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人骨髓来源多能成体祖细胞ZHJ-MAPCs与人肝细胞系L02体外共培养向肝样细胞的分化
目的:探索人骨髓来源多能成体祖细胞(ZHJ-MAPCs)在与人肝细胞系L02在体外共培养条件下诱导分化为肝细胞的可行性.方法:(1)间接共培养:将第4代ZHJ-MAPCs和人肝细胞系L02仅培养液相通行间接共培养.分别于培养第1、3、5、7天应用免疫细胞化学法鉴定ZHJ-MAPCs的ALB、AFP、CK-18、CK-19等肝细胞特征性表型表达情况,并设阳性对照和阴性对照,计数阳性细胞比率;(2)直接共培养:将CFSE荧光(绿色)标记的第4代ZHJ-MAPCs与L02(密度均为1×107/L)按照各50%比例混合行直接共培养.5 d后用SABC-Cy3免疫荧光(红色)双标后在激光共聚焦显微镜下分别观察ZHJ-MAPCs表达ALB,AFP,CK-18的情况.同样设阳性对照和阴性对照.结果:(1)间接共培养:AFP在ZHJ-MAPCs间接共培养第1天即表现为强阳性,随后表达逐渐减弱.ALB在共培养第1天有可疑阳性,第3天出现较强的阳性,第5天达到高峰.CK-18在培养第1、3天检测均为阴性,至第5天开始出现阳性,第7天表达较前增强.CK-19在各时间点均为阴性着色.(2)直接共培养:胞质内呈黄色荧光ALB和CK18的阳性细胞即向肝细胞分化的ZHJ-MAPCs在共培养5 d时出现较多,而AFP阳性表达则仅出现在极个别细胞,该结果与阳性对照细胞荧光表达类似.结论:人骨髓来源的ZHJ-MAPCs与人肝细胞系L02行间接或直接共培养均能够诱导其向成熟肝样细胞定向分化,且直接共培养有提前趋势.
关键词： 人骨髓来源多能成体祖细胞 肝细胞 直接共培养 间接共培养 -
血管内皮祖细胞/骨髓间充质干细胞复合细胞膜片的构建
背景：研究发现充足的血供是骨组织修复与再生必不可少的条件。
目的：应用血管内皮祖细胞与骨髓间充质干细胞构建出复合细胞膜片。
方法：体外分离培养SD大鼠血管内皮祖细胞及骨髓间充质干细胞，将两种细胞直接共培养，经成膜诱导10 d后构建出复合细胞膜片并对获得的膜片进行大体、倒置显微镜及苏木精-伊红染色观察。将血管内皮祖细胞及骨髓间充质干细胞分别应用荧光标记液标记后，观察膜片诱导过程中两种细胞的分布及交流情况。对复合细胞膜片进行碱性磷酸酶活性检测及茜素红染色，观察其成骨分化能力。
结果与结论：血管内皮祖细胞与骨髓间充质干细胞直接共培养成膜诱导10 d后可成功获得复合细胞膜片，两种细胞在成膜诱导过程中存在细胞间接触。获得的膜片由多层细胞及细胞外基质构成，经碱性磷酸酶活性检测及茜素红染色结果证实该膜片具有较强的成骨分化能力，为进一步将血管内皮祖细胞/骨髓间充质干细胞复合细胞膜片应用于骨缺损的修复提供了条件。 -
白细胞介素1β预处理骨髓间充质干细胞可影响骨髓瘤细胞株干细胞基因及趋化因子受体基因的表达
背景:既往多项研究提示多发性骨髓瘤患者间充质干细胞的细胞因子分泌、免疫调节、成骨分化等生物功能异常.目的:观察白细胞介素1β单次或多次预处理的正常间充质干细胞后,其再与多发性骨髓瘤细胞株共培养,对骨髓瘤细胞干细胞相关基因、趋化相关受体等表达的影响.方法:实验分为无白细胞介素1β预处理的骨髓间充质干细胞对照组、白细胞介素1β预刺激1d及白细胞介素1β预刺激7d组,各组分别培养7d后,均加入骨髓瘤细胞株H929直接接触共培养.3d后收集各组中骨髓瘤细胞株H929细胞,分别采用Western blot方法检测各组细胞NANOG、SOX2和OCT-4蛋白的表达水平,RT-PCR方法检测各组细胞趋化因子受体CCR1、CCR2、CCR6和CXCR4的基因表达水平.结果与结论:①与对照组比较,H929细胞株和单次白细胞介素1β处理组及多次白细胞介素1β处理组共培养后,SOX2蛋白表达水平升高(P＜0.05);②与对照组、单次白细胞介素1β处理组比较,多次白细胞介素1β处理组CCR1和CCR2基因的表达水平均增高(P＜0.05);③实验结果显示,正常骨髓间充质干细胞经炎症因子白细胞介素1β单次或多次刺激后,在与骨髓瘤细胞的相互作用中,对骨髓瘤细胞的干细胞基因表达、细胞趋化因子受体表达等均产生影响.这提示骨髓微环境中异常水平炎性因子,除了直接作用于骨髓瘤细胞之外,很可能通过影响间充质干细胞等非骨髓瘤细胞后,间接参与骨髓瘤疾病的发生和发展,并且其对骨髓瘤细胞的影响效果与白细胞介素1β作用间充质干细胞的时间长短有关.
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大鼠肝脏前体细胞通过直接共培养抑制肝星状细胞的活化
目的：观察大鼠肝脏前体细胞系（WB-F344）对肝星状细胞系（HSC-T6）活化及细胞外基质的影响。方法将慢病毒-GFP 空白载体转染的 HSC-T6与 WB-F344按1∶1与1∶2比例直接共培养3 d，使用流式细胞仪对其进行分选，慢病毒-GFP 空白载体转染的 HSC-T6单独培养作为对照，观察 HSC-T6活化指标及细胞外基质相关指标表达的变化。结果经流式细胞仪检验慢病毒-GFP 空白载体转染 HSC-T6的效率可达近90％；与 WB-F344直接共培养3 d 后，HSC-T6的细胞形态与对照组相比无差别；同时利用 GFP 对各组 HSC-T6细胞分选后，经流式细胞仪检验纯度可达94％；对分选后的细胞进行分析发现，直接共培养组 HSC-T6细胞活化标记物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）在基因水平（1∶1与1∶2组分别是对照组的0．66与0．61倍，P＜0．05）和蛋白水平（1∶1与1∶2组分别是对照组的0．61倍与0．25倍，P＜0．05）的表达均下降；HSC-T6细胞的细胞外基质标记物 I 型胶原（Col-I）、基质金属蛋白酶-13（MMP-13）、金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP-1）的表达与对照组比较差异无统计学意义。结论WB-F344细胞可以抑制 HSC-T6细胞的活化，但在一定时间内对其细胞外基质的表达没有影响。
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人脐带间充质干细胞与牙髓细胞体外共培养对细胞生物学的影响
目的:研究人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)与经骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)诱导后的人牙髓细胞(human dental pulp cells,hDPCs)共培养对细胞生物学特性的影响.方法:分别取原代培养的hUCMSCs和hDPCs,分别通过流式细胞术、成骨诱导、成脂诱导以及免疫组织化学染色鉴定细胞;使用BMP2诱导hDPCs,14 d后检查其DSPP、ALP、DMP1的mRNA表达情况;按照1∶1、1∶5、5∶1的比例直接共培养hUCMSCs与经BMP2诱导后的hDPCs,实时定量PCR检测其DSPP、ALP、DMP1、OCN、VEGF、HGF、Nanog的mRNA表达情况.根据实时定量PCR结果选取1∶1组与单独培养hUCMSCs组、hDPCs组比较,分别培养21 d后进行茜素红染色,在酶标仪上于562 nm处检测沉淀物形成情况.采用SPSS21.0软件包对数据进行统计学分析.结果:直接共培养14d后,1∶1细胞组的DSPP、ALP、DMP1、OCN、VEGF、HGF的mRNA表达量比单独培养的hUCMSCs组显著升高(P＜0.05),而Nanog mRNA表达量比单独培养的hUCMSCs组降低(P＜0.05).茜素红染色结果显示,1∶1组的OD值显著高于hUCMSCs组(P＜0.05).结论:将hUCMSCs与经BMP2诱导后的hDPCs按照1∶1比例共培养,可以诱导细胞向成牙本质细胞方向分化,并促进血管生成因子的表达.
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Emdogain对共培养成骨样细胞及内皮细胞成骨及成血管基因表达的影响
目的:评价emdogain对直接与间接共培养条件下成骨样细胞和内皮细胞成骨及成血管基因表达的影响以及其间的相关性.方法:将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和成骨样细胞(MG63)按2∶1比例于12孔板内进行直接及间接共培养,并使用不同浓度(0、0.1、1、10、50上g/mL)的emdogain共培养细胞72 h.采用细胞计数仪结合流式细胞仪评价细胞增殖情况,并通过荧光激活流式细胞分选技术分选共培养细胞.对分选后的成骨样细胞及内皮细胞采用实时荧光定量PCR分别检测成骨相关基因碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原蛋白(Col-1)及成血管相关基因血管内皮细胞生长因子(VEGF)、VEGF酪氨酸激酶受体1(Flt-1)、VEGF酪氨酸激酶受体2(KDR)、von Willebrand因子(vWF)、内皮细胞C蛋白受体(EPCR)、E选择素(E-Selectin)、促血管生成素2(Ang-2)的表达水平.采用SPSS24.0软件包对数据进行统计学处理.结果:在直接与间接共培养条件下,Emdogain对MG63及HUVEC细胞增殖的作用具有浓度依赖性.随着emdogain浓度增加,细胞增殖率逐渐下降.50 μg/mL浓度的emdogain对MG63及HUVEC细胞增殖抑制作用为明显.随着emdogain浓度增加,MG63表面ALP和Col-1表达水平逐渐增加;50 μg/mL浓度条件下,表达水平高且与其他组基因表达水平差异显著(P＜0.01).同一emdogain浓度条件下,直接共培养MG63表面ALP及Col-1表达水平均显著高于间接共培养(P＜0.01).除10 μg/mL组外,直接共培养条件下,VEGF表达水平均显著高于间接共培养(P＜0.01).50 μ,g/mL组直接共培养的HUVEC表面Flt-1、KDR、vWF、E-selectin基因表达水平显著高于间接共培养及直接共培养的其他各组(P＜0.01).间接共培养条件下,HUVEC表面EPCR及Ang-2基因表达水平显著高于直接共培养(P＜0.05).结论:Emdogain对共培养MG63和HUVEC增殖的作用具有浓度依赖性,50 μg/mL可能是emdogain作用的关键浓度.在直接共培养条件下,50 μg/mL emdogain抑制MG63及HUVEC细胞增殖,但能同时促进MG63及HUVEC细胞相关基因表达;且该条件下emdogain的作用显著强于其他实验条件,细胞间直接交联可能在其中发挥重要作用.
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人骨髓来源多能成体祖细胞与人肝细胞体外直接共培养向肝样细胞分化的实验研究
目的 探索人骨髓来源多能成体祖细胞(ZHJ-MAPCs)在与人肝细胞系L02在体外共培养条件下诱导分化为肝细胞的可行性.方法 直接共培养:将CFSE荧光(绿色)标记的ZHJ-MAPSs与L02(密度均为1×104/ml)按照各50%比例混合行直接共培养.5 d后用SABC-Cy3免疫荧光(红色)双标后在激光共聚焦显微镜下分别观察ZHJ-MAPCs表达ALB,AFP,CK-18的情况.并设阳性对照(单独培养的L02细胞)和阴性对照(单独培养未经诱导的ZHJ-MAPCs).结果 在共培养第5天检测ALB和CKl8时出现较多胞浆内呈黄色荧光的阳性细胞即向肝细胞分化的ZHJ-MAPCs,而在检测AFP时阳性细胞较少.结论 ZHJ-MAPCs与人肝细胞系L02行直接共培养能够诱导其向成熟肝样细胞定向分化.
关键词： 人骨髓来源多能成体祖细胞 肝细胞 直接共培养
