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转录因子ATF3/ATF4调控抗氧化系统与慢性阻塞性肺疾病
氧化/抗氧化失衡是慢性阻塞性肺疾病主要发病机制之一.转录因子转录激活因子3/转录激活因子4在氧化应激条件下能与核因子相关因子-2相互作用,调节抗氧化酶的表达,进一步探讨其在氧化应激中的表达、作用及机制将为慢性阻塞性肺疾病的防治提供新的理论依据.
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骨髓间充质干细胞诱导成骨细胞模型中活化转录因子4基因的表达
背景：研究发现活化转录因子4为近调控成骨细胞分化和功能的活化因子，在成骨细胞分化过程中起着至关重要的作用。
目的：探索SD大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导过程中活化转录因子4基因的表达变化及其意义。
方法：以全骨髓贴壁法培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，传代至第3代细胞时加入成骨诱导剂，在诱导的第0，1，4，7，10，13，16，19天分别采用PT-PCR，Western blot动态监测活化转录因子4基因及蛋白的表达变化，以未进行成骨诱导细胞做对照。
结果与结论：RT-PCR结果显示，活化转录因子4 mRNA的表达随着细胞成骨分化程度加剧而升高，16 d达到峰值。Western blot分析结果显示，活化转录因子4蛋白表达量随着骨髓间充质干细胞骨化程度加剧，表达水平亦呈上升趋势，于16 d达到高峰，19 d维持在高水平状态。实验组各时间点活化转录因子4 mRNA和活化转录因子4蛋白表达与对照组相比差异有均有显著性意义(P<0.05)。结果表明诱导成骨细胞中活化转录因子4表达增强，提示活化转录因子4的增强与骨髓间充质干细胞成骨分化能力呈正相关。 -
核糖体蛋白L41对人视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖和凋亡的影响及其机制
目的 研究核糖体蛋白L41(ribosomal protein L41,RPL41)对人视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖和凋亡的影响及其机制.方法 将人视网膜母细胞瘤Y79细胞接种于含体积分数10％胎牛血清的RPMI 1640培养液中传代培养.根据药物处理浓度分为对照组(RPL41浓度为0μmol·L-1)、40μmol·L-1 RPL41处理组、80μmol·L-1 RPL41处理组、120 μmol·L-1RPL41处理组.CellTiter-Glo荧光细胞活性检测系统检测各组细胞活性;流式细胞仪检测100 μmol·L-1RPL41处理后细胞凋亡率,Hoechst染色观察细胞凋亡形态;Western blot检测各组细胞中活化转录因子4(activating transcription factor 4,ATF4)的含量.结果 与对照组相比,40 μmol·L-1 RPL41处理组细胞活性为(97.9±1.5)％,无明显变化,差异无统计学意义(P=0.055);80 μmol·L-1 RPL41处理组细胞活性为(87.6±1.8)％,120 μmol·L-RPL41处理组为(63.9±2.0)％,与对照组相比差异均有统计学意义(均为P＜0.05).RPL41对Y79细胞增殖有明显的抑制作用.100 μmol·L-1RPL41能够促进Y79细胞凋亡,凋亡率为(17.33±2.47)％.100 μmol·L-1RPL41处理组凋亡细胞与正常细胞相比,细胞颜色较亮,细胞体积较小.40 μmol·L-1RPL41处理组ATF4蛋白含量为0.76 ±0.04,80 μmol·L-1RPL41处理组为0.29±0.04,120 μmol·L-1 RPL41处理组为0.29±0.05,与对照组相比,差异均有统计学意义(均为P＜0.01).RPL41能够降低Y79细胞中ATF4的蛋白含量.结论 RPL41能抑制人视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖,诱导细胞凋亡,其作用机制可能与ATF4有关.
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Krüppel样因子6经活化转录因子4通路对晶状体上皮细胞凋亡的调控作用
目的 以活化转录因子4(ATF4)为靶点,探讨Krüppel样因子6(KLF6)调控紫外线B(UVB)诱导的晶状体上皮细胞(HLECs)凋亡的分子机制.方法 HLECs系(HLE-B3)进行常规培养,采用脂质体转染法将构建的真核表达质粒pEGFP-C2-ATF4转染HLECs作为UVB+ ATF4转染组,并用能量密度为20 mJ/cm2的UVB照射细胞;未转染的ATF4细胞作为正常对照组.采用苏木精-伊红染色法和Hoechst染色法观察ATF4对HLECs细胞形态学的影响.将培养的细胞分为KLF6转染组及相应空质粒对照组,小干扰KLF6(siKLF6)组(转染pSilencer-KLF6质粒)及相应的空载体对照组(转染pSilencer空质粒),采用Western blot法检测细胞中ATF4蛋白的相对表达量.将培养的细胞分为4个组,联合空载体组HLECs联合转染pEGFP-C2空载体和pSilencer空载体;KLF6+ pSilencer空质粒组HLECs联合转染pEGFP-C2-KLF6和pSilencer 空载体;小干扰ATF4(siATF4)+pEGFP-C2组HLECs联合转染pEGFP-C2空载体和pSilencer-ATF4;KLF6+ siATF4组HLECs联合转染pEGFP-C2-KLF6和pSilencer-ATF4,各组细胞均暴露于UVB 200 s,采用ELISA法检测上述各组HLECs凋亡值.结果 正常对照组培养的HLECs大小均匀,排列整齐,细胞核呈卵圆形,数量多且完整;UVB照射后部分细胞核固缩,细胞间隙增大,少数细胞出现核分裂;UCB+ATF4转染组细胞数量减少,多数细胞出现核固缩和核分裂.UVB+ATF4转染组细胞中ATF4蛋白表达条带灰度明显强于UVB+空载体组,ATF4蛋白相对表达量分别为0.99±0.06和0.13±0.02,差异有统计学意义(t=23.13,P＜0.01).KLF6转染组细胞中KLF6和ATF4蛋白相对表达量均明显高于其空载体对照组,siKLF6组细胞中KLF6和ATF4蛋白相对表达量均明显低于其空载体对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.01).ELISA检测显示ATF4转染组HLECs凋亡值为1.37±0.11,明显高于正常对照组的0.31±0.11,差异有统计学意义(t=8.034,P=0.001);KLF6+pSilencer空质粒组细胞凋亡值明显高于联合空载体组,siATF4+pEGFP-C2组细胞凋亡值明显低于联合空载体组,差异均有统计学意义(P＜0.01,P=0.02);KLF6+siATF4组细胞凋亡率明显低于KLF6+ pSilencer空质粒组,差异有统计学意义(P＜0.01). 结论 KLF6通过活化ATF4促进UVB诱导的HLECs凋亡,ATF4基因沉默可使细胞凋亡值明显降低,因此ATF4可作为KLF6调控HLECs凋亡的靶因子,也是KLF6调控LECs凋亡的主要生物机制之一.
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活化转录因子4激活致小鼠小梁网炎症及细胞凋亡
[目的]旨在通过体内研究,探讨内质网应激的主要标志物,活化转录因子4(ATF4)在小梁网功能障碍、细胞凋亡中所起的作用,以期为阐明原发性开角青光眼(POAG)的发病机制提供新的思路.[方法]选取6～8周大的C57BL/6J小鼠47只,实验组(24只,24眼)单眼前房注射ATF4腺病毒,对照组(23只,23眼)单眼前房注射GFP腺病毒.在注射后的不同时间点,分别取实验组和对照组小鼠的前房角组织,用冰冻切片和免疫荧光染色法观察病毒荧光及内质网应激相关蛋白ATF4和C/EBP同源蛋白(CHOP)的表达;用实时荧光定量PCR法检测炎症因子IL-1α,IL-1β,IL-6以及内皮细胞白细胞黏附分子1(ELAM-1)在mRNA水平的表达;用TUNEL染色法观察小梁网细胞的凋亡情况;用超薄切片和透射电镜观察小梁网细胞的超微结构.在注射前及注射后第3、7、10及13天分别用回弹式眼压计测量小鼠的日间及夜间眼压.[结果]注射后24 h即可观察到注射眼小梁网内的病毒荧光,且实验组小梁网ATF4的表达明显上调.在注射后3天,实验组小梁网组织的炎症因子在mRNA水平的表达较对照组明显升高.注射后7天,实验组小梁网组织出现CHOP的表达上调;小梁网TUNEL阳性细胞数比对照组显著增加;实验组小梁网细胞内可见明显扩张的粗面内质网.在注射后第7、10及13天,实验组日间眼压及夜间眼压均高于对照组,在术后第7天差别具有统计学意义(P<0.05).[结论]小梁网组织ATF4的表达上调可以引起炎症因子表达的上调,内质网相关凋亡通路的活化,以及小梁网细胞的凋亡.这些改变可能在眼压的升高中起到一定作用.
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活化转录因子4参与高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞炎症
目的 探讨活化转录因子4(ATF4)在高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞(HRMECs)炎症反应中的作用及机制.方法 将HRMECs分为正常糖组(5.5 mmol/L D-葡萄糖)、高糖组(25 mmol/L D-葡萄糖)、渗透压对照组(5.5 mmol/L D-葡萄糖+19.5 mmol/L 甘露醇)、高糖+ATF4干扰组、高糖+Scrambled组,各组的高浓度葡萄糖或甘露醇干预时间均为24 h,HRMECs中ATF4蛋白表达的干扰采用核糖核酸干扰技术.用蛋白免疫印迹法检测各组ATF4及炎症因子TNF-α、细胞间黏附因子-1(ICAM-1)、IL-1β、磷酸化核转录因子-κB p65(p-NF-κB p65)表达水平.用激光扫描共聚焦显微镜检测各组HRMECs的NF-κB p65核转位情况.结果 与正常糖组相比,高糖组中ATF4以及炎症因子TNF-α、ICAM-1、IL-1β、p-NF-κB p65的表达水平均上调(P均<0.05).渗透压对照组与正常糖组的ATF4以及炎症因子表达水平比较差异均无统计学意义(P均>0.05).与高糖+Scrambled组相比,高糖+ATF4干扰组中ATF4以及炎症因子的表达水平均下调(P均<0.05).与高糖组相比,高糖+ATF4干扰组中NF-κB p65核转位有所减弱.结论 高糖可诱导HRMECs发生炎症反应,促进NF-κB p65核转位,而敲低ATF4能减轻高糖诱导的炎症反应和NF-κB p65核转位,提示ATF4在高糖诱导的HRMECs炎症反应中起重要作用,该作用可能通过调节NF-κB p65的激活来实现.
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慢性阻塞性肺疾病患者肺组织中ATF3与ATF4对γ-GCS表达的影响
目的 探讨慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)患者肺组织中活化转录因子3 (ATF3)、活化转录因子4 (ATF4)的表达变化,以及ATF3和ATF4对γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)表达的影响,探讨其在慢阻肺发病中的作用.方法 收集伴或不伴慢阻肺并行肺叶切除的肺癌患者临床肺组织标本40例(慢阻肺组和对照组各20例),取材标本均为远离原发肺癌病灶5 cm以上、肉眼观察无肺癌浸润的外周肺组织.所有患者术前均详细询问病史,进行体格检查、胸部X线片或肺部CT以及肺功能检测.应用原位杂交及免疫组化检测患者肺组织中ATF3、ATF4、γ-GCS重链亚基(γ-GCS-HS) mRNA及蛋白的表达,应用免疫共沉淀法(CO-IP)检测ATF3、ATF4与γ-GCS-HS蛋白之间的相互作用,并对ATF3、ATF4 mRNA及蛋白与γ-GCS-HS mRNA及蛋白进行相关分析.结果 慢阻肺患者肺组织中ATF3、ATF4、γ-GCS-HS mRNA及蛋白呈强阳性表达,较对照组显著升高(P＜0.01).在γ-GCS-HS抗体捕获的免疫沉淀中,ATF3、ATF4抗体均可杂交出明显的蛋白条带,且慢阻肺组较对照组明显增强(P＜0.01).相关分析显示肺组织中ATF3、ATF4蛋白表达与γ-GCS-HS mRNA及蛋白表达均呈明显正相关(P＜0.01);ATF3、ATF4、γ-GCS-HS蛋白表达与FEV1％pred、FEV1/FVC均呈明显正相关(P＜0.01).结论 在慢阻肺患者发病过程中,氧化应激诱导转录因子ATF3和ATF4过表达,ATF3和ATF4可能通过影响γ-GCS mRNA和蛋白的表达而发挥抗氧化保护作用.
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转录因子ATF3和ATF4在大鼠慢性阻塞性肺疾病中的表达及作用
目的:研究活化转录因子3(ATF3)和活化转录因子4(ATF4)在慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺组织中的定位和表达,探讨其在COPD发病中的可能作用及意义.方法:采用气管内注入脂多糖和熏香烟的方法复制大鼠COPD模型.观察COPD大鼠和正常对照组大鼠肺组织病理学改变,检测肺功能;应用原位杂交、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组化、Western blot检测大鼠肺组织中ATF3、ATF4 mRNA及蛋白的表达情况.结果:COPD组的肺功能指标(FEV(0.3)、FEV(0.3)/FVC、PEF)明显降低,光镜下肺组织病理改变符合COPD的特征性改变.免疫组化及Western blot显示COPD组ATF3、ATF4蛋白水平较对照组升高(P<0.05);原位杂交及RT-PCR结果显示ATF3、ATF4 mRNA表达水平在COPD组显著高于对照组(P<0.05).结论:COPD大鼠肺组织ATF3、ATF4表达明显上调,ATF3、ATF4可能参与调控COPD的氧化/抗氧化失衡.
