PMA体外诱导小鼠多能干细胞向心肌细胞的分化
摘要: 目的 研究丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)对小鼠诱导多能干细胞体外分化为心肌细胞的影响,以建立一种高效安全的体外诱导iPSC分化为心肌细胞的实验方法.方法 用悬滴法形成拟胚体(EBs),PMA诱导其向心肌细胞定向分化.免疫细胞学标记检测心肌肌钙蛋白T(cTnT)和α横纹肌辅肌动蛋白(α-actinin)的表达;RT-PCR和q-PCR检测Brachyury,cTnT,MLC2a,NKX2.5和GATA4等mRNA的表达.以添加相应DMSO作为对照组,观察各组出现搏动拟胚体的数量,计算分化比率.结果PMA诱导小鼠诱导多能干细胞分化为心肌细胞的佳浓度为100 nmol/L,此时拟胚体搏动率可达53%,显著高于对照组(12%),且PMA诱导产生的心肌细胞表达多种心肌蛋白及基因,具有心肌细胞的结构特征.结论 PMA能够促进miPSC在体外定向分化为心肌样细胞.
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磷酸化P27kip1的表达与非霍奇金淋巴瘤的恶性相关
目的 探讨P27kip10位丝氨酸(Ser10)和187位苏氨酸(Thr187)磷酸化形式的蛋白质表达水平与非霍奇金淋巴瘤(NHL)恶性程度的关系.方法 采用免疫组织化学方法检测88例NHL及15例良性增生淋巴结中Ser10、Thr187磷酸化P27kip1和P27kip1蛋白的表达,结合临床及病理资料进行统计分析.结果 两种磷酸化位点的P27kip1蛋白在良性增生淋巴结(不包括生发中心)中的阳性率明显低于NHL,随着肿瘤侵袭性的增加,两种磷酸化位点的P27kip1蛋白表达水平增高,与增殖指标Ki-67呈正相关.Thrl87磷酸化P27kiP1蛋白的阳性率与P27kip蛋白表达水平呈正相关,Ser10磷酸化P27kip1蛋白的阳性率与P27kip1蛋白表达水平表现为负相关.结论 磷酸化的P27kip1与NHL的恶性程度有关,联合检测磷酸化P27kip1与P27kip1蛋白的表达水平可为NHL的临床诊断和治疗提供参考.
关键词: 磷酸化P27kiP1 淋巴瘤 -
视神经切断联合高眼压增高大鼠视网膜内P75NTR和Sortilin的蛋白表达水平
目的 观察视神经切断联合高眼压状态下,视网膜内p75NTR和Sortilin蛋白表达水平的变化.方法 60只健康雄性Wistar大鼠,随机分为对照(control,n=6)、假手术(sham,n=6)、单纯视神经切断(NT,n=24)和视神经切断联合高眼压(NP,n=24)4组.NT和NP模型组,进一步分为术后第1、3、7和14天组(均n=6).用Western blot法,检测各组大鼠视网膜内P75NTR和Sortilin蛋白表达.结果 NP组大鼠视网膜内,P75NTR及Sortilin蛋白表达量在术后第3、7和14天明显高于对照组、假手术组及单纯视神经切断组(P<0.05).结论 高眼压可使大鼠视网膜内RGC本身合成的Sortilin和P75NTR蛋白量增高,60/50 ku的P75NTR及90 ku成熟Sortilin蛋白可能参与了高眼压所致大鼠视网膜神经节细胞的损伤.
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病毒感染后表达下调的RNF167抑制小鼠腹腔巨噬细胞产生IFN-β
目的 探讨RNF167对病毒感染的小鼠腹腔巨噬细胞产生IFN-β的调控作用.方法 RNA病毒VSV和DNA病毒HSV-1感染小鼠腹腔巨噬细胞后,Western blot检测RNF167的表达水平.利用RNA干扰减少小鼠原代腹腔巨噬细胞中RNF167的表达后,病毒感染小鼠腹腔巨噬细胞,实时荧光定量PCR法检测IFN-β的mRNA水平,ELIAS法检测细胞上清中IFN-β的浓度.Western blot法检测IFN-β的转录因子IRF3的磷酸化(p-IRF3)水平.结果 VSV感染巨噬细胞4和8h后,RNF167表达水平显著下降(P<0.01),而HSV-1感染后RNF167的表达没有显著变化.si-RNF167降低小鼠腹腔巨噬细胞RNF167表达水平后,与对照细胞相比,感染RNA病毒后细胞中IFN-β的mRNA水平及上清中IFN-β水平显著下降(P<0.01),p-IRF3水平也显著下降.而感染HSV-1病毒后上述指标均无差异.结论 RNF167能够特异性地调控RNA病毒感染的巨噬细胞中IFN-β的表达.
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胆汁中胆固醇升高通过影响CCK-1R再分布抑制胆囊收缩
目的 分析胆汁总胆固醇含量与胆囊收缩功能的关系,并探讨其可能的机制.方法 从2013年3月至2014年1月收集73例在北京协和医院基本外科行胆系手术的胆囊结石患者(结石组)和非胆囊结石患者(非结石组)胆汁,测定胆汁中总胆固醇(TC)和总胆汁酸(TBA)含量.对胆囊结石患者术前行胆囊功能试验.用免疫组化方法测定胆囊黏膜和肌层中Ⅰ型胆囊收缩素受体(CCK-1R)和细胞膜结构蛋白小窝蛋白-3(Cav-3)的表达.用免疫荧光法定位二者在胆囊黏膜和肌层中的共表达.结果 胆囊结石患者胆汁中TC及TBA含量显著高于非结石患者(P<0.05).胆囊收缩功能较差的患者胆汁中TC含量明显高于收缩功能较好的患者(P<0.05).结石组胆囊黏膜中Cav-3的表达量明显高于非结石组(P<0.05).在结石组中CCK-1R和Car-3在胆囊黏膜和肌层中均有明显共表达,而在非结石组则无明显的共表达现象.结论 胆汁中TC含量升高可抑制胆囊收缩功能,其机制与胆囊黏膜和肌层中过多的C av-3和CCK-1R结合进而影响CCK功能有关.
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犬同种带瓣主、肺动脉移植后受体细胞替换的定量研究
目的定量检测同种带瓣主、肺动脉(conduit valved homograft, CVH)移植后受体细胞替换供体细胞的比例,探讨其对CVH耐久性、免疫原性的作用.方法①建立液氮冻存和4 ℃保存犬CVH移植于同种异性受体犬腹主动脉之实验模型.②采用组织DNA提取、定量PCR技术检测CVH中供、受体细胞所占比例.③免疫组化法检测CVH中碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2),结合透射电镜和扫描电镜观察,反映CVH移植后的组织活性.结果①CVH移植后存在受体细胞替换供体组织的过程,长入CVH的受体细胞主要是成纤维细胞及内皮细胞.②具有正常结构和功能的受体细胞长入CVH对于CVH术后长期结构和功能的保持具有重要作用.③受体细胞进行性地替换 CVH细胞,使供体细胞在 CVH组织中所占比例逐渐减少;加之受体内皮细胞长入并覆盖CVH内膜,起"封闭抗原"作用.结论犬CVH移植后受体细胞替换导致CVH的免疫原性下降、免疫性损伤减轻,从而延长其耐久性.
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Anchor Attachment蛋白在结直肠癌中表达增强
目的 探讨Anchor Attachment蛋白(AAP)的表达与结直肠癌浸润、转移的关系及临床意义.方法 免疫组织化学法检测AAP的表达,分析AAP表达水平与肿瘤临床病理特征之间的关系;并用酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清中AAP表达水平.结果 结直肠正常肠黏膜、癌原发灶、淋巴结和肝转移灶中AAP的表达阳性率分别为20.5%、53.0%、69.8%和80.0%;癌原发灶、转移淋巴结和肝转移灶中AAP表达阳性率均显著高于正常肠黏膜组织(P<0.01),转移淋巴结和肝转移灶中AAP阳性率高于癌原发灶(P<0.05);淋巴结转移患者和肝转移患者的原发灶AAP阳性率显著高于无转移者(P<0.01);Dukes分期A、B、C、D期患者AAP阳性率逐渐增高,各分期之间差异显著(P<0.01).83例结直肠癌患者血清从P水平为(6.3±2.8)μg/L,显著高于30例健康志愿者的(2.2±0.9)μg/L,(t=6.976,P<0.01);Dukes分期A、B期患者血清AAP水平为(5.2±2.6)μg/L,显著低于C、D期患者的(7.1±2.9)μg/L(P<0.05).结论 检测外周静脉血AAP水平对预测和判断结直肠癌病情和肝转移有重要意义.
关键词: 结直肠肿瘤 Anchor Attachment蛋白 肿瘤浸润 转移 -
JAK/STAT通路调节IL-4诱导的肝星状细胞系LX-2Ⅰ型胶原基因的表达
目的 探讨JAK/STAT通路在IL-4对肝星状细胞(HSC)中Ⅰ型胶原基因表达的影响及其作用机制.方法 用RT-PCR法和ELISA法分别检测不同浓度IL-4对人肝星状细胞系LX-2中Ⅰ型胶原mRNA表达和蛋白合成的影响;用Western blot法和RT-PCR法分别观察JAK1抑制剂AG490对IL-4诱导的JAK1磷酸化以及I型胶原mRNA表达的影响;用Western blot法和RT-PCR法分别观察LX-2转染STAT6-ASON对IL-4诱导的STAT6磷酸化以及Ⅰ型胶原mRNA表达的影响.结果 IL-4诱导LX-2中Ⅰ型胶原mRNA表达及其蛋白的合成,呈剂量依赖性效应,且IL-4浓度为50 μg/L时,胶原mRNA和蛋白水平均开始出现显著差异(P<0.001);与空白对照组相比,JAK1和STAT6磷酸化水平分别约为4.8倍和4.0倍,Ⅰ型胶原mRNA表达则分别为4.0倍和5.2倍;而AG490和LX-2转染STAT6-ASON则可以分别阻断IL-4诱导的JAK1磷酸化和STAT6磷酸化以及相应的I型胶原mRNA的表达.结论 JAK/STAT信号传导通路参与调节IL-4诱导HSC中I型胶原基因表达,并在肝纤维化发生过程中发挥重要的作用.
关键词: IL-4 肝星状细胞 JAK/STAT信号传导通路 Ⅰ型胶原 -
HGF及G-CSF诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞
目的 探讨肝细胞生长因子(HGF)以及粒细胞集落刺激因子(G-CSF)可否诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)分化为肝样细胞.方法 以贴壁法分离、培养大鼠BM-MSCs,流式细胞术鉴定表面标志.实验分为:对照组(10% FBS),0.1μmol/L G-CSF干预组,20 ng/mL HGF干预组,HGF联合G-CSF共同干预组(0.1μmol/LG-CSF+ 20 ng/mL HGF),诱导后第7天、14天和21天提取细胞总RNA以及总蛋白后进行RT-PCR和Western blot检测白蛋白(ALB)和甲胎蛋白(AFP)基因mRNA转录和蛋白水平.结果 20 ng/mL HGF干预组和HGF联合G-CSF共同干预组P3代BM-MSCs诱导后细胞形态似肝样细胞.BM-MSCs表面标志物:CD34-PE 0.3%,CD45-FITC0.1%,CD90-FITC 99.6%,CD105-PE 99.8%.20 ng/mL HGF干预组和HGF联合G-CSF共同干预组检测到白蛋白(ALB)和甲胎蛋白(AFP)基因mRNA转录水平及蛋白水平表达.在第7、14、21天,随时间增加ALB表达量递增、而AFP表达量递减,且同一时间两组表达量均有差异(P<0.05).结论 HGF能诱导大鼠BM-MSCs分化为肝样细胞,G-CSF对HGF诱导大鼠BM-MSCs分化为肝样细胞有协同作用.
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解除狭窄联合Rho激酶抑制剂对颈动脉狭窄大鼠认知功能的影响
目的 观察解除狭窄联合Rho激酶抑制剂对重度颈动脉狭窄大鼠认知功能(VCI)、海马区细胞凋亡及相关基因表达.方法 用48只SD大鼠,复制重度颈动脉狭窄模型,分成假手术组、狭窄解除组、药物组和联合组,另12只为对照组.联合组给予狭窄解除和法舒地尔(8.35 mg/kg),药物组注射等量的法舒地尔,狭窄解除组给予解除狭窄,对照组注射等容积的0.9%氯化钠注射液.分别在干预2和4周后,Morris水迷宫实验检测大鼠的空间学习记忆能力;免疫组化方法检测海马区凋亡相关蛋白BCL-2及BAX免疫阳性细胞数;TUNEL染色法检测海马区凋亡神经细胞.结果 与单纯药物组和狭窄解除组比较,联合治疗组大鼠的逃避潜伏期和游泳距离百分比均有显著改善(P<0.05),海马区凋亡相关蛋白BCL-2免疫阳性细胞数显著增加(P<0.05),而BAX的免疫阳性细胞数显著降低(P<0.05),且治疗4周比2周更明显(P<0.05);联合治疗组大鼠海马区的神经细胞凋亡率为56.24%±2.25%,明显低于药物治疗组和狭窄解除组的63.86% ±2.23%和61.89%±2.67%(P <0.05),且随着治疗时间延长,细胞凋亡率呈下降趋势.结论 解除颈动脉狭窄联合Rho激酶抑制剂可通过调节凋亡相关蛋白的表达而明显改善颈动脉狭窄引起的认知功能障碍.
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新疆3个HCM家系MYH7基因突变DHPLC检测和DNA测序结果分析
目的 研究家族性肥厚型心肌病(HCM)的主要致病基因β肌球蛋白重链,MYH7突变情况.方法 用变性高效液相色谱DHPLC检测和DNA测序方法对3个HCM家系成员的MYH7基因8、14外显子及附近上下游序列进行检测分析.结果 3个家系其中1个家系发现MYH7基因14外显子中存在Thr441Met突变,该突变在中国人中是首次发现,此外外显子8也存在1个点突变.另外两个家系也发现有不同位点的突变.结论 运用变性高效液相色谱技术和DNA直接测序技术能实现对家族性肥厚型心肌病MYH7基因突变的筛查,有利于早期诊断、患病风险预测.