首页 > 文献资料
-
骨髓间充质干细胞体外分化为心肌样细胞过程中结构蛋白的发育
目的探讨体外经5-氮杂胞苷诱导后的骨髓间充质干细胞(MSCs)分化成心肌样细胞过程中肌联蛋白在心肌结构蛋白发育过程中的作用.方法构建针对Wistar大鼠TITIN N2B区设计的重组质粒pSITITIN,将其分别转染入体外培养7 d的新生大鼠心肌细胞和经5-aza诱导后2周的MSCs中,免疫荧光检测肌联蛋白、MHC、肌动蛋白、cTnT的表达.结果重组质粒pSITITIN转染入正常心肌细胞后,肌联蛋白的表达减弱(P＜0.001);转染入经5-aza处理的MSCs后,肌联蛋白、cTnT的表达减弱,MHC、肌动蛋白的表达无明显变化.结论MSCs可以被5-aza诱导分化成心肌样细胞,但分化程度不高,尚不具备完整的收缩结构基础,肌联蛋白对心肌结构蛋白发育过程有重要的意义.
-
小鼠胚胎干细胞来源的心肌细胞系的建立
收缩.分化为心肌细胞所表达的特异性蛋白cTnT、Desnfin和Actin表达呈阳性,并表达心肌特异性基因cTnT、NKX2E、GATA-4和MLC-2v.结论 mES细胞来源的Ebs在MatrigelTM培养体系中能够分化为心肌细胞,籍此我们建立了一株细胞系.
关键词： 小鼠胚胎干细胞(mES) 拟胚体(EBs) 分化 心肌细胞 -
Akt在Islet-1诱导间充质干细胞C3H10T1/2向心肌细胞特异分化过程中的作用
目的 研究Akt在Islet-1诱导间充质干细胞C3H10T1/2向心肌细胞特异分化过程的作用以及机制.方法 构建过表达Islet-1细胞模型;流式细胞计量术检测转染效率;CCK-8检测细胞增殖;Western blot检测Islet-1、cTnT和p-Akt/TA-kt蛋白表达;RT-qPCR检测心肌早期特异转录因子GA TA4、N xk2.5和Mef2c mRNA表达.结果 随着MK2-206(Akt抑制剂)浓度的增加,细胞增殖抑制率升高(P<0.05),对Akt活性的佳抑制浓度为8nmol L/;随着Islet-1诱导分化时间的延长,感染细胞的p-Akt/T-Akt蛋白表达降低(P<0.05),心肌特异转录因子GATA4、Nkx2.5和Mef2c基因的表达升高(P<0.05);而经MK-2206处理的感染细胞,GAT A4、Nk 2x.5和M fe2 c的复制在第1周时出现明显升高后又逐渐降低(P<0.05).结论 Akt在Islet-1诱导间充质干细胞C3 H10T1/2向心肌细胞特异分化过程中于不同分化阶段发挥着不同的调节作用.
-
大鼠骨髓间充质干细胞体内分化为心肌细胞的相关基因
目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)在体内诱导分化为心肌细胞的过程中相关调控基因的时序表达,揭示MSCs体内分化为心肌细胞的分子调控机制.方法从大鼠骨髓中分离MSCs并传至第8代,用DAPI标记后注射到正常大鼠心肌组织内,分别于细胞移植后1 d、1、2、3、4、6和8周处死大鼠,在注射点获取心肌标本;采用HE染色观察MSCs植人后的形态变化,荧光免疫组化检测心肌特异性蛋白MHC和connexin43的表达;半定量RT-PCR检测TGF-β、Nkx-2.5、GATA-4、MEF-2 C、TEF-1和RARα等相关调控基因的动态时序表达.结果MSCs注入正常心肌组织后可逐渐向心肌细胞转化,从小圆形未分化细胞逐渐转变为与周围宿主组织连接的心肌样细胞;移植1周后出现MHC的表达,移植4周后宿主心肌细胞与移植细胞间出现connexin43的表达,Nkx-2.5和GATA-4基因诱导后1 d表达开始增强,1周时达高峰,以后维持在高水平,TGF-β、MEF-2 C、TEF-1和RARα基因mRNA在诱导前后无明显变化.结论Nkx-2.5和GATA-4基因在MSCs体内转化为心肌细胞的过程中可能发挥重要作用.
-
动员后兔外周血间充质干细胞体外诱导转分化为心肌细胞
目的从动员后的兔外周血中分离间充质干细胞(MSCs),体外诱导转化为心肌细胞,为干细胞移植治疗心肌梗死提供新的无创性的细胞来源.方法给新西兰白兔皮下注射粒细胞集落刺激因子30 μg/(k·d)5 d,从外周血中分离MSCs,经5-氮胞苷作用24 h,进行肌动蛋白、结蛋白及心肌特异性肌钙蛋白T免疫组化鉴定.结果经5-氮胞苷诱导后的MSCs形成梭形多核细胞,2周后,部分细胞聚集成球形细胞团,球形细胞团及部分梭形多核细胞呈肌动蛋白、结蛋白及心肌特异性肌钙蛋白T阳性.结论从动员后的兔外周血中分离获得MSCs,可以在体外诱导成心肌细胞,有望成为移植治疗心肌梗死的新的无创性细胞来源.
-
心肌肽素抑制大鼠心室肌细胞瞬时外向钾电流
目的 研究新药心肌肽素对大鼠心室肌细胞瞬时外向钾电流(Ito)的影响及其在离子通道水平的作用机制.方法 用急性酶解法分离大鼠心室肌细胞,用标准的全细胞膜片钳技术,观察不同浓度的心肌肽素对Ito的影响.结果 心肌肽素呈浓度依赖性抑制大鼠心室肌细胞Ito,心肌肽素浓度(mg/L)为10、50、100、250和500时分别使Ito降低(%)4、13、22、32和38.心肌肽素50 mg/L使Ito电流密度-电压曲线下移,但不改变曲线的形状,也不改变Ito稳态激活曲线.结论 心肌肽素抑制大鼠心室肌细胞Ito,可能是其抗心律失常作用的机制之一.
-
异氟烷减轻人心肌细胞缺氧／复氧损伤的研究
目的：探讨异氟烷对缺氧／复氧（ AR）损伤人心肌细胞的作用及其机制。方法人心肌细胞株HCM分为对照组（con）、AR组和异氟烷（0．5％、1％、1．5％和2％）组（n＝5）。酶标仪检测细胞活力，化学比色法检测LDH活性， Annexin V－FITC／PI双染法检测细胞凋亡，RT－PCR和Western blot检测低氧诱导因子（ HIF）－1α表达水平。结果与对照组比较，AR组细胞活力降低，LDH活性和凋亡细胞升高，HIF－1α表达水平显著上调（P＜0．05）；异氟烷可缓解AR导致的心肌细胞活力降低、LDH活性和凋亡细胞数增加以及HIF－1α表达水平回降（ P＜0．05）。 siRNA转染组HIF－1α表达水平显著低于AR组（ P＜0．05）；2％异氟烷显著缓解siRNA转染组心肌细胞活力的升高，LDH活性和凋亡细胞数的降低（ P＜0．05）。结论异氟烷可通过上调HIF－1α的表达部分减轻AR损伤人心肌细胞。
-
转化生长因子β1对乳鼠心肌细胞转化生长因子结合蛋白2表达的影响
目的 探讨转化生长因子β1 (TGF-β1)在诱导心肌细胞表达转化生长因子结合蛋白2(LTBP2)中的作用及信号传导通路.方法 培养乳鼠心肌细胞；实时定量聚合酶链式反应、蛋白质印迹和免疫细胞化学方法检测不同时间和不同浓度的TGF-β1对大鼠乳鼠心肌细胞LTBP2基因及蛋白表达的影响；用TGF-β1相关信号通路阻断剂探讨TGF-β1调节LTBP2表达改变的信号传导机制.结果 LTBP2基因表达随着TGF-β1浓度增加(0、2、5及10 μg/L)而明显升高,在5μg/L时刺激强(P＜0.05);5μg/L的TGF-β1刺激下心肌细胞内LTBP2基因和蛋白表达的升高呈时间依赖性,均在12 h高,24 h开始呈下降趋势(P＜0.05或P＜0.01)；免疫细胞化学结果显示TGF-β1明显升高LTBP2的表达.信号传导通路研究显示TGF-β1在心肌细胞内主要通过ERK信号通路和PI3K信号通路诱导LTBP2的表达.结论TGF-β1在乳鼠心肌细胞内通过ERK信号通路和PI3K信号通路上调LTBP2的表达.
关键词： 转化生长因子β1 心肌细胞 转化生长因子结合蛋白2 -
人骨髓间充质干细胞在体内外分化为心血管组织
目的 验证人骨髓间充质干细胞(MSC)分化为心血管组织的潜能.方法 用5-氮胞杂苷诱导MSC向心肌细胞分化,用VEGF-B诱导向血管内皮细胞分化.异丙肾上腺素法制成NOD/SCID小鼠心肌损伤模型,经尾静脉注入标记的MSC.免疫荧光法检测MSC的体内、外分化.结果 在体外,经诱导的MSC表达肌凝蛋白重链和肌钙蛋白Ⅰ,表达Ⅷ因子相关抗原和CD31.在体内,标记的MSC表达阳性的肌凝蛋白重链和Ⅷ因子相关抗原.结论 MSC可分化为心肌和血管内皮细胞,是再生医学的理想种子细胞.
-
Akt介导过氧化氢促新生大鼠心肌细胞肥大
目的 探讨Akt在过氧化氢(H2O2)诱导的心肌细胞肥大中的作用.方法 用10 μmol/L或50 μmol/L浓度H2O2:处理原代培养的新生大鼠心肌细胞,以细胞体积和蛋白含量反映心肌细胞肥大程度,观察Akt抑制剂对H2O2致心肌细胞肥大的作用;Western blot检测H2O2对Akt的激活效应.结果 10 μmoL/L或50 μmol/L的H2O2培养心肌细胞48 h后,细胞体积增大和蛋白含量增高;应用Akt抑制剂后减弱了H2O2刺激心肌细胞肥大的效应;H2O2使心肌细胞Akt磷酸化水平增高,磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂Wortmannin和LY294002抑制了H2O2引起的Akt的活化.结论 Akt信号通路可能介导了低浓度H2O2所致的心肌细胞肥大.
-
拟胚体贴壁时间对小鼠胚胎干细胞心肌分化的影响
目的 观察拟胚体(EB)贴壁时间对小鼠胚胎干细胞(ESC)心肌分化的影响并研究其机制.方法 用悬滴培养法促进ESCs形成EBs.EBs在不同的分化天数贴壁,观察搏动EBs百分比,RT-PCR检测Nkx2.5,GATA4和β-MHC mRNA表达,Western blot检测Src家族酪氨酸激酶磷酸化水平.结果 分化第3,4天贴壁组搏动EB百分比及Nkx2.5,GATA4,β-MHC表达水平显著低于分化第5,6和7天贴壁组(P ＜0.05);EB贴壁能够使Src激酶磷酸化水平升高,Src激酶阻断PP2能够抑制贴壁诱发的Src激酶磷酸化水平升高(P＜0.05);对于分化第4天贴壁组,在分化第4～6天使用PP2能够增加搏动EBs百分比及β-MHC表达水平(P＜0.05).结论 EB贴壁时间是影响ESC心肌分化的一个重要因素.在分化第4天或者之前贴壁可以显著抑制心肌分化,其机制可能是EB贴壁激活了Src激酶.
-
PMA体外诱导小鼠多能干细胞向心肌细胞的分化
目的 研究丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)对小鼠诱导多能干细胞体外分化为心肌细胞的影响,以建立一种高效安全的体外诱导iPSC分化为心肌细胞的实验方法.方法 用悬滴法形成拟胚体(EBs),PMA诱导其向心肌细胞定向分化.免疫细胞学标记检测心肌肌钙蛋白T(cTnT)和α横纹肌辅肌动蛋白(α-actinin)的表达;RT-PCR和q-PCR检测Brachyury,cTnT,MLC2a,NKX2.5和GATA4等mRNA的表达.以添加相应DMSO作为对照组,观察各组出现搏动拟胚体的数量,计算分化比率.结果PMA诱导小鼠诱导多能干细胞分化为心肌细胞的佳浓度为100 nmol/L,此时拟胚体搏动率可达53％,显著高于对照组(12％),且PMA诱导产生的心肌细胞表达多种心肌蛋白及基因,具有心肌细胞的结构特征.结论 PMA能够促进miPSC在体外定向分化为心肌样细胞.
-
抑瘤素M促进小鼠诱导多能干细胞向心肌分化
目的 以小鼠诱导多能干细胞(miPSCs)为模型探讨抑瘤素M(OSM)在心肌细胞分化中的作用.方法 用拟胚体分化法,在分化前中期(0~6 d)加入OSM培养分化15 d,实时荧光定量PCR、Western blot与免疫荧光染色法检测心肌细胞特异性标志物.结果 OSM诱导miPSCs分化为心肌细胞的佳浓度为20 pmol/L,此时心肌肌钙蛋白T (cTnT)表达为对照组的7倍(P<0.05);诱导组心肌细胞特异性基因和蛋白全面高于对照组(P<0.05);心肌特异性标志物cTnT染色显阳性,且与对照组相比,诱导组cTnT阳性细胞比率明显增高(P<0.05).结论 抑瘤素M促进了miPSCs向心肌细胞的高效分化,为干细胞的心肌分化提供了一种有效的分化策略.
-
木犀草素预处理减轻H2O2诱导的乳鼠心肌细胞凋亡
目的 探讨木犀草素预处理对H2O2诱导的乳鼠心肌细胞抗凋亡及抗氧化作用.方法 取1～3d乳鼠的心肌细胞,常规培养,分为对照组、模型组、1、10、50、100和200 μmol/L浓度的木犀草素预处理组,预处理2h后,用1 mmol/LH2O2氧化损伤2h,检测各组MTT值,进而选择100 μmol/L浓度的木犀草素作为预处理组.观察不同组别细胞形态学、细胞搏动频率、Hoechest33342-PI双染和Rhodamine 123染色检测MMP,检测培养液中LDH、MDA及SOD活性等.结果与模型组相比,用木犀草素预处理后的心肌细胞活力良好(P＜0.01),形态学及搏动情况良好(P＜0.01),细胞凋亡下降,细胞线粒体损伤程度减少(P＜0.01),SOD活性提高(P＜0.01),LDH及MDA的产生受到抑制(P＜0.01).结论 木犀草素预处理对H2O2诱导的心肌细胞损伤具有一定的保护作用,木犀草素抗凋亡作用可能与其抗氧化作用有关.
-
miR-31及其靶基因LATS2在大鼠肥大心肌细胞中的表达
目的 观察大鼠心肌细胞肥大过程中miR-31及其靶基因LATS2的表达变化.方法 构建双荧光素酶基因报告系统鉴定miR-31对LATS2的靶向作用.体外培养原代大鼠心肌细胞,给予10-6mol/L血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激构建体外心肌细胞肥大模型,RT-qPCR检测miR-31、LATS2及心肌肥大基因ANP与β-MHC表达,心肌细胞F肌动蛋白荧光探针染色观察心肌细胞形态变化,Western blot进一步检测LATS2蛋白表达.结果 miR-31可与LA TS2-3'UTR基因片段特异性结合并使荧光素酶活性显著降低.10-6 mol/L AngⅡ干预48 h后可检测到心肌细胞肥大基因ANP及-MHC表达上调(P＜0.01和P＜0.05),干预96 h后心肌细胞表面积明显增大.伴随心肌细胞的肥大变化,miR-31表达显著上调(P＜0.01),LATS2在基因及蛋白水平均明显下调(P＜0.05).结论 伴随大鼠心肌细胞的肥大变化,miR-31表达显著上调,而LATS2在基因及蛋白水平均明显下调.
-
丙戊酸抑制血管紧张素Ⅱ致大鼠心肌细胞肥大
目的 探讨丙戊酸在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)致心肌细胞肥大过程中的抑制作用.方法 常规方法培养大鼠原代心肌细胞,分为3组:对照组、肥大组、丙戊酸组.利用AngⅡ刺激心肌细胞造成肥大模型,并给予丙戊酸进行干预.反转录聚合酶链反应观察β-肌球蛋白重链(β-MHC)mRNA表达;相差显微镜和电镜观察心肌细胞的表面积和超微结构变化;免疫组织化学法检测C-FOS蛋白的表达.结果 原代心肌细胞在AngⅡ作用下表面积增加,超微结构发生改变β-MHC mRNA和C-FOS蛋白表达增加(P<0.05).给予丙戊酸干预后,上述变化显著缓解(P<0.05).结论 丙戊酸抑制AngⅡ刺激引起的心肌细胞肥大,为临床上治疗心肌肥厚提供一条新的思路.
-
NKx2.5、GATA-4基因表达对骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的影响
观察NKx2.5、GATA-4 基因在骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)分化为心肌细胞过程中表达时序性及表达强度的变化,初步阐明两基因对MSCs分化为心肌细胞的影响.以MSCs植入后的Wistar大鼠为研究对象,在移植后不同的时间点取心肌标本,采用逆转录聚合酶链反应技术,提取心肌组织的总RNA,逆转录,加入特异性引物扩增目的基因,观察基因表达的时序性,并应用凝胶图像分析系统检测这两个基因表达强度的动态变化.显示在MSCs移植后1 d两个基因即出现弱的表达,1 d～1周表达较低,2周～3周表达强度高,达到高峰期,以后表达强度则逐渐降低.NKx2.5、GATA-4在MSCs转化为心肌细胞的早期发挥重要的作用.
-
葛根素预处理对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响
目的观察葛根素(Pur)预处理对缺血再灌注(I/R)心肌细胞凋亡的干预作用,并探讨其作用的可能机理.方法将原代培养的新生大鼠心肌细胞随机分为(1)正常对照组及正常+Pur组;(2)模拟缺血组及缺血+Pur组;(3)模拟再灌注组及再灌注+Pur 组.末端标记法( TUNEL法)检测心肌细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞凋亡百分率,透射电镜观察心肌细胞凋亡的形态学特征、免疫组织化学法检测Bcl-2/Bax蛋白表达,并检测胞内Ca2+浓度.结果 (1)心肌细胞I/R后电镜观察到典型的凋亡超微结构特征;TUNEL染色可见心肌细胞凋亡阳性反应;免疫组化检测发现Bcl-2蛋白表达下调,Bax蛋白表达上调;胞内明显 Ca2+超载.(2)葛根素可显著降低I/R心肌细胞内Ca2+浓度、降低凋亡指数和凋亡百分率、上调Bcl-2蛋白表达、下调Bax蛋白表达.结论葛根素具有抗心肌细胞凋亡的作用,其机理可能与抑制胞内Ca2+超载,干预Bcl-2/Bax蛋白表达有关.
-
硝普钠及SOD降低大鼠心肌细胞DNA蛋白激酶二聚体和Ku70／80表达
目的：观察硝普钠（SNP）及自由基清除剂超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）对大鼠心肌细胞H9C2和心肌组织DNA-PKcs和Ku70／80表达的影响。方法体外培养H9C2心肌细胞按SNP浓度和加入的自由基清除剂SOD和CAT浓度分组；SD大鼠随机分为5组，每组8只，分别采用0.9％氯化钠溶液、SNP、SNP＋SOD、SNP＋CAT和SNP＋SOD＋CAT行腹腔注射，1周后收集心肌组织。用Western blot 法检测各组细胞DNA-PKcs和Ku70／80表达，免疫组织化学法检测DNA-PKcs和Ku70／80表达。结果心肌细胞的DNA-PKcs和Ku70／80蛋白相对表达量均随SNP剂量增加呈递增趋势；加入SOD或CAT或二者合用，均显著降低DNA-PKcs和Ku70／80表达（ P＜0.05）。 SNP组、SNP＋SOD组、SNP＋CAT组和SNP＋SOD＋CAT组大鼠心肌组织DNA-PKcs和Ku70／80表达水平均显著高于对照组（ P＜0.05）。结论自由基清除剂SOD和CAT能够通过降低心肌细胞DNA-PKcs和Ku70／80的表达拮抗NO对心肌细胞的损伤。
-
活性氧在大鼠心肌细胞低氧预适应中的作用
目的探讨活性氧在心肌细胞低氧预适应过程中的作用机制.方法建立SD乳鼠心肌细胞的低氧预适应模型;检测不同阶段超氧阴离子和H2O2含量以及T-SOD、Cu, Zn-SOD和Mn-SOD活性变化,分析活性氧在低氧预适应不同窗口期的作用.结果 (1)超氧阴离子和过氧化氢均能明显提高心肌细胞在第一窗口期低氧1 h后的存活率(P＜0.05);(2)超氧阴离子可明显升高心肌细胞第二窗口期低氧1 h后的存活率(P＜0.05),而过氧化氢作用不明显;(3)低氧预适应可使超氧阴离子和过氧化氢含量明显升高,同时伴有第一窗口期Cu、Zn-SOD活性及第二窗口期Mn-SOD活性显著升高(P＜0.05).结论说明低氧预适应可提高大鼠心肌细胞在不同窗口期对长时间缺氧的耐受性,其作用机制可能与活性氧及SOD有密切关系.
