同程度不同范围内存在一些缺点，因此近年来研究者选择复合支架材料，将两种或多种具有一定互补特性的生物材料按一定方式与比例复合，构造出新型复合材料。
目的：探讨可注射型geneX人工骨复合骨髓间充质干细胞/转化生长因子β2的组织相容性及体外成骨诱导分化效果。
方法：将可注射型geneX人工骨与兔骨髓间充质干细胞复合培养5 d，电镜观察人工骨的组织相容性。取第3代成骨诱导培养的兔骨髓间充质干细胞分3组培养，单纯细胞组仅加入成骨诱导分化培养基，细胞支架组加入geneX人工骨与成骨诱导分化培养基，联合组加入geneX人工骨、转化生长因子β2与成骨诱导分化培养基，培养7，14，21 d进行细胞形态学观察、碱性磷酸酶活性检测、MTT检测、甲基百里香酚蓝检测及茜素红染色观察。
结果与结论：骨髓间充质干细胞在可注射型geneX人工骨表面贴壁生长，呈成纤维细胞形态，细胞基质分泌旺盛。联合组细胞增殖、成骨诱导活性强于单纯细胞组、细胞支架组(P<0.05)，细胞碱性磷酸酶活性高于单纯细胞组、细胞支架组。表明可注射型geneX人工骨复合骨髓间充质干细胞/转化生长因子β2具有良好组织相容性及促成骨分化能力。 -
血管内皮祖细胞/骨髓间充质干细胞复合细胞膜片的构建
背景：研究发现充足的血供是骨组织修复与再生必不可少的条件。
目的：应用血管内皮祖细胞与骨髓间充质干细胞构建出复合细胞膜片。
方法：体外分离培养SD大鼠血管内皮祖细胞及骨髓间充质干细胞，将两种细胞直接共培养，经成膜诱导10 d后构建出复合细胞膜片并对获得的膜片进行大体、倒置显微镜及苏木精-伊红染色观察。将血管内皮祖细胞及骨髓间充质干细胞分别应用荧光标记液标记后，观察膜片诱导过程中两种细胞的分布及交流情况。对复合细胞膜片进行碱性磷酸酶活性检测及茜素红染色，观察其成骨分化能力。
结果与结论：血管内皮祖细胞与骨髓间充质干细胞直接共培养成膜诱导10 d后可成功获得复合细胞膜片，两种细胞在成膜诱导过程中存在细胞间接触。获得的膜片由多层细胞及细胞外基质构成，经碱性磷酸酶活性检测及茜素红染色结果证实该膜片具有较强的成骨分化能力，为进一步将血管内皮祖细胞/骨髓间充质干细胞复合细胞膜片应用于骨缺损的修复提供了条件。 -
骨髓间充质干细胞诱导成骨细胞模型中活化转录因子4基因的表达
背景：研究发现活化转录因子4为近调控成骨细胞分化和功能的活化因子，在成骨细胞分化过程中起着至关重要的作用。
目的：探索SD大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导过程中活化转录因子4基因的表达变化及其意义。
方法：以全骨髓贴壁法培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，传代至第3代细胞时加入成骨诱导剂，在诱导的第0，1，4，7，10，13，16，19天分别采用PT-PCR，Western blot动态监测活化转录因子4基因及蛋白的表达变化，以未进行成骨诱导细胞做对照。
结果与结论：RT-PCR结果显示，活化转录因子4 mRNA的表达随着细胞成骨分化程度加剧而升高，16 d达到峰值。Western blot分析结果显示，活化转录因子4蛋白表达量随着骨髓间充质干细胞骨化程度加剧，表达水平亦呈上升趋势，于16 d达到高峰，19 d维持在高水平状态。实验组各时间点活化转录因子4 mRNA和活化转录因子4蛋白表达与对照组相比差异有均有显著性意义(P<0.05)。结果表明诱导成骨细胞中活化转录因子4表达增强，提示活化转录因子4的增强与骨髓间充质干细胞成骨分化能力呈正相关。 -
全骨髓法培养C57小鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性
背景：饲养层细胞多数利用丝裂霉素C来处理，虽丝裂霉素C抑制了细胞增殖，但是细胞仍处于有分泌功能的活性状态，能够分泌不同的细胞因子。而骨髓中的非间充质骨髓细胞和血浆中的各种分泌因子，保持间充质细胞生长的微环境，提高间充质干细胞的产量。
目的：探究全骨髓培养法分离培养的小鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性。
方法：采用全骨髓贴壁法纯化扩增C57小鼠的骨髓间充质干细胞，检测细胞增殖的动力学变化、细胞表面的免疫标志物、多向分化的潜能及细胞周期的变化。
结果与结论：全骨髓培养法获得的小鼠骨髓间充质干细胞具有黏附于塑料培养器皿的能力，流式细胞仪检测表达CD45，CD105和Sca-1，不表达CD34，CD133和C-kit等间充质干细胞的表面标记特征；细胞倍增时间(57.11±1.5) h；诱导后具有向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化的能力；细胞周期分析表明64%的细胞处于G 0-G 1期。提示全骨髓培养法获取的C57小鼠骨髓间充质细胞具有间充质干细胞的生物学特征。 -
左、右归丸对大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导中转化生长因子β1及Smad2/3的影响
背景：滋补肾阴左归丸、温补肾阳右归丸均可协同诱导剂诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，但其机制尚有待探讨。
目的：观察左、右归丸含药血清对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中转化生长因子β1及其信号转导蛋白Smad2/3表达的影响。
方法：运用全骨髓贴壁法分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞；分别以空白血清对照组，左归丸、右归丸、阳性对照药补佳乐制备的大鼠含药血清加诱导剂(地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠)，以及诱导剂组为对照共5组对骨髓间充质干细胞进行干预。采用Western blot法检测Ⅰ型胶原蛋白表达，用免疫组化法检测转化生长因子和Smad2/3在细胞内的表达。
结果与结论：左归丸、右归丸含药血清诱导骨髓间充质干细胞成骨后Ⅰ型胶原蛋白、转化生长因子β1、Smad2/3蛋白表达高于空白组、诱导剂组，差异有显著性意义(P <0.05)，且左归丸优于右归丸(P <0.05)。提示左、右归丸含药血清能通过转化生长因子β1调节Smad2/3信号通路促进骨髓间充质干细胞成骨分化，且左归丸组效果更好，表明中医“滋肾阴”法更能有效的促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。 -
全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性及优势
背景：骨髓来源的间充质干细胞含量极低，体外纯化、扩增活性好、分化潜能高的骨髓间充质干细胞，对进一步研究至关重要。
目的：进一步验证全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化骨髓间充质干细胞的生物学特性、表型及多向分化潜能。
方法：通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞，进行形态学观察，流式细胞仪检测细胞标记物表达，分别进行成骨、成脂诱导分化。
结果与结论：成功纯化、扩增了高细胞活性、高分化潜能的骨髓间充质干细胞。所得细胞呈成纤维细胞样；表达CD29、CD90，不表达CD45；成骨、成脂诱导分化后，茜素红染色、油红O染色阳性。证实全骨髓贴壁法操作简单、对细胞活性损伤小，可以得到高纯度、高活性、高分化潜能、生物学形态和特征稳定的骨髓间充质干细胞。 -
去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的体外成骨诱导
背景：细胞学研究表明，骨髓间充质干细胞在绝经后骨质疏松症的发病过程中起有重要作用。
目的：观察去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的体外成骨分化。
方法：将6月龄雌性SD大鼠双侧卵巢切除建立骨质疏松模型。实验分为4组：正常干细胞组、骨质疏松干细胞组、正常干细胞成骨诱导组、骨质疏松干细胞成骨诱导组。全骨髓贴壁法培养正常和骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞至第3代细胞用于实验。倒置相差显微镜观察细胞形态，流式细胞仪测定细胞周期、增殖指数。加成骨诱导液进行成骨诱导，检测各组骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性，茜素红染色法比较各组钙结节的形成。
结果与结论：正常干细胞成骨诱导组、骨质疏松干细胞成骨诱导组均具有成骨细胞的形态特征，但骨质疏松干细胞成骨诱导组形态变化相对缓慢。正常干细胞组细胞增殖指数高于骨质疏松干细胞组(P<0.05)；成骨诱导组碱性磷酸酶活性均明显高于相应的正常或骨质疏松干细胞组(P<0.05)；正常干细胞成骨诱导组明显高于骨质疏松干细胞成骨诱导组(P<0.05)。成骨诱导组茜素红染色均呈阳性，相应的正常或骨质疏松干细胞组呈阴性；且正常干细胞成骨诱导组染色强于骨质疏松干细胞成骨诱导组。提示去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的增殖能力和成骨分化能力明显降低，可能与去卵巢大鼠骨质疏松的发生相关。 -
腺病毒介导骨形态发生蛋白2基因转染诱导脂肪间充质干细胞向成骨细胞的定向分化
背景:在众多的骨生长因子中,骨形态发生蛋白2具有著促进骨缺损修复和骨折愈合的效果.骨修复是一个阶段性过程,不需要转染的目的基因长久表达,因此利用腺病毒载体将目的基因导入脂肪间充质干细胞来促进骨愈合比较理想.目的:观察腺病毒介导的骨形态发生蛋白2基因转染后大鼠脂肪间充质干细胞的分化情况.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2008-01/10在北京大学第三医院中心实验室完成.材料:清洁级3周龄雄性Lewis大鼠24只,由北京大学实验动物学部提供.腺病毒载体Ad-BMP2、Ad-GFP由靳小兵博士构建扩增.方法:胶原酶消化法分离培养大鼠脂肪间充质干细胞,传至第3代分为Ad-BMP2转染组、Ad-GFP转染组和未转染组.各转染组分别向培养液中加入对应的腺病毒液,转染复数MOI=100.主要观察指标:转染后脂肪间充质干细胞碱性磷酸酶活性,von Kossa染色结果,Western blotting法检测骨桥蛋白和骨形态发生蛋白2的表达.结果:与未转染组比较,转染后7,14,21d Ad-GFP转染组细胞碱性磷酸酶活性无明显变化;Ad-BMP2转染组细胞碱性磷酸酶活性明增高(P<0.01),且随时间延长碱性磷酸酶活性增加更为显著.Ad-BMP2转染组von Kossa染色出现黑色钙结节,免疫细胞化学染色结果示胞浆内有大量黄染颗粒,骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2均呈明显强阳性表达.Westernblotting检测结果显示Ad-BMP2转染组脂肪间充质干细胞骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2表达水平增高,Ad-GFP转染组中未检测到骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2的表达.结论:大鼠脂肪间充质干细胞经腺病毒介导的骨形态发生蛋白2基因转染后,可定向分化为成骨细胞.
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1,25-二羟维生素D3和地塞米松促进人颞下颌关节滑液间充质干细胞的体外成骨分化
背景:人颞下颌关节滑液间充质干细胞获取微创简便且体外扩增能力强,成为组织工程修复一重要的种子细胞来源,优化其成骨分化能力有利于在关节骨组织再生中的应用.目的:分析1,25-二羟维生素D3和地塞米松对关节滑液间充质干细胞成骨能力的影响,获得人颞下颌关节滑液间充质干细胞成骨分化的理想条件.方法:将获得的人颞下颌关节滑液标本进行体外培养扩增,分别加入不同组分的成骨诱导液进行成骨诱导,通过茜素红和Von kossa 染色比较各组矿化形成情况,通过RT-PCR定量比较成骨相关标志ALP、RUNX2和OCN的表达.结果与结论:①体外培养的人颞下颌关节滑液间充质干细胞可以向成骨细胞分化,其中含有100 nmol/L地塞米松和10 nmol/L 1,25-维生素D3的成骨诱导液其矿化形成明显增强;②含有1,25-二羟维生素D3的成骨诱导液诱导后ALP、RUNX2和OCN的基因表达明显增加;③适当浓度的地塞米松和1,25-二羟维生素D3可以促进人颞下颌关节滑液间充质干细胞的成骨分化,从而可为其自体应用修复颞下颌关节组织提供依据.
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人羊膜间充质干细胞体外大量扩增的方法
背景：一个胎盘羊膜的面积约600 cm2，羊膜来源间充质干细胞即取材于胎盘上的羊膜。
目的：建立一种简单的体外分离培养人羊膜来源间充质干细胞的方法，并分析其生物学特性。
方法：采用胰酶和直接贴壁相结合的方法分离获取人羊膜来源间充质干细胞并进行体外培养，观察细胞形态，分析传代第5代细胞生长曲线，检测第5代细胞表面标志表达和检测细胞周期。取传代第4代细胞行体外成骨细胞诱导和成脂诱导，冻存第4代细胞6个月后复苏，计数复苏后细胞存活率并绘制复苏细胞生长曲线。
结果与结论：原代接种后第9天有少许细胞爬出，15 d左右细胞达80%-90%融合，细胞以梭形为主。细胞传代后，细胞形态均一，螺旋状排列。传代细胞潜伏期48 h，对数增殖期4 d左右，对数增殖期后进入平台期。间充质干细胞表面CD34、CD14、CD19、CD45、HLA-DR 呈阴性表达，CD73、CD105、CD90呈阳性表达。茜素红染色及油红O染色阳性，证实具有向脂肪细胞、成骨细胞分化的能力。流式细胞术细胞周期检测，S期占28%。冻存复苏后细胞存活率达90%以上，且与未冻存传代细胞具有相同的生长特性。结果证实实验成功地建立了一种简化的人羊膜来源间充质干细胞大量扩增的方法。 -
感觉神经递质降钙素基因相关肽对去势大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨能力的影响
背景:研究发现降钙素基因相关肽能够增强成骨细胞的生物学活性,实验拟进一步检测降钙素基因相关肽对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响.目的:探讨外源性降钙素基因相关肽对去势大鼠骨髓间充质干细胞增殖、成骨能力的影响.方法:切除雌性SD大鼠双侧卵巢建立骨质疏松模型,并通过micro-CT验证.从假手术和去势大鼠股骨中提取骨髓间充质干细胞,培养液中添加不同浓度降钙素基因相关肽,MTT法检测细胞增殖能力.对骨髓间充质干细胞进行成骨诱导,在诱导液中添加不同浓度降钙素基因相关肽,成骨诱导7 d,采用Real time RT-PCR和Western blot检测成骨特异性蛋白Runx2,Osterix的表达,成骨诱导21 d进行茜素红染色.结果与结论:①切除雌性大鼠双侧卵巢可成功建立骨质疏松模型;②不同浓度的降钙素基因相关肽可增强去势大鼠骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化能力,且具有剂量依赖性;③结果表明,降钙素基因相关肽对去势大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化能力有直接促进作用,从而有利于骨形成.
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同轴电纺P3HB4HB/聚乙烯醇复合支架的制备及其生物相容性
背景:聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)[poly(3-hydroxybutyrate-4-hydroxybutyrate),P3HB4HB]是一种能够完全降解,具有良好的成膜性、物理性能的高分子材料,但其亲水性较差.目的:制备同轴电纺P3HB4HB/聚乙烯醇复合支架,通过体外实验探讨支架的物理属性及生物相容性.方法:分别制备P3HB4HB电纺支架、聚乙烯醇电纺支架及同轴电纺P3HB4HB/聚乙烯醇复合支架,检测3组支架的形貌、接触角及拉伸力学性能.将第4代SD大鼠骨髓间充质干细胞分别接种于3组支架上,接种1,3,6 h,检测细胞黏附率;接种第1,3,5,7天,MTT法检测细胞增殖;接种7 d后,荧光染色观察细胞活性.将第4代SD大鼠骨髓间充质干细胞分别接种于3组支架上,成骨及成软骨诱导分化14 d后,进行茜素红、甲苯胺蓝染色.结果与结论:①支架形貌:扫描电镜下,3组支架呈三维网状相互连通的结构,相互交错,P3HB4HB电纺支架、复合支架纤维直径较为均一,排列规整;透射电镜下仅复合支架可见明显的芯-壳结构;②支架表征:P3HB4HB 电纺支架、复合支架的拉伸强度、拉伸弹性模量及拉伸大力明显高于聚乙烯醇电纺支架(P <0.05);复合支架的接触角< 90°;③细胞黏附率:聚乙烯醇电纺支架组>复合支架组>P3HB4HB电纺支架组(P < 0.05);④细胞增殖及活性:复合支架组接种5,7 d的细胞增殖快于其余两组(P < 0.05);接种7 d后,聚乙烯醇电纺支架、复合支架上的活细胞多于P3HB4HB电纺支架;⑤细胞分化:复合支架组细胞的成骨和成软骨特异性染色强于其余两组;⑥结果表明:同轴电纺P3HB4HB/聚乙烯醇复合支架具有良好生物相容性和有一定力学强度.
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矿化明胶静电纺丝诱导牙周组织成骨的有效性
背景：当前国内外关于矿化明胶电纺丝纤维对牙周组织成骨诱导有效性的文献较少。目的：观察矿化明胶静电纺丝对牙周膜成纤维细胞增殖及向成骨方面分化的影响。方法：将人牙周膜成纤维细胞分别与未矿化明胶静电纺丝、纳米羟基磷灰石矿化1 d的明胶静电纺丝、纳米羟基磷灰石矿化5 d的明胶静电纺丝复合培养，采用MTT法检测培养1，4，7，10，13 d的细胞增殖；应用生化仪检测培养1，7，14 d的细胞碱性磷酸酶活性。结果与结论：培养10 d时，矿化明胶静电纺丝膜组表面的牙周膜细胞分布均匀，生长良好，铺展成片状并分泌大量细胞外基质，细胞与材料结合紧密，且以矿化5 d组效果更明显，细胞生长密度和状态优于未矿化明胶静电纺丝膜组。不同时间点的细胞增殖活性与碱性磷酸酶活性：矿化5 d明胶静电纺丝膜组>矿化1 d明胶静电纺丝膜组>未矿化明胶静电纺丝膜组(P均<0.05)。表明经纳米羟基磷灰石矿化的明胶静电纺丝，可促进牙周膜成纤维细胞增殖及向成骨方向分化，且矿化时间越长效果越明显。
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组织块贴壁法扩增兔脂肪干细胞
背景：研究显示兔脂肪干细胞的体外分离方法大多数为Ⅰ型胶原酶消化法，采用组织块贴壁法扩增兔脂肪干细胞尚不多见。
目的：采用组织块贴壁法从兔脂肪组织中分离培养兔脂肪干细胞，并进行成脂、成骨的诱导分化。
方法：采用组织块贴壁法分离出兔脂肪干细胞，进行体外培养，观察其形态特征。取对数生长期的第3代细胞，用MTT法绘制其生长曲线；流式细胞仪检测其表面抗原CD29、CD44、CD45的表达情况；分别用成脂和成骨诱导培养液诱导其向脂肪细胞和成骨细胞分化，油红O、茜素红染色定性鉴定。
结果与结论：体外培养的兔脂肪干细胞呈梭形纤维样细胞形态，生长力旺盛。流式细胞术分析结果显示，第3代兔脂肪间充质干细胞强表达CD29，CD44，阴性表达CD45。兔脂肪干细胞经成脂诱导14 d后，油红O染色阳性；成骨诱导培养14 d后，茜素红染色阳性。提示组织块贴壁法可以分离培养出兔脂肪干细胞。
