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经穴注射骨髓间充质干细胞联合中药对糖尿病大鼠后肢缺血血流的影响
目的:探讨经穴注射骨髓间充质干细胞(BMSCs)联合中药对糖尿病大鼠后肢缺血血流的影响.方法:80只SD大鼠随机分为8组:正常假手术组、糖尿病(DM)假手术组、DM缺血组、中药组、局部注射组、局部+中药组、穴位注射组、穴位+中药组.注射选穴:三阴交、照海、环跳、阳陵泉、后三里;局部注射取缺血组织与正常组织交界处等距离选取5个点为注射部位.每只大鼠共注射1×107/mL BMSCs 100μL,每处注射20μL,其他对照组注射等量PBS缓冲液.应用PeriScan PIM型激光多普勒血流成像仪,比较各组大鼠后肢不同时期血流指数(PUI)变化,以及分析中药与注射BMSCs的交互作用.结果:组内PUI比较,穴位注射组、穴位+中药组术后7d与术后2d比略有升高(P＜0.05);DM缺血组、中药组、局部+中药组、穴位注射组、穴位+中药组术后14、21d大幅升高(P＜0.05),且穴位+中药组PUI术后21d显著升高(P＜0.01),差异均有统计学意义.术后7d、14d、21d血流指数差值与术后2d组间比较,穴位+中药组明显较正常假手术组、DM假手术组升高(P＜0.05),差异均有统计学意义.中药与注射BMSCs的交互作用不明显.结论:经穴注射BMSCs联合中药或明显改善糖尿病大鼠后肢缺血血流情况,比其他方法对于促进后肢血流量效果好,其次是穴位注射组,然后是局部+中药组、局部注射组、中药组.
关键词： 骨髓间充质干细胞 后肢缺血 糖尿病 益气活血中药 激光多普勒血流成像仪 -
绿色荧光蛋白转基因小鼠脂肪干细胞治疗后肢缺血的实验研究
目的：观察绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠来源的脂肪干细胞（ADSCs）治疗小鼠后肢缺血的效果及其自身所带荧光标记的有效性。方法取4周龄GFP转基因小鼠的脂肪组织，消化获取GFP来源的脂肪干细胞（GFP-ADSCs），并用流式鉴定其表面的干细胞抗原。建立C57BL/6小鼠左后肢缺血模型并随机分成两组（每组16只）：一组后肢缺血的肌肉组织内注射P3代的GFP-ADSCs 1×106个/100μl，对照组于同样部位注射100μl PBS。1个月后利用苏木素-伊红（HE）、免疫组织化学（IHC）及免疫荧光（IF）染色行CD31染色观察缺血肌肉组织内血管新生情况。结果①从GFP转基因小鼠的脂肪组织中可以获得大量GFP-ADSCs并表达干细胞表面抗原CD90及CD105；②GFP-ADSCs被成功地诱导成脂成骨；③GFP-ADSCs组总残肢恢复率显著高于PBS组（P<0.05）；④1个月后 GFP-ADSCs治疗组缺血的肌肉组织内IHC 染色CD31可见较多的新生血管，其微血管密度数显著高于PBS组（P<0.05）；IF 染色显示GFP-ADSCs治疗组的新生血管表达内皮细胞的特异性标记CD31和GFP，而PBS组则未见GFP绿色荧光表达。结论从GFP转基因小鼠的脂肪组织中可以获取大量的ADSCs，其能够促进小鼠后肢缺血肌肉组织内的血管新生，自带的GFP可以示踪ADSCs在受体内的存活、迁移及分化。
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S1PR2在小鼠后肢缺血模型血管新生和血流恢复中的作用
目的 观察S1PR2对不同时间点小鼠后肢缺血模型血流恢复情况的影响,探讨其在后肢缺血模型血管新生和血流恢复中的作用.方法 采用戊巴比妥麻醉野生型小鼠和S1PR2-/-小鼠,取仰卧位,钝性分离皮肤肌肉等外周组织后,分别结扎小鼠左后肢股动静脉及其分支后缝合,建立小鼠后肢缺血模型.分别于术后第1、3、5、7、10和14天采用激光多普勒血流分析仪观察缺血后肢血流变化情况.于术后第14天处死动物取腓肠肌组织行CD31、NG2免疫荧光染色,计数微脉管密度.结果 术后7～14天,S1PR2-/-小鼠血流恢复情况显著优于野生型小鼠(P ＜0.05),且术后第14天,S1PR2-/-小鼠缺血后肢CD31和NG2阳性的微血管密度显著高于野生型小鼠(P＜ 0.05).结论 敲除S1PR2基因可促进小鼠后肢缺血模型血管新生和血流恢复.
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精制蛇毒酶对大鼠缺血后肢比目鱼肌的影响及作用机制
目的 研究精制蛇毒酶对大鼠不同时段缺血后肢比目鱼肌的影响及机制.方法 成年Wistar大鼠150只,显微外科技术制作大鼠后肢缺血模型,随机分为空白对照组、缺血组及精制蛇毒酶治疗组.空白组仅切开皮肤后缝合；缺血组从术后1d开始按1.2ml/kg体重于大腿肌肉分四点等量注射生理盐水,每周3次,共计2w;治疗组于大腿肌肉分四点等量注射精制蛇毒酶(1mg/ml,1.2ml/kg体重)每周3次,治疗2w;分别于术后第3d、7d、14d、21d和28d采取缺血后肢及对侧的比目鱼肌.测定各组肌肉组织含水量、线粒体游离钙浓度和线粒体通透性转运通道开放程度(用吸光度变化△S表示)的动态变化.结果 比目鱼肌含水程度在缺血1w内升高,随后下降,精制蛇毒酶治疗组比目鱼肌含水程度在造模术21、28d后显著高于缺血组(P＜0.05).在术后第14、21d,精制蛇毒酶治疗组线粒体游离钙浓度显著低于缺血组(P＜0.05)；精制蛇毒酶治疗组MPTP开放程度△S值在第14、21、28d均显著高于缺血组(P＜0.05).结论 精制蛇毒酶能维持大鼠缺血后肢比目鱼肌含水量,降低缺血腓肠肌内线粒体游离钙浓度,抑制MPTP的开放程度.
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小鼠后肢缺血模型肌肉组织中S1P相关受体基因表达的研究
目的：：观察不同时间点小鼠后肢缺血模型肌肉组织中S1 P受体的基因表达情况,探讨其在后肢缺血模型血管新生及血流恢复中的作用。方法：将18只8~12周龄C57 Bl/6 J小鼠随机分为3 d组,即术后3 d组、术后7 d组及术后14 d组,每组6只。采用戊巴比妥麻醉小鼠,取仰卧位,钝性分离皮肤肌肉等外周组织后,分别结扎小鼠左后肢股动静脉及其分支后缝合,建立小鼠后肢缺血模型。分别于术后第1、3、5、7、10和14天采用激光多普勒血流分析仪观察缺血后肢血流变化情况。于术后第3、7和14天处死动物取腓肠肌组织行CD31免疫组织化学染色,计数微脉管密度,并提取腓肠肌组织中RNA,应用实时定量荧光PCR( real-time PCR)技术测定腓肠肌组织中S1P受体的mRNA表达情况。结果：术后14 d内,缺血侧与未缺血侧血流比值及缺血侧CD31阳性染色微脉管密度随时间改变逐渐增加。术后第3天,S1P1、S1P2和S1P3受体mRNA表达水平显著性增高,差异有统计学意义(P<0.05)；术后第7天和第14天,S1P2受体mRNA表达水平均显著地增高,差异具有统计学意义(P<0.05),而S1P1和S1P3受体mRNA表达水平无明显改变(P>0.05)。结论：小鼠后肢缺血后的血管新生和血流恢复情况在早期可能与S1P1受体、S1P2受体和S1P3受体上调有关,随后与S1P2受体上调有关。
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蚓激酶对大鼠缺血后肢腓肠肌的影响及其机制
目的 探讨不同时段蚓激酶对于大鼠缺血后肢腓肠肌的影响及机制.方法 成年Wistar大鼠150只,显微外科技术制作大鼠后肢缺血模型,随机分为蚓激酶治疗组、非治疗组及空白对照组.治疗组从术后1 d开始,于大腿肌肉分4点等量注射蚓激酶(5 g/L,1.6ml/kg体重)每周3次,治疗2周;非治疗组在同样部位按1.6 ml/kg体重注射生理盐水,空白组仅切开皮肤后缝合.分别于术后3、7、14、21、28 d采取缺血后肢及对侧的腓肠肌.测定各组肌肉组织含水量、线粒体游离钙浓度和线粒体通透性转运通道开放程度(用吸光度变化AS表示)的动态变化.结果 缺血腓肠肌含水程度在1周内升高,随后下降,蚓激酶治疗组腓肠肌含水程度在造模术21、28 d后显著高于非治疗组(P＜0.05);在术后第14、21天,蚓激酶治疗组线粒体游离钙浓度显著低于非治疗组(P＜0.05);蚓激酶治疗组中作为MPTP开放程度指标的AS值在第14、21、28天均显著高于非治疗组(P＜0.05).结论 蚓激酶能维持大鼠缺血后肢腓肠肌的含水量,降低缺血腓肠肌内线粒体游离钙浓度,抑制MPTP的开放,表明蚓激酶对大鼠后肢缺血有治疗作用.
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益气通脉汤对间充质干细胞移植治疗大鼠后肢缺血的影响
严重的下肢动脉缺血性疾病,病变范围广泛,传统手术或者介入治疗无法实施,截肢率高.间充质干细胞(MSCs)移植等治疗性血管新生的出现给这些患者来了新的希望[1],MSCs是一种较为理想的治疗性血管新生细胞,其促血管新生的效果和其数量有关,但是增加MSCs的数量并不能无限制地增加MSCs的治疗效果[2],联合其他治疗措施以进一步增加MSCs的治疗效果具有重要意义.本研究旨在观察益气通脉汤对间充质干细胞移植治疗大鼠后肢缺血的影响.
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干细胞移植治疗大鼠后肢缺血中HIV-Tat-CLIO标记磁共振体内示踪的研究
目的 探讨人类免疫缺陷病毒tat蛋白转导域交连超顺磁氧化铁纳米颗粒(HIV-Tat-CLIO)标记、磁共振成像(MRI)无创体内示踪移植大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)的可行性和有效性.方法 SD人鼠28只,分为4组,每组7只,建立右后肢缺亦模型.A组移植HIV-Tat-CLIO标记的BMSC;B组移植HIV-Tat-CLIO与BrdU复合标记的BMSC;C组移植未标记的BMSC;D组注射无菌磷酸盐缓冲液(PBS).术后MRI示踪移植细胞,评估缺血改善程度,以及组织学检查.结果 B、C组分别死亡2只和1只.A、B组MRI结果相似:术后第3天,注射部位圆形低信号影,1周低信号灶离心性扩散成颗粒状,第2周低密度影进一步扩散,信号强度减弱,第4周信号强度进一步减弱,低密度颗粒扩散范围局限于原部位7 mm处.C、D组MRI阴性.缺血后肢平均皮肤温度、血管造影评分以及毛细血管密度A、B、C组间差异无统计学意义(P>0.05),均显著高于D组(P<0.05).D组的损伤评分明显高于其他3组,其他3组间差异无统计学意义.组织学检查与MRI结果一致.结论 HIV-Tat-CLIO标记、MRI可以有效地体内示踪植入大鼠缺血后肢的BMSC.对BM-SC改善缺血的效果无明显影响.
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AAV介导的CD151基因促大鼠缺血后肢血管再生和血运重建的实验研究
目的 研究肌肉转染腺相关病毒(AAV)介导的CD151基因在大鼠后肢缺血模型中促血管再生和血运重建的作用.方法 分别包装携带有CD151基因和GFP基因的重组腺相关病毒(rAAV-CD151,rAAV-GFP).将12只Wistar大鼠随机分为实验组和对照组,每组各6只.实验组大鼠左下肢肌肉注射局部转染rAAV-CD151,对照组注射rAAV-GFP(1×1010pfu/只).基因转染2周后行股动脉切除术建立大鼠后肢缺血模型.通过后肢皮肤温度测定、后肢血管造影和缺血肌肉组织毛细血管密度检测,观察缺血肢体血管再生和评价血运重建情况.Western blot检测两组大鼠缺血肢体局部CD151的表达.结果 股动脉切除术4周(基因转染6周)后,实验组大鼠缺血后肢平均皮肤温度为(32.92±0.63)℃,对照组为(31.22±0.87)℃;后肢血管造影结果 显示实验组缺血侧血管评分平均为(2.56±0.37),对照组平均为(1.57±0.39);实验组缺血后肢肌肉组织毛细血管密度为(609.00±83.89)/mm2,对照组为(517.00±70.65)/mm2;两组比较差异均有显著性意义﹙均P＜0.05﹚.Western blot检测结果 显示实验组大鼠缺血侧肌肉组织CD151表达为对照组的2.96倍.结论 局部高表达CD151基因能够提高缺血组织的血管再生能力,促进缺血器官的血运重建和功能恢复.CD151将为缺血性疾病的血管再生治疗提供新的靶点.
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电针夹脊穴在大鼠后肢缺血模型中的作用研究
目的:探查电针刺激大鼠背部L3-5夹脊穴对大鼠后肢缺血后皮肤血流、温度、肌力以及血清中肌酸激酶(CK)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)含量变化规律.方法:取36只SD大鼠,随机均分为对照组、模型组、A与B实验组,共4组.对照组仅在大鼠双侧骼腰动脉位置柔和地游离腹主动脉及双侧的腹壁阴部动脉.模型组、A、B三组结扎与对照组所暴露位置一致的同名动脉,其中模型组结扎动脉后无治疗处置,A组定时针刺夹脊穴(不通电),B组定时电针夹脊穴.造模成功后于第7天观察大鼠后肢皮肤血流、温度、肌力改变.采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清中CK、AST、LDH的含量.结果:①大鼠后肢缺血造模成功后出现后肢皮肤血流减慢、皮肤温度降低、肌力下降等改变;②一定时间内,大鼠血清中CK、AST、LDH的含量在后肢缺血造模后增多,与对照组比较差异显著(P＜0.05);③电针刺激7d后,大鼠后肢症状体征有所改善,血清CK、AST、LDH含量有所下降,与模型组比较差异显著(P＜0.05);④电针组数据变化更加明显,一定程度上优于未通电组.结论:合理电针刺激大鼠L3-5夹脊穴,可使大鼠后肢血管有一定程度舒张作用,减轻机体组织缺血及受损组织血清酶的释放.
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胰岛素干预对糖尿病大鼠后肢缺血的作用及意义
目的 研究外源性胰岛素对糖尿病大鼠缺血后肢血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响及其促血管新生的作用.方法 取20只健康雄性SD大鼠,将其右后肢股动、静脉及其分支和属支结扎,制成糖尿病大鼠后肢缺血模型,然后将其用简单随机化方法 随机平均分为模型组与治疗组,另取10只正常大鼠作为对照组.14 d后处死大鼠,应用Western blot法检测大鼠后肢肌肉组织中VEGF蛋白表达水平,并采用碱性磷酸酶(AKP)染色法测定大鼠后肢肌肉组织中毛细血管密度.结果 对照组大鼠术前和术后7 d体莺和血糖水平比较差异无统计学意义(P>0.05);模型组大鼠术后7 d与术前比较,体重明显下降(P<0.05),但血糖水平差异无统计学意义(P>0.05);而治疗组给予皮下注射胰岛素注射液术后7 d较术前体重明显下降,并且血糖水平较术前也明显下降,差异均有统计学意义(P<0.05).与对照组比较,治疗组及模型组大鼠术后7 d体重明显下降、血糖明显升高(P<0.05,P<0.01);治疗组与模型组比较,体重差异无统计学意义(P>0.05),但治疗组大鼠术后7 d血糖水平较模型组明显降低(P<0.05).治疗组大鼠缺血肢体肌肉组织中VEGF蛋白相对表达量(155.06±10.26)明显高于模型组(94.30±11.23),P<0.05;对照组大鼠未检测到VEGF蛋白表达.对照组大鼠右后肢肌肉组织中毛细血管密度明显高于模型组和治疗组(P<0.05),而治疗组又明显高于模型组(P<0.05).3组大鼠左后肢毛细血管密度差异无统计学意义(P>0.05);对照组大鼠左、右后肢毛细血管密度差异无统计学意义(P>0.05);模型组和治疗组大鼠右后肢毛细血管密度均明显低于左后肢(P<0.05).结论 胰岛素可以增强糖尿病大鼠后肢缺血肌肉组织中VEGF蛋白表达,促进毛细血管生成,发挥保护作用.
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应用激光多普勒血流仪对大鼠后肢缺血模型血流动力学的观察
目的 应用激光多普勒血流探测仪(LDF)和激光多普勒血流成像仪(LDPI)监测Lewis大鼠后肢急性缺血模型血流和血压的动态变化,探讨大鼠后肢急性缺血后血流变化特点.方法 切除大鼠左后肢股动脉制备急性后肢缺血模型.于术后2、7、14、28及49 d对手术侧和非手术侧肢体采用LDF进行血流、血压检测,于术后7 d采用LDPI进行血流检测.结果 所有大鼠术后均成活,未发现后肢坏死;在术后14 d内手术侧后肢平均分为2分,在49 d平均分为1分.大鼠手术侧和非手术侧肢体血流比值在术后2 d由术前的1上升至1.31±0.439(P=0.021).术后7 d和14 d分别为0.82±0.538和0.93±0.294,两者比较差异无统计学意义(P=0.502),但均明显低于术后2 d的值(P=0.032和P=0.019);术后28 d下降到低点(0.41±1.970),明显低于术后2、7和14 d值(P=0.004、P=0.007和P=0.006);在术后49 d手术侧后肢血流恢复到接近术前值(0.98±0.093),明显低于术后2 d(P=0.010)而高于术后28 d值(P=0.005),与术后7 d和14 d的差异无统计学意义(P=0.126和P=0.382).大鼠手术侧和非手术侧肢体血压比值术后2 d由术前的1明显下降至0.47±0.375(P=0.031);术后7 d继续下降至0.44±0.118,与术后2 d比较差异无统计学意义(P=0.203);术后14 d下降到低点(0.35±0.115),明显低于术后2 d和7 d值(P=0.001和P=0.036);术后28 d开始上升(0.54±0.146),明显高于术后14 d值(P=0.008),但与术后2 d(P=0.493)和7 d(P=0.551)的差异无统计学意义;术后49 d恢复接近术前值(0.97±0.094),明高于术后2、7、14和28 d值(P=0.013、P=0.021、P=0.002和P=0.031).结论 切除大鼠后肢股动脉及分支的方法制备后肢急性缺血模型,在术后14～28 d患肢缺血处于严重阶段.LDF和LDPI可以动态监测肢体血流及血压的变化,对监测大鼠后肢术后缺血的动态演变过程有着重要的作用.
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pEGFP-C1/Akt体外转染骨髓间充质干细胞对后肢缺血大鼠血管生成的影响
目的 探讨经肌肉注射转染pEGFP-C1/Akt的鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)对后肢缺血大鼠血管生成的影响.方法 Wistar大鼠30只,制成双后肢缺血模型,双盲法随机分为基因治疗组(肌注经pEGFP-C1/Akt转染的MSCs)、非基因治疗组(肌注MSCs)及对照组(肌注PBS液).造模前、造膜后即刻及MSCs移植后1～7 d内,每天用红外线皮温仪测定大鼠后肢皮温变化.28 d时经动脉造影观察后肢血管生成情况; 免疫组化染色检测后肢毛细血管密度; 逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测后肢肌肉组织中Akt及血管内皮细胞生长因子(VEGF)的 mRNA和蛋白的表达.结果 移植3 d后基因治疗组大鼠后肢皮温升高明显.28 d时经动脉造影观察基因治疗组后肢侧支血管生成明显; 荧光显微镜观察有绿色荧光细胞在基因治疗组的内收肌和半膜肌分布.毛细血管密度: 基因治疗组为(7.1±0.3)个/高倍镜,非基因治疗组为(4.2±0.4)个/高倍镜,对照组为(1.3±0.2)个/高倍镜,各组间差异均有统计学意义(P＜0.01).Akt及VEGF的 mRNA和蛋白的表达分析: 基因治疗组Akt mRNA(2.44±0.14)和蛋白(1.12±0.13)及VEGF mRNA(1.11±0.11)和蛋白(0.97±0.13)表达水平均明显高于非基因治疗组Akt mRNA(1.58±0.13)和蛋白(0.78±0.12)及VEGF mRNA(0.78±0.14)和蛋白(0.67±0.11)以及对照组Akt mRNA(0.64±0.11)和蛋白(0.36±0.12)及VEGF mRNA(0.56±0.11)和蛋白(0.33±0.13)的表达水平(P＜0.01),后2组间比较差异亦均有统计学意义(P＜0.01).结论 pEGFP-C1/Akt体外转染骨髓MSCs促进后肢缺血大鼠血管生成的效果优于单纯MSCs治疗,为基因转染MSCs治疗缺血性疾病提供可能.
