首页 > 文献资料
-
基于玄府理论探索汗法与补法治疗局灶节段硬化大鼠足细胞损伤的TRPC机制
目的:研究汗法与补法治疗嘌呤霉素氨基核苷(PAN)诱导的局灶节段硬化性肾病(FSGS)大鼠足细胞损伤的疗效及机制.方法:40只雄性Wistar大鼠按体质量随机分为正常组、模型组、越婢汤组、固精方组.首剂静脉注射PAN 9mg/100g,后分别于第13、16、19、22、25天追加PAN 0.9mg/100g建立FSGS大鼠模型,8周后留取尿液、血液及肾组织标本.检测血生化指标,尿蛋白排泄,Real-time PCR、Western blotting、免疫荧光观察TRPC5、TRPC6表达与分布,激光共聚焦显微镜观察足细胞骨架蛋白F-actin,光镜观察肾小球病理改变,透射电镜观察足细胞超微结构.结果:模型组大鼠出现肾小球局灶节段硬化,TRPC5、TRPC6表达显著上调,F-actin表达减少,电镜广泛足突融合.与模型组比较,越婢汤与固精方组血清白蛋白水平升高(P＜0.05),固精方组尿蛋白排泄减少(P＜0.05),固精方组TRPC5、TRPC6蛋白、mRNA及免疫荧光表达下调(P＜0.05,P＜0.01),F-actin表达增加(P＜0.05);越婢汤组TRPC5蛋白、mRNA及免疫荧光表达下调(P＜0.05,P＜0.01),TRPC6 mRNA及免疫荧光表达下调(P,＜0.01),两组足突融合较模型组减轻.结论:越婢汤、固精方可能通过调控TRPC5及TRPC6减轻足细胞损伤,发挥FSGS治疗作用.
-
越婢汤和固精方对嘌呤霉素氨基核苷肾病大鼠肾小球足细胞损伤的影响
目的 探讨发汗解表法(越婢汤)与补肾固精法(固精方)治疗肾病综合征的疗效及可能机制.方法 40只Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、越婢汤组、固精方组,每组10只.除正常组外其余各组大鼠采用单次尾静脉注射嘌呤霉素氨基核苷9 mg/100 g建立肾小球足细胞损伤大鼠模型.造模后第2天开始越婢汤组每天灌胃给予含生药越婢汤2.1 g/100g,固精方组每天给予含生药固精方7.5 g/100g,正常组及模型组灌胃等体积蒸馏水,连续2周.检测各组大鼠血清肌酐、尿素氮、尿酸、白蛋白、总胆固醇、甘油三酯,尿蛋白定量和尿肌酐,肾组织TRPC5、TRPC6蛋白及mRNA表达,观察肾小球病理改变及足细胞超微结构.结果 与正常组比较,模型组大鼠尿素氮、尿酸、总胆固醇、甘油三酯上升,血清白蛋白水平降低,尿蛋白肌酐比增加,肾组织TRPC5、TRPC6蛋白及mRNA表达均升高(P＜0.05).与模型组比较,越婢汤及固精方组血清尿素氮、尿酸、总胆固醇、甘油三酯、尿蛋白肌酐比下降,白蛋白上升,肾组织TRPC5、TRPC6 mRNA亦降低(P＜0.05).越婢汤组血清白蛋白、尿酸水平、肾组织TRPC5 mRNA表达低于固精方组,而TRPC6 mRNA高于固精方组(P＜0.05). 结论 越婢汤、固精方可能通过调控肾组织TRPC5及TRPC6表达,减轻足细胞损伤,从而改善肾病综合征的低蛋白、高血脂表现.
-
嘌呤霉素氨基核苷大鼠模型的研究进展
嘌呤霉素氨基核苷(puromycin aminonucleoside,PAN)是研究微小病变型肾病(minimal-change nephropathy syndrome,MCNS)和局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomeruloscleorosis, FSGS)的理想动物模型,但所用剂量、给药途径的不同可使诱发的肾病有所区别.
-
嘌呤霉素氨基核苷肾病大鼠模型的病理机制研究进展
嘌呤霉素氨基核苷(puromycin aminonucleoside,PAN)大鼠模型是研究微小病变肾病(minimal change nephrotic syndrome,MCNS)和局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis,FSGS)病理损害的理想实验动物模型,该模型主要的临床特征为大量蛋白尿.对于PAN导致肾脏损害的机制目前尚不十分清楚,然而,人们通过细胞培养和动物实验对其发生发展机制进行不断的深入研究,也取得了可喜的成果.本文对PAN模型肾病导致MCNS大量蛋白尿和FSGS的机制研究进展综述如下.
-
甘西鼠尾草总酚酸提取物对嘌呤霉素氨基核苷诱导损伤的足细胞中Toll样受体4表达的影响
目的:探讨SPE及其单体对嘌呤霉素氨基核苷(PAN)诱导的损伤足细胞中Toll样受体4(TLR4)通路表达的影响.方法:足细胞与含有甘西鼠尾草总酚酸提取物(SPE)、迷迭香酸(RA)、丹酚酸B(SalB)、RA+ SalB混合及他克莫司的完全培养液预先孵育30 min,再加入PAN(100 μg/ml)继续作用24h,观察足细胞骨架结构F-actin变化,western blot及半定量RT-PCR检测足细胞中TLR4、myd88、phosphor-NF-κB (pp65)在蛋白及mRNA水平的表达量变化.结果:(1)PAN作用24h后,足细胞骨架蛋白F-actin明显损伤,微丝解聚、胞体回缩,少数细胞尚存排列紊乱的丝状结构,而提前给予保护药物SPE、SalB、RA、SalB+ RA混合药物及他克莫司组的足细胞损伤明显减弱.(2)western blot数据显示,PAN诱导的损伤足细胞中TLR4、myd88及pp65蛋白的表达与正常组相比均有明显上调(P＜0.05);保护药物组:TLR4蛋白表达较模型组有明显下降(P＜0.05);MyD88蛋白表达除SalB高剂量组及SalB+ RA低剂量组较模型组无显著下降外,其余均能明显下调其表达量(P＜0.05);pp65在保护药物组中的表达均较模型对照组低(P＜0.05).(3)半定量RT-PCR结果显示,模型对照组中TLR4、MyD88及NF-κB的mRNA表达量明显高于正常对照组;保护药物组中:TLR4 mRNA表达量在各药物处理组中均明显低于PAN组(P＜0.05),其中的SPE高、低剂量组,RA高、低剂量组,SalB+ RA高剂量组与正常组相接近(P＞0.05);MyD88 mRNA表达量在SPE及其单体处理后均有明显下调(P＜0.05);NF-κB mRNA表达量除SalB高剂量组中无明显下调外(P＞0.05),其余各保护药物组均下调(P＜0.05).结论:SPE及其活性单体对PAN诱导损伤足细胞的保护作用机制可能部分通过抑制TLR4信号相关蛋白表达来实现;甘西鼠尾草总酚酸提取物中的单体迷迭香酸对TLR4及其下游信号分子MyD88、NF-κB的抑制作用优于丹酚酸B和混合给药组.
-
益肾活血方对嘌呤霉素氨基核苷诱导的大鼠肾病综合征的治疗作用及其机理研究
目的:探讨益肾活血方对嘌呤霉素氨基核苷(PAN)诱导的大鼠肾病综合征的治疗作用及其作用机制.方法:Wistar大鼠随机分为假手术组、PAN模型组、益肾活血方高剂量组(YHF-H)、益肾活血方中剂量组(YHF-M)、益肾活血方低剂量组(YHF-L)、蒙诺治疗组(FP).采用颈静脉注射结合尾静脉加强注射PAN的方法制作肾病模型.PAN首次注射后第5、10、15、20、25和30天测定24 h尿蛋白定量;31 d后处死动物,做血清总蛋白、血清白蛋白、总胆固醇、三酰甘油、血清尿素氮、血清肌酐等血生化学检查、肾脏组织光学显微镜和电子显微镜检查以及逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析各组大鼠肾脏骨形态蛋白及其基因表达的情况.结果:益肾活血方能有效抑制由PAN所诱导的尿蛋白排泄增高、血清蛋白降低和血脂升高,减轻肾小管间质病变、抑制BMPRⅡ和Smad1在肾组织内的表达.结论:益肾活血方对PAN诱导的大鼠肾病综合征有治疗作用,其机制可能与调节骨形态蛋白表达有关.
-
嘌呤霉素氨基核苷诱发肾病综合征大鼠模型的改良制作研究
目的:在嘌呤霉素氨基核苷模型经典制作方法的基础上进行多次尾静脉追加,制作更适合慢性肾脏病药理学研究的实验性大鼠模型.方法:wistar大鼠42只,6周龄,雄性,随机分为对照组、颈静脉给药组和追加给药组,每组14只,各组分别于造模后第30天和第56天处死动物.颈静脉给药组行颈静脉插管术缓慢推注嘌呤霉素氨基核苷(40 mg/kg),追加给药组在颈静脉给药(40 mg/kg)后第13、16、19天再进行3次小剂量尾静脉追加(5 mg/kg).对照组给等容积0.9%生理盐水.造模后第5、10、15、20、28、42、56天时检测24 h尿蛋白.实验结束时对比两组模型的肾脏组织病理改变和血清总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、三酰甘油(TG)、胆固醇(TC)、肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)水平.结果:颈静脉给药组在造模后第5天出现蛋白尿,10 d左右尿蛋白达到高峰(均值264.1 mg/24 h),随后尿蛋白急剧下降,约在第20天降至接近正常水平.追加给药组尿蛋白出现一个持续增高的平台期(均值维持在略高于150 mg/24 h的水平),末次追加后约10 d(颈静脉给药后第28天)开始缓慢下降,于第56天时接近正常.光镜所见:在30 d和56 d时,追加给药组大鼠的肾小球局灶节段性硬化和间质纤维化、炎性浸润等组织病理学指标较颈静脉给药组改变显著,其中两组之间间质纤维化的差异有统计学意义(P<0.05).第30天血清生化结果显示,追加给药组大鼠TC、TC(P<0.05)、Scr(P<0.05)升高较明显,而颈静脉给药组变化则不明显.结论:对嘌呤霉素氨基核苷经典模型进行多次小剂量尾静脉追加,可以造成大鼠慢性肾脏病变.改良后的模型能够节约研究时限和研究成本,更适用于开展慢性肾脏病药理学研究.
-
雷帕霉素激活自噬改善嘌呤霉素氨基核苷诱导的足细胞损伤
目的:通过观察雷帕霉素对PAN诱导的足细胞损伤及自噬相关蛋白表达的影响,探讨自噬在雷帕霉素保护PAN诱导的足细胞损伤中的作用及可能机制.方法:构建PAN诱导的足细胞损伤模型,将足细胞分成对照组(Control组), PAN组(加入50 μg/ml PAN),雷帕霉素组(RAP组:分别加入100、200、300 ng/ml雷帕霉素),PAN+雷帕霉素组(PAN+RAP组:细胞在用含PAN的培养液培养前1 h,分别用100、200、300 ng/ml雷帕霉素进行预处理1 h).采用Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡,透射电镜观察自噬小体,Western blot检测LC3、p62、4EBP1、P70S6K、mTOR蛋白表达.结果:与对照组比较,PAN组足细胞凋亡增加,自噬体减少,LC3Ⅱ蛋白表达下调,p62上调,mTOR、4EBP1、P70S6K 磷酸化水平上调;与PAN组比较, PAN+RAP组足细胞凋亡率下降,自噬体增加,LC3Ⅱ蛋白表达上调,p62下调,mTOR、4EBP1、P70S6K 磷酸化水平下调.结论:PAN可以抑制足细胞自噬,促进足细胞凋亡;雷帕霉素可通过激活自噬改善PAN诱导的足细胞损伤,这种作用可能与雷帕霉素抑制mTOR/4EBP1、P70S6K信号通路有关.
-
大鼠嘌呤霉素氨基核苷肾炎模型的制作
以嘌呤霉素氨基核苷(puromycin aminonucleoside,PAN)制作肾病的实验性大鼠模型已有四十多年的历史.因其发病时临床表现和病理变化过程与人类MCNS(Minimal changenephritic syndrom)及FGS(focal glomerular sclerosis,FGS)相似.
-
泼尼松龙新型靶向脂质体制剂对嘌呤霉素氨基核苷肾病的疗效
目的:观察肾小球向性泼尼松龙新型靶向脂质体制剂对嘌呤霉素氨基核苷性肾病的治疗作用.方法:选用雄性Wistar大鼠,按照嘌呤霉素氨基核苷(puromycin amino neucleoside,PAN)4.0 mg/100g体重的剂量建立大鼠PAN模型,以泼尼松龙(prednisolone,PRED)2mg/100g体重及泼尼松龙新型靶向脂质体制剂(1ipo-some-prednisolone,Lipo-PRED)1.5mg/100g体重的剂量进行治疗,观察尿蛋白的排出量、肾组织白细胞浸润等.结果:泼尼松龙新型靶向脂质体制剂治疗组尿蛋白排泄量显著性降低,肾组织中白细胞浸润减少,其作用优于泼尼松龙治疗组结论:泼尼松龙新型靶向脂质体制剂可显著性抑制PAN模型的尿蛋白排泄量和急性期肾间质白细胞浸润.
-
甘西鼠尾草总酚酸提取物抗嘌呤霉素氨基核苷诱导的足细胞氧化应激损伤
目的 研究甘西鼠尾草总酚酸提取物(SPE)在体内和体外对嘌呤霉素氨基核苷(PAN)肾病大鼠足细胞以及PAN诱导小鼠足细胞氧化应激损伤的作用.方法 (1)建立PAN肾病大鼠动物模型,给予SPE和他克莫司干预,分别在第5、10、15、21天留取肾组织标本,WT1染色计数足细胞数目,免疫荧光观察8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)荧光强度.(2)体外采用PAN致足细胞损伤模型,PAN作用小鼠足细胞24 h,分别加入含SPE、丹酚酸B(SalB)、迷迭香酸(RA)及他克莫司的培养基培养6、12、24、48 h,观察足细胞骨架相关蛋白F-actin的表达,流式细胞仪分析细胞内活性氧(ROS)荧光强度.结果 (1)肾小球WT1细胞计数结果显示,PAN组第5天时足细胞数已开始下降,第15天达(14.4±0.7)个/肾小球切面,较正常组(37.2士1.5)个/肾小球切面减少(P＜0.05),SPE组与阳性对照组(他克莫司组)各时间点足细胞数量高于PAN组;第15天时,阳性对照组肾小球WT1细胞计数与SPE高剂量组较为接近(P＞0.05).第5天时PAN组大鼠肾组织8-OHdG荧光强度较正常组增强,第10天上升至高峰,而后开始减弱,第15天时仍高于正常组;给予药物干预后,大鼠肾组织的8-OHdG荧光强度降低,其中阳性对照组与SPE高剂量组8-OHdG荧光强度较为接近.(2)体外研究发现,PAN作用24 h后,F-actin几乎完全解聚,少数细胞尚有残存的被切断的丝状结构,给予SPE、SalB、RA及他克莫司治疗后,PAN诱导的足细胞损伤明显减弱,细胞内重新出现极性分布的微丝.与正常组相比,PAN作用小鼠足细胞24 h后ROS荧光强度增加(P＜0.05).给予药物干预后足细胞内ROS荧光强度降低,24 h SPE低剂量组、SalB高剂量组和RA高剂量组与阳性对照组足细胞内ROS的荧光强度降低程度相近(P＞0.05),24 h SalB降低足细胞内ROS荧光强度效果优于RA,且与药物剂量呈正相关.结论 本研究从体内及体外证实,SPE对PAN所致足细胞氧化应激损伤具有保护作用.
-
肾上腺髓质肽在大鼠足细胞损伤模型中调控肾小球壁层上皮细胞分化
目的 探讨肾上腺髓质肽(adrenomedullin,AM)是否通过调控肾小球壁层上皮细胞(parietal epithelial cells,PECs)分化参与对大鼠足细胞损伤模型的保护作用及可能的分子机制.方法 雄性SD大鼠经一次性腹腔注射嘌呤霉素氨基核苷(puromycinaminonucleosidc,PAN) (15 mg/100g体重)建立足细胞损伤模型,随机分为模型组和治疗组,治疗组每天经尾静脉注射AM蛋白质(6.6μg/100g体重).分别在首次注射PAN后7、14和21天,观察大鼠尿蛋白水平及肾组织形态改变,并经免疫组化染色、双重或三重免疫荧光染色,检测足细胞数量、肾小球AM的表达、PECs分化以及Notch3表达变化.结果 大鼠PAN肾病模型表现为大量蛋白尿、肾小球节段性损伤、足细胞计数显著减少.AM/claudin 1双重荧光染色显示PECs中AM表达显著增强且出现于毛细血管袢内.AM治疗可改善大鼠尿蛋白及肾组织形态,减少足细胞丢失,14天时显著增加共表达PECs(claudin-1)及足细胞特异性标志蛋白(WT 1和synaptopodin)的细胞数.Ki67与claudin 1共定位表达于PECs,但未与WT 1共表达.AM显著抑制由PAN所致的Notch3表达.结论 在大鼠PAN足细胞损伤模型中,PECs中AM表达上调提示机体的一种代偿性保护机制,AM可能通过下调Notch3信号通路而促进PECs分化,参与其促进损伤后修复的作用.
-
单次静脉注射嘌呤霉素氨基核苷所致大鼠肾病模型的优化及评价
目的明确大鼠嘌呤霉素氨基核苷(puromycin aminonucleoside,PAN)肾病模型的适宜条件和病程演变,为该模型更好地用于肾病综合征、肾硬化发病机制及治疗的研究奠定基础.方法用6周龄雄性Wistar大鼠,一次性颈静脉注射PAN,分别以2、3、4、5、7、9 mg/100 g体重的剂量给药,以等量生理盐水作对照,测定2周内不同时间点的尿蛋白排泄量;另以9 mg/100 g体重的剂量给药,观察28周内尿蛋白、血清胆固醇和三酰甘油的变化及肾组织的病理改变.结果各个剂量的PAN均可引起不同程度的蛋白尿,约在10～14 d达到高峰,高达(592.0±61.0)mg/24 h.28周连续观察的结果显示,PAN组动物的尿蛋白呈现典型的双相曲线,即第2周达到高峰,伴有血清胆固醇及三酰甘油的升高,此后逐渐降至接近正常,但自第12周起尿蛋白再度逐渐上升,第28周可达急性期峰值的一半.结论6周龄雄性Wistar大鼠,一次性颈静脉注射适量PAN可建立不同程度的肾病模型,成功率极高,方法简单,用药量省,动物价廉易得,且急性期发病快而周期短,不失为研究人类相应疾病的良好模型.
关键词： 嘌呤霉素氨基核苷 肾病综合征 局灶性节段性肾小球硬化 大鼠 -
全反式维甲酸对大鼠嘌呤霉素氨基核苷肾病蛋白尿的抑制作用
近年来,全反式维甲酸(全反式视黄酸,all-trans retinoic acid,ATRA)用于某些实验性增生性肾炎的治疗取得了良好的效果,引起了人们极大的兴趣.本文报告小剂量ATRA对大鼠非增生性嘌呤霉素氨基核苷肾病的改善作用.
-
特异性环氧合酶-2抑制剂塞来昔布对嘌呤霉素氨基核苷诱导的足细胞凋亡的影响
目的 研究特异性环氧合酶-2(COX-2)抑制剂塞来昔布对嘌呤霉素氨基核苷(puromycm ammonucleoside,PA)诱导的足细胞凋亡的影响,初步探讨特异性COx-2抑制剂对足细胞保护作用的机制.方法 以条件永生性小鼠足细胞株为研究对象,分为正常对照(CON)组、PA组、塞来昔布(CEL)组和地塞米松(DEx)组.在0、8、24和48 h检测各组足细胞活性和凋亡水平,并检测足细胞凋亡过程中caspase-3的活性水平,运用western印迹法检测各组足细胞P53及COX-2的表达.结果 与CON组比较,PA、CEL、DEx组在24、48 h的足细胞凋亡率均显著升高(P值均＜0.05),但各组这两个时点间的足细胞调亡率的差异无统计学意义(P值均＞0.05).与PA组比较,CEL、DEX组在24、48 h的足细胞凋亡率均显著降低(P值均＜0.05).与CON组比较,各组细胞caspase-3活性无明显变化(P值均＞0.05).与CON组比较,PA组在24、48 h的P53、COX-2表达均显著增多(P值均＜0.05),各组这两个时间点间P53、COX-2表达的差异无统计学意义(P值均＞0.05).与PA组同时间点比较,CEL、DEX组在24、48 h的P53、COX-2的表达显著下降(P值均＜0.05).结论 PA诱导的足细胞凋亡呈时间依赖性,随时间延长,足细胞凋亡逐渐增多.PA诱导的足细胞凋亡过程中P53、COX-2的表达增加,足细胞凋亡过程与caspase-3无关.COX-2抑制剂具有抑制足细胞凋亡的作用,与地塞米松相当.
-
甘西鼠尾草总酚酸提取物对嘌呤霉素氨基核苷大鼠足细胞损伤的保护作用
目的：研究甘西鼠尾草总酚酸提取物（ SPE）对嘌呤霉素氨基核苷（ PAN）大鼠足细胞损伤的保护作用。方法：建立PAN肾病大鼠动物模型，给予他克莫司和SPE干预治疗，分别在第5、10、15、21天留取血尿标本，同时采用肾组织病理观察大鼠肾小球组织形态学改变，透射电镜观察肾小球足细胞超微结构改变，并分别从mRNA和蛋白水平分析足细胞裂孔膜蛋白的表达水平。结果：（1）除正常组外，各组大鼠尿蛋白定量第5天时已明显升高，第10天上升至高峰，而后开始下降，第15天时仍明显高于正常。给予药物干预后，可降低大鼠的尿蛋白排泄量，且阳性对照组与SPE高剂量组降低尿蛋白的程度较为接近。（2）光镜下未见肾小球形态异常。电镜结果显示第5天时已出现肾小球足细胞足突融合，第10天时足突融合明显，随后开始恢复，第21天基本恢复正常；SPE高剂量组和阳性对照组的足突融合程度较轻。（3）阳性对照组和SPE组大鼠的nephrin、podocin蛋白表达水平高于模型对照组。第5天时各组大鼠蛋白表达低于正常，第10天时下降更为明显，第15天蛋白表达已开始回升，至第21天时恢复至正常水平。阳性对照组和SPE高剂量组大鼠蛋白表达均明显高于其余三组。（4）大鼠nephrin、podocin的mRNA表达量在第5天时已下降，至第10天明显下降至低水平，而后开始上升，直至第21天恢复至正常水平。阳性对照组和SPE高剂量组的表达水平明显高于其他各组（ P＜0?05）。结论：SPE对PAN大鼠肾小球足细胞损伤有一定的保护作用，可降低PAN大鼠蛋白尿。
关键词： 嘌呤霉素氨基核苷 足细胞 蛋白尿 甘西鼠尾草总酚酸提取物 -
Toll样受体9在嘌呤霉素氨基核苷导致足细胞损伤中的作用
目的:我们发现Toll样受体9(TLR9)在嘌呤霉素氨基核苷(PAN)处理的足细胞中上调.本研究试图确定TLR9是否参与PAN对足细胞的损伤作用. 方法:(1)用PAN诱导体外培养的足细胞损伤模型,以定量逆转录PCR(qRT-PCR)和Western Blot检测足细胞TLR9及该通路其他组分的变化.同时,利用流式细胞术检查足细胞凋亡情况.用PAN诱导大鼠足细胞损伤,以qRT-PCR和免疫组化法检测大鼠肾小球中TLR9表达变化.(2)将TLR9干扰RNA (siRNA)表达质粒和对照质粒分别转染足细胞,用Western Blot检测比较核因子κB(NF-κB)p65和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)磷酸化、qRT-PCR比较白细胞介素12(IL-12)的mRNA变化,流式细胞仪比较足细胞凋亡情况. 结果:(1)与对照组相比,经PAN刺激的足细胞,其TLR9、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(IRAK1)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)、IL-12的mRNA水平明显上调,磷酸化p65和磷酸化p38显著增加,细胞凋亡增加.PAN大鼠模型的肾小球中TLR9 mRNA表达上调,免疫组化显示TLR9蛋白显著增加.(2)足细胞转染TLR9干扰质粒后,TLR9的mRNA和蛋白表达水平降低;而经PAN处理后,该细胞与转染对照siRNA的细胞相比,其磷酸化p65和磷酸化p38的水平降低,IL-12 mRNA表达降低,足细胞凋亡减少. 结论:TLR9信号通路参与了PAN诱导的足细胞损伤过程,其机制可能是促进炎症因子产生及p38 MAPK依赖的细胞凋亡.
关键词： Toll样受体9 足细胞 凋亡 嘌呤霉素氨基核苷 p38丝裂原活化蛋白激酶 -
雷公藤甲素干预足细胞病变的体外观察
目的:雷公藤甲素对Heymann肾炎和嘌呤霉素肾病大鼠的疗效及其对足细胞病变的影响提示,雷公藤甲素有可能直接作用于足细胞,从而改善其病变状况.本研究借助小鼠足细胞系,体外观察了雷公藤甲素对足细胞损伤的保护和修复作用,并对其作用机制进行了研究. 方法:体外采用氨基核苷嘌呤霉素(puromycin aminonucleoside,PAN)致足细胞损伤模型.观察雷公藤甲素对足细胞损伤的保护作用研究中,雷公藤甲素与足细胞预孵育30 min后,再加入含PAN的培养基,继续作用24h;观察雷公藤甲素对足细胞损伤的修复作用研究中,PAN作用足细胞24 h,造成足细胞明显损伤后,再加入含或不含雷公藤甲素的培养基,继续培养3天.免疫荧光法和流式细胞仪分析足细胞骨架相关蛋白F-actin和Synaptopodin的变化,并进一步观察了细胞内调节骨架装配的Rho/ROCK信号通路的活性,即采用Western Blot检测ROCK-I底物--肌球蛋白磷酸酶结合亚单位(MBS)磷酸化水平,以及Rho/ROCK信号通路选择性阻断剂Y-27632对雷公藤甲素作用的影响.同时采用免疫荧光法和流式细胞仪分析足细胞裂孔膜相关分子Nephrin和Podocin在足细胞的分布及表达量的变化. 结果:正常分化足细胞F-actin呈丝状结构,密度大,丝强劲有力,沿细胞极性分布;Synaptopodin呈颗粒状沿细胞骨架分布.裂孔膜蛋白Nephrin沿足细胞膜和细胞骨架分布,Podocin呈线状均匀分布于胞浆内, PAN作用24h后,细胞足突回缩,F-actin几乎完全解聚,Synaptopodin表达消失.Nephrin和Podocin表达减弱,正常丝状结构消失.而经过雷公藤甲素的预处理,PAN诱导的足细胞损伤明显减弱,足细胞未表现出上述骨架结构的改变, Synaptopodin表达没有明显减弱.同时我们的结果显示,在PAN造成足细胞明显损伤后再加入雷公藤甲素,足细胞损伤能够得到一定修复,细胞内重新出现极性分布的微丝,同时,Synaptopodin的表达也得以修复.Rho/ROCK信号通路研究显示,100 μg/ml PAN明显降低Rho/ROCK通路活性.雷公藤甲素能有效遏制MBS磷酸化水平的降低,维持足细胞Rho/ROCK通路的活性状态.Rho/ROCK信号通路选择性抑制剂Y-27632可阻断雷公藤对足细胞骨架结构的保护作用.此外,对裂孔膜蛋白Nephrin,Podocin的研究表明,不论是在预防组和治疗组,PAN对Nephrin和Podocin的损伤可在一定程度上被雷公藤甲素预防和修复. 结论:雷公藤甲素可稳定足细胞的细胞骨架,拮抗PAN对足细胞的损伤.在足细胞损伤已经发生后,雷公藤甲素可逆转足细胞的损伤,修复足细胞骨架结构和相关分子的表达.雷公藤甲素的上述作用与细胞内Rho/ROCK信号通路密切相关.雷公藤甲素对足细胞的影响可能是其降低肾小球肾炎患者尿蛋白的重要机制之一.
-
雷公藤甲素对嘌呤霉素模型足细胞病变的影响
目的:研究雷公藤甲素对非免疫因素介导的、单纯足细胞病变模型--嘌呤霉素氨基核苷(PAN)肾病模型的疗效及其对足细胞病变的影响. 方法:采用PAN单次颈静脉注射法建立PAN肾病模型.大鼠分为正常对照组,模型组,雷公藤甲素预防组和治疗组.分别在1天、3天、5天、10天、14天和21天收集血尿标本,并处死大鼠留取肾组织标本.检测24h尿蛋白排泄量、血生化指标,行肾组织光镜和电镜观察肾小球病变和足突超微结构.采用定量学方法测定足突宽度.免疫荧光染色观察足细胞裂孔膜分子Nephrin和Podocin表达和分布变化. 结果:雷公藤甲素无论是预防还是治疗性用药均能明显改善PAN肾病大鼠的肾病综合征状况,明显减少尿蛋白,加快血清白蛋白回升和血脂水平恢复.与此同时,雷公藤甲素预防组和治疗组大鼠在各观察点足突融合程度和范围均比PAN肾病大鼠明显减轻,至第14天仅见少数足突融合,第21天足突形态已基本恢复正常.雷公藤甲素预防性和治疗性用药均能够增加足细胞裂孔膜分子Nephrin和Podocin表达,促进其分布异常的修复.在第10天,Nephrin和Podocin不仅表达较PAN肾病大鼠明显增多,而且大部分血管袢已开始呈现连续的线状分布,以Podocin更为明显;两者的表达和分布在第14天已基本恢复,至第21天已完全恢复正常. 结论:雷公藤甲素对PAN导致的足细胞损伤模型具有明显的预防和治疗作用,表现为减少蛋白尿,改善足突融合,恢复足细胞相关蛋白的表达及其分布,逆转足细胞病变.
-
雷马曲班对嘌呤霉素氨基核苷诱导的足细胞凋亡的影响
目的:观察雷马曲班对嘌呤霉素氨基核苷(puromycin aminonucleoside,PAN)诱导的小鼠足细胞凋亡的影响.方法:将条件永生性小鼠足细胞随机分为4组,对照组用RPMI-1640培养液培养,模型组用100 mg/mL PAN诱导足细胞损伤,实验组先用100 μg/mL雷马曲班干预1h,再加入100 mg/mL PAN作用足细胞,雷马曲班组用100μg/mL雷马曲班单独作用足细胞;分别在24、48 h时收集各组细胞,应用FITC-Annexin V/PI双染色法荧光显微镜观察足细胞的凋亡并定量分析,透射电镜观察足细胞损伤、凋亡及超微结构变化.结果:Annexin V/PI染色荧光定量检测结果显示,与对照组相比,模型组、实验组24、48 h的足细胞凋亡率均明显升高(P均＜0.05),雷马曲班组足细胞凋亡率无明显变化(P均＞0.05).与模型组相比,实验组24 h足细胞凋亡率明显下降(P＜0.05),48 h足细胞凋亡率明显降低(P＜0.01).透射电镜结果显示,实验组24、48h足细胞损伤均较模型组明显减轻,凋亡形态的细胞减少.结论:雷马曲班能够降低PAN诱导的足细胞凋亡,减轻足细胞超微结构损伤.
