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高浓度葡萄糖对人牙周膜成纤维细胞成骨分化能力的影响
目的：??研究高葡萄糖浓度刺激下牙周膜成纤维细胞（PDLC）的增殖能力和成骨分化能力。方法???体外组织块法培养非糖尿病患者PDLC，分别用0?mg·L-1（C组）、1?100?mg·L-1（L组）、4?500?mg·L-1（H组）浓度葡萄糖刺激PDLC，噻唑蓝（MTT）法检测PDLC增殖能力，矿化诱导后茜素红染色观察矿化结节的形成情况，碱性磷酸酶（ALP）活性检测和实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测成骨相关基因表达。结果???MTT检测结果显示，H组OD值较L组和C组低（P<0.05）；成骨诱导21?d后，H组矿化结节面积较L组和C组少（P<0.05）；成骨诱导期间， H组ALP活性较L组和C组明显偏低（P<0.05）；H组早期成骨基因Runt相关转录因子2、ALP和Ⅰ型胶原诱导前后相对倍增数较L组和C组低（P<0.05）。结论???高浓度葡萄糖能够抑制PDLC增殖能力和成骨分化能力。
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骨髓基质干细胞体外诱导成骨细胞的研究进展?
大量科学研究表明,来源于中胚层的未分化的间充质细胞是骨髓非造血干细胞中的一类,这类细胞体外扩增程度高、可多个向分化、容易进行移植、可支持造血等,其独特之处为该细胞可向诸如成骨细胞、软骨细胞、脂细胞、肌细胞、神经细胞、内皮细胞、肝细胞等多种细胞分化,所以其又被称为骨髓基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)。BMSCs 是获取目标细胞、目标组织热门的种子细胞[1]。近几十年来,关于 BMSCs 的多向分化特性有了不断深入的研究,在探讨如何将BMSCs 诱导分化为成骨细胞的方法方面做了大量的科学研究。现就 BMSCs 体外定向诱导成骨细胞的方法作一综述,对其研究进展作一回顾。
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高糖环境下FGF-21对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响
目的 研究高糖环境下成纤维细胞生长因子21 (FGF-21)对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)骨向分化的作用及其机制.方法 取健康成人骨髓,分离培养hBMSCs,成骨、成脂诱导分化后,茜素红、油红O染色鉴定,流式细胞仪检测第3代细胞表面标志物CD105、CD90、CD73和CD44水平.将hBMSCs分为对照组[以葡萄糖(Glu)浓度5.5 mmol/L模拟正常生理状态糖浓度],Glu A、B、C高糖浓度梯度组(Glu 16.5、25、40 mmol/ L),FGF-21干预组(Glu 5.5 mmol/ L+ FGF-21),高糖环境FGF-21干预组(Glu B+ FGF-21)和Glu B+ FGF-21干预+细胞丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导阻断剂(包括PD98059、SP600125、SB203580)组.成骨诱导第14天,检测碱性磷酸酶(ALP)活性;成骨诱导第21天,以RT-PCR检测骨向分化的相关因子ALP、骨钙素(OCN)、Runx2的mRNA水平,以Western blot检测MAPK通路中细胞外信号调节激酶(ERK1/2)、P38丝裂原活化蛋白激酶(P38)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)蛋白磷酸化水平.结果 ①分离培养得到的hBMSCs成骨、成脂诱导后茜红素、油红O染色阳性,hBMSCs被成功地诱导向成骨细胞(OB)和脂肪细胞分化.流式细胞仪鉴定为hBMSCs.②与对照组相比,高糖组的骨向分化标志物ALP、OCN、Runx2的mRNA水平明显增加,MAPK通路中ERK、P38、JNK磷酸化水平表达增加.③与GluB组相比,Glu B+ FGF-21组的ALP、OCN、Runx2的mRNA水平降低,ERK、P38和JNK的磷酸化水平降低.④与Glu B+ FGF-21组相比,Glu B+ FGF-21+ MAPK信号转导阻断剂组的ALP、Runx2的mRNA水平进一步降低,且相应的ERK、JNK和P38及其磷酸化水平进一步降低.结论 高糖能促进hBMSCs的骨向分化.高糖环境下FGF-21具有抑制hBMSCs的成骨分化或矿化作用.
关键词： 成纤维细胞生长因子21 人骨髓间充质干细胞 成骨诱导 高糖环境 MAPK信号通路 -
大鼠骨髓基质细胞的生长特点和在诱骨条件下的成骨特性
目的研究大鼠骨髓基质细胞（rMSCs）的生长特点和在诱导条件下的成骨特性。方法使用密度梯度法分离成年大鼠骨髓基质细胞进行培养，保留贴壁细胞传代，观察、测试在培养液中添加成骨诱导剂地塞米松（Dex）10-8mol/L、β-甘油磷酸钠（β-GP）10mmol/L, 抗坏血酸（AA）50μg/ml条件下骨髓基质细胞的生长变化和成骨分化。结果形态学观察表明，rMSCs贴壁细胞呈集落生长，有成纤维细胞样外观。利用MTT法和流式细胞术（FCM）测定增殖的结果表明，传代次数增加，rMSCs的增殖活性升高。成骨诱导剂促进骨髓基质细胞的增殖，而且对多次传代细胞促增殖作用明显。成骨诱导剂促进骨髓基质细胞成骨，在诱导3周时即出现明显的钙化结节。组织化学染色结果显示，非诱导条件下MSCs的碱性磷酸酶(ALP)水平会随传代而升高。传3代rMSCs的ALP的表达较弱，诱导一周后ALP的表达明显升高，超过未加诱导剂的传一代大鼠成骨细胞(OB)的ALP表达。结论本实验表明所培养的rMSCs仍处于低分化水平，具有骨祖细胞的特性。
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HtrA1及其相关因子MGP、BMP-2在人牙周膜细胞体外成骨分化和矿化过程中的动态表达
目的 研究HtrA1、MGP、BMP-2在人牙周膜细胞成骨分化中的生物学作用,初步探讨HtrA1与MGP、BMP-2在这一过程中的表达关系.方法 首先用矿化诱导剂(β-磷酸甘油钠、地塞米松和抗坏血酸等)对人牙周膜细胞进行矿化诱导,建立体外牙周膜细胞矿化模型.然后通过检测碱性磷酸酶(ALP)活性,茜素红染色检测矿化结节形成,o-CPC法检测胞外基质钙沉积,以及用荧光定量PCR方法检测成骨分化指标ALP、骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein,BSP)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、胶原蛋白(COLI)和核心结合蛋白因子2(runt-related transcription factor-2,RUNX2),来证实人牙周膜细胞成功进行了成骨分化以及体外矿化模型成功建立.采用荧光定量PCR和Western Blotting的方法检测HtrA1与MGP、BMP-2的动态表达,研究3者的表达变化规律和相互表达关系.结果 人牙周膜细胞在矿化诱导组中的ALP活性显著升高;从矿化诱导的第7天到第14天,可见钙沉积的数量出现陡增,而后钙含量增加则趋于平缓,说明在这一阶段牙周膜细胞发生了较为明显的成骨分化特征改变.而在对照组中,细胞外基质中的钙沉积没有明显变化,与矿化诱导组相比显著降低(P＜0.05);在矿化诱导的第0、3、7、11、14、21、28天中,HtrA1蛋白水平表达则呈现逐步升高趋势,而MGP和BMP-2的蛋白表达模式相似,呈现整体逐渐下降的趋势.结论 对人牙周膜细胞进行体外成骨诱导的过程中,发现HtrA1的表达水平增高,而其相关信号分子MGP、BMP-2的表达则呈现下降趋势,推测HtrA1、MGP、BMP-2三者共同参与了人牙周膜细胞成骨分化过程,并且HtrA1可能通过调节MGP、BMP-2来发挥作用.
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人小涎腺成纤维样单克隆细胞的成骨分化
目的:探索人小涎腺成纤维样单克隆细胞的体外培养、扩增方法,鉴定其性质,研究向成骨细胞分化的潜能.方法:组织块贴壁法原代培养人小涎腺细胞,收集成纤维样细胞,用96孔板稀释铺板法克隆培养,免疫荧光和RT-PCR检测细胞表型,并进行成骨诱导分化,通过骨钙素、一型胶原免疫细胞化学染色及碱性磷酸酶、茜素红钙结节染色鉴定成骨分化、结果:成功的在体外扩增培养出人小涎腺成纤维样单克隆细胞,免疫荧光证实细胞表达CD13、CD29、CD106和CD44,RT-PCR显示CK18、α-SMA、vimentin、CD106、nestin基因表达与人骨髓间充质干细胞相似.成骨诱导8天后,碱性磷酸酶表达阳性率100%,19天后骨钙素和一型胶原大量表达,并形成钙结节.结论:所建立的分离培养体系能够获得大量人小涎腺成纤维样单克隆细胞,免疫表型类似于间充质干细胞.在成骨诱导培养条件下具有良好的向成骨细胞分化的潜能.
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2型糖尿病伴牙周炎患者牙周膜干细胞骨向分化研究
目的:比较牙周炎和2型糖尿病伴牙周炎患者牙周膜干细胞成骨分化能力.方法:体外组织块法和有限稀释法克隆化培养牙周炎患者牙周膜干细胞(P-PDLSCs组)和2型糖尿病伴牙周炎患者牙周膜干细胞(D-PDLSCs组),计算克隆形成率,免疫荧光检测细胞表型分子CD146、STRO-1进行干细胞鉴定,矿化诱导后茜素红染色观察矿化结节形成,实时定量聚合酶链反应(real time PCR)检测成骨相关基因表达.结果:P-PDLSCs组和D-PDLSCs组细胞的克降形成率分别为(25.6±2.7)％和(17.9±1.7)％(P＜0 05)；P-PDLSCs组CD146和STRO-1表达明显高于D-PDLSCs组；成骨诱导21 d后茜素红染色,2组均出现不同程度的矿化结节,P-PDLSCs组的矿化能力较D-PDLSCs组强；成骨诱导1周后D- PDLSCs组碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、Runx-2和Ⅰ型胶原蛋白(type-Ⅰ collagen,Col-Ⅰ)的mRNA表达均明显低于P-PDLSCs组(P＜0.05).结论:糖尿病伴牙周炎患者牙周膜干细胞成骨分化能力低于单纯牙周炎患者牙周膜干细胞.
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大鼠骨髓间充质干细胞与脂肪间充质干细胞生物学特性的比较
目的:本研究旨在比较同一个体来源的脂肪间充质干细胞(Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)和骨髓问充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的生长特点和诱导分化能力.方法:取7～10dSD大鼠的脂肪和骨髓,体外分离、纯化脂肪和骨髓来源间充质干细胞,分别从细胞形态、生长动力学、表面标志、分化潜能等方面进行鉴定和比较.结果:脂肪间充质干细胞的增殖速度明显大于骨髓间充质干细胞(P＜0.05),两种细胞所表达的表面蛋白标志物基本相似,但脂肪间充质干细胞表面蛋白标志CD106呈阴性,而骨髓间充质干细胞CD106呈阳性.在成软骨分化中脂肪间充质干细胞弱表达Ⅱ型胶原,而骨髓间充质干细胞不表达.第5、10、15、20代ADSCs及BMSCs经成骨诱导后茜素红染色均呈阳性且有“矿化”结节形成,碱性磷酸酶活性以第5代强,随着细胞代次的递增,碱性磷酸酶活性呈递减趋势.结论:ADSCs较BMSCs更易于分离培养及体外扩增,诱导条件下成骨、成脂、成软骨能力较强,适合作为再生医学的种子细胞.
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大鼠脂肪干细胞体外定向诱导分化为成骨细胞的研究
目的:研究脂肪组织来源干细胞(adipose tissue-derived stem cells,ADSCs)在体外分离培养、诱导分化为成骨细胞的能力,探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性.方法:从SD大鼠腹股沟脂肪垫分离出脂肪组织,通过Ⅰ型胶原酶消化法获取原代ADSCs,适时传代.逐日倒置显微镜下观察细胞形态及增殖特征.第3代细胞用成骨诱导培养基向成骨细胞诱导分化,并进行碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色及免疫细胞化学染色鉴定成骨细胞特性.结果:从大鼠脂肪组织中分离培养出ADSCs,体外形态类似成纤维细胞,增殖迅速.在地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠及1,25-(OH)2VitD3诱导下,ADSCs表现出成骨细胞特性:ALP活性显著增高,Von Kossa染色出现钙化结节,OC、Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色阳性.结论:ADSCs易于分离培养,体外扩增迅速,经矿化诱导后可分化为成骨细胞,可作为骨组织工程的种子细胞.
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大鼠来源脂肪干细胞的分离培养及其分化能力的检测
目的 分离、培养及鉴定SD大鼠来源脂肪干细胞,为后续实验选取合适的种子细胞奠定基础.方法 切取SD大鼠腹股沟处皮下脂肪,利用酶原消化合并差速贴壁的方法获得细胞,在倒置相差显微镜下观察细胞形态和增殖特征,测定其生长曲线,进行冻存复苏实验.第3代细胞在成骨诱导液作用下向成骨方向分化,进行Ⅰ型胶原染色、碱性磷酸酶染色、茜素红染色；使用成脂诱导液诱导其向成脂方向分化,进行油红O)染色.结果 从大鼠脂肪组织获得的细胞,呈成纤维细胞样生长；经成骨诱导液培养后,表现出成骨细胞特性,Ⅰ型胶原染色、碱性磷酸酶染色、茜素红染色均呈阳性；经成脂诱导液培养后,表现出脂肪细胞特性,油红O染色后,胞浆内可见脂肪滴.脂肪干细胞在液氮中冻存2个月复苏后,其生长增殖活性和多向分化能力没有明显降低.结论 成功分离和培养大鼠脂肪干细胞,获得的细胞增殖旺盛,具有多向分化潜能,为后期运用组织工程技术修复组织损伤,提供了坚实的基础.
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成骨诱导后的脐血间充质干细胞与β-磷酸三钙复合植骨材料对兔颅骨缺损的修复作用
目的 探讨成骨诱导后的人脐血间充质于细胞(UCB-MSCs)与β-磷酸三钙(TCP)构成的人工植骨材料修复兔颅骨缺损的作用.方法 在无菌条件下用密度梯度离心和贴壁培养法分离培养人UCB-MSCs;取传3代细胞应用条件培养基进行成骨诱导2周后,绘制细胞生长曲线并检测碱性磷酸酶(AKP)、骨钙素(OCN)和钙离子的含量;成骨诱导后UCB-MSCs与β-TCP复合培养后形成人工植骨材料,用扫描电镜观察成骨诱导后的UCB-MSCs在β-TCP表面的生长状况;按人工植骨材料的形状制作兔颅骨全层缺损模型,术后4周行颅骨X线摄片,分析人工材料对骨缺损的修复作用.结果 采用Percoll(1.073 g/mL)密度梯度离心和贴壁培养得到的UCB-MSCs大小较为均匀、梭形或星形的成纤维细胞样细胞.成骨诱导前后细胞的生长曲线测定无明显变化;UCB-MSCs内AKP、培养基中的OCN含量和细胞内钙离子的含量与对照组相比均明显增高(P＜0.01);成骨诱导的细胞在β-TCP表面生长良好,在细胞周围有白色的钙盐沉积.人工植骨材料植入骨缺损4周后,发现复合材料与颅骨缺损中间大部分被高密度影所充填.结论 成骨诱导后的UCB-MSCs呈现成骨细胞特性,在β-TCP表面生长状态良好;与β-TCP构成人工植骨材料具有促进骨缺损修复的作用.
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葛根素促进犬骨髓基质细胞成骨分化的初步研究
目的 从细胞生物学角度观察葛根素对犬骨髓基质细胞的成骨诱导作用,探讨葛根素的促成骨效果.方法 原代培养犬骨髓基质细胞,第三代时加入葛根素,实验分四组:实验组3组DMEM培养基+葛根素(葛根素液浓度分别为0.01、0.1、1mmol/L);对照组1组为DMEM培养基(无葛根素).用倒置显微镜观察细胞形态,CCK-8检测药物毒性,茜素红染色观察钙结节,后用SPSS20.0软件对数据行统计分析.结果 葛根素液诱导细胞后,能明显促进细胞增殖,且葛根素浓度为0.1 mmol/L时促增殖明显,与空白对照组比较差异有显著性(P＜0.05),药物诱导后各组碱性磷酸酶活性增加,其中药物浓度为0.1 mmol/L的实验组与另两组比较有明显差异(P＜0.05),葛根素诱导培养16 d后可观察到钙结节形成.结论 葛根提取物葛根素能明显促进犬骨髓基质细胞的增殖和成骨分化,其中浓度为0.1 mmol/L时效果好.
