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AKT基因被RNA干扰抑制后对卵巢癌SKOV3细胞增殖及凋亡的影响
目的 通过RNA干扰技术阻断卵巢癌SKOV3细胞中AKT基因的表达,研究其对卵巢癌细胞增殖与凋亡的影响.方法 人卵巢癌SKOV3细胞体外培养,分为对照组、空白载体组与RNA干扰组三组,采用MTT法与流式细胞仪AnnexinV/PI法检测并评价AKT基因干扰后对卵巢癌细胞增殖、凋亡的影响.结果 MTT结果 显示RNA干扰组细胞增殖能力较对照组与空白载体组明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05),空白载体组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);流式细胞仪AnnexinV/PI法检测结果 显示,RNA干扰组细胞凋亡率高达到(79.52±2.31)%,较对照组与空白载体组明显升高,约是空白载体组与对照组的3倍,差别具有统计学意义(P<0.05).结论 靶向AKT基因的小干扰RNA(siRNA)可有效地抑制卵巢癌细胞的增殖,促进细胞凋亡,是卵巢癌的治疗新方法.
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山茱萸纳米制剂对衰老小鼠脑组织akt基因mRNA表达的影响
目的:探讨山茱萸纳米制剂对自然衰老小鼠脑组织akt基因mRNA表达的影响.方法:以衰老小鼠(11～12月龄)、青年小鼠(2～3月龄)为研究对象,灌服山茱萸纳米制剂,采用RT-PCR方法检测akt基因mRNA的表达.结果:衰老小鼠脑组织akt基因mRNA表达量较青年小鼠低,山茱萸纳米制剂可以不同程度的提高衰老小鼠脑组织akt基因mRNA的表达.结论:山茱萸纳米制剂显著提高衰老小鼠脑组织akt基因mRNA的表达,使衰老小鼠脑组织akt基因mRNA表达趋于年轻化.
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不同AKT基因的表达对胰岛素瘤βTC-6细胞功能的影响
目的:探讨链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导损伤的胰岛素瘤βTC-6细胞功能与AKT基因各异构体(AKT1/AKT2/AKT3)表达的关系.方法:应用实时荧光定量RT-PCR技术,检测体外培养条件下STZ诱导的βTC-6细胞损伤前后不同时间点,Insulin基因和AKT基因的表达变化.结果:在STZ作用前和作用后24 h、72 h,βTC-6细胞的AKT基因表达水平呈下降趋势,其中,AKT1基因表达水平与对照组相比呈显著下降(P＜0.05),在STZ作用后72 h则更为显著(P＜0.01).AKT2和AKT3基因表达水平亦呈下降趋势,但与对照组相比均无显著差异.Insulin基因表达水平亦下降,且在STZ作用后72 h与对照组相比有显著差异(P＜0.05).结论:βTC-6细胞功能与AKT基因的表达相关,并且Insulin基因的表达与AKT1基因的表达呈正向关系.
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荷载Akt基因的PEG-PLGA/DOPE纳米粒的制备及对大鼠缺血性脑损伤的影响
目的 探讨荷载Akt基因的聚乙二醇乳酸羟基乙酸共聚物/二油酰磷脂酰乙醇胺(PEG-PLGA/DOPE)纳米粒(Akt-NPs)对脑缺血-再灌注(HR)诱导的大鼠海马CA1区神经细胞损伤及血红素加氧酶1(HO-1)、半胱天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)表达的影响.方法 通过复乳法制备PEG-PLGA/DOPE纳米粒并对其进行表征.将48只SD大鼠随机均分为假手术组(A组)、全脑I-R组(B组)、I-R+Akt-NPs组(C组)和I-R+空载PEG-PLGA/DOPE纳米粒组(D组).采用焦油紫染色和TUNEL染色检测全脑I-R后5d各组大鼠海马CA1区神经细胞凋亡的情况,免疫印迹法检测各组HO-1和Caspase-3的表达.结果 制备的纳米粒能够较好地荷载Akt基因.I-R后5d时,与A组相比,B组大鼠脑海马CA1区神经细胞凋亡率上升(P＜0.05),HO-1表达减少(P＜0.05),Caspase-3表达增加(P＜0.05);与B组相比,C组大鼠脑海马CA1区神经细胞凋亡率下降(P＜0.05),HO-1表达增加(P＜0.05),Caspase-3表达减少(P＜0.05).结论 Akt-NPs减轻大鼠海马CA1区神经细胞的缺血性损伤作用与上调HO-1和下调Caspase-3表达有关.
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AKT1基因过表达骨髓间充质干细胞的建立
目的 使用慢病毒系统建立AKT1基因过表达的稳转骨髓间充质干细胞.方法 扩增AKT1 cDNA基因,并构建AKT1-cDNA表达载体,再结合穿梭质粒pCDH1-AKT1转染人胚肾293T细胞进行扩增后,使用慢病毒转染系统进行基因重组,并以其为载体转染猪的骨髓间充质干细胞,观察其荧光表达,采用Western blot和RT-PCR分别检测AKT1蛋白和mRNA表达水平.结果 双酶切鉴定和测序结果表明,所获取的cDNA为AKT1的蛋白质编码功能区基因.293T细胞和骨髓间充质干细胞的转染效率均达到90％以上.Western blot和RT-PCR结果表明,稳转细胞的AKT1蛋白和mRNA表达水平均明显高于原代细胞.结论 成功构建AKT1-cDNA表达载体;通过使用慢病毒系统,猪骨髓间充质干细胞能长期稳定过表达AKT1.
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阳离子脂质体转染Akt基因对缺血性心脏病细胞凋亡的影响
目的 研究转染基因Akt对心肌细胞凋亡的影响.方法 培养新生SD大鼠心肌细胞;提取人Akt质粒,用脂质体将其转染心肌细胞.实验分5组:空白对照(A)组、缺血-再灌注损伤对照(B)组、Akt基因(C)组、阳离子脂质体空载体(D)组和Akt抑制剂(E)组;各组进行模拟缺血-再灌注后测定乳酸脱氢酶(LDH)含量、细胞活性、细胞凋亡率及Akt、Bcl-2、NF-kB p65蛋白表达.结果 C组LDH含量较B组、D组和E组明显减少(P＜0.05),细胞活性高(P＜0.05),细胞凋亡率低(P＜0.05),Akt、Bcl-2与NF-kB p65蛋白表达增加(P＜0.05).结论 细胞凋亡参与了心肌缺血-再灌注损伤过程,转染Akt基因可减少缺血-再灌注损伤心肌细胞凋亡率.
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AKT靶向miRNA表达载体的构建及其对胃癌细胞增殖侵袭的影响
目的 构建靶向AKT基因的miRNA真核表达载体,观察其转染胃癌BGC-823细胞后对胃癌细胞增殖及侵袭的影响.方法 设计并合成两条针对AKT基因的特异性miRNA干扰序列,与载体pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR连接,转化大肠杆菌,纯化并鉴定后转染BGC-823细胞,实时定量PCR及Western blot技术鉴定重组体对AKT基因表达的干扰效果.使用MTT法检测细胞增殖能力,Transwell法检测细胞的侵袭能力.结果 针对AKT基因的miRNA干扰质粒构建成功,BGC-823细胞转染该质粒后AKT mRNA及AKT蛋白表达明显受抑制,细胞增殖和侵袭能力均显著下降(P均＜0.05).结论 AKT靶向miRNA真核表达载体构建成功；其可有效抑制胃癌细胞的增殖和侵袭能力.
关键词： AKT基因 microRNA:RNA干扰 增殖 侵袭 -
AKT基因介导的小鼠非酒精性脂肪肝模型的建立
目的 通过尾静脉高压注射含有AKT/SB基因质粒的方法,构建一种新型的小鼠非酒精性脂肪肝模型.方法 将40只雌性FVB/N小鼠随机分为正常组(n=15),模型组(n=15),对照组(n=5),治疗组(n=5).正常组与模型组分别给予尾静脉高压注射生理盐水和AKT/SB质粒,于第1、2、3周分批处死,每批处理5只.对照组与治疗组给予尾静脉高压注射AKT/SB质粒,第3周治疗组开始予以白藜芦醇灌胃(0.04 g/kg),对照组予以等量0.5 ％CMC-Na溶液灌胃,第5周处死全部对照组和治疗组小鼠.检测小鼠体重,肝湿重,肝指数,血清ALT、AST、TG、TC水平及肝组织中脂肪合成相关蛋白的表达水平,肝脏组织切片进行病理学观察,用以评价不同组别小鼠的病理生理变化.结果 模型组小鼠2周后就出现肝功能损伤,脂质代谢紊乱,肝脏脂肪变性明显增加,并出现纤维化和明显的炎性浸润,且造模时间越长,病变程度越严重.治疗组小鼠和对照组小鼠相比,血清中ALT、AST、TC水平均有不同程度的下降,肝组织中脂肪合成相关蛋白的表达水平有所下降,且肝脏切片染色观察脂肪形成明显减少.结论 通过尾静脉高压注射方法在肝脏表达AKT基因,FVB/N小鼠在3周内可形成病变程度逐步加重的非酒精性脂肪肝模型.
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应用Gateway技术构建pLenti6-Akt shRNA真核表达载体
目的 应用Gateway技术构建靶向人Akt基因的shRNA真核表达载体,转染肝癌细胞株HepG2,验证该载体能否下调Akt基因的mRNA水平.方法 以Akt基因为靶点设计两条具有短发卡结构的shRNA序列,经退火成互补双链后克隆入pENTR/U6入门表达载体(pENTR/U6-Akt1,pENTR/U6-Akt2);转化E.coli TOP10菌株,挑取阳性菌落进行菌落PCR和测序鉴定;利用Gateway技术进行LR位点特异性重组,将shRNA导入目的 表达载体pLenti6/Block-it DEST Vector,再行测序鉴定(pLenti6-Akt1,pLenti6-Akt2);将重组质粒转染肝癌细胞株HepG2,提取RNA,RT-PCR检测重组质粒对mRNA水平的抑制效果.结果 经菌落PCR和DNA测序鉴定:pENTR/U6-Akts入门载体和pLenti6-Akts目的 表达载体中插入片段的序列正确,RT-PCR结果表明将shRNA分别转染HepG2细胞后,Akt的mRNA表达受到明显抑制,其中1shRNA比2#shRNA抑制效果明显.结论 利用Gateway技术成功构建了靶向人Akt基因的shRNA表达载体,为以Akt基因为靶点的肝癌基因治疗方案奠定了实验基础.
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SCF对体外转染pEGFP-C1/Akt的骨髓间充质干细胞中c-kit、Akt及VEGF表达的影响
目的 克隆构建绿色荧光蛋白(GFP)/Akt表达载体,观察其在鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)中的表达和定位,并探讨干细胞因子(SCF)通过PI3-Akt途径对转染pEGFP-C1/Akt的MSCs中c-kit、Akt和VEGF mRNA及蛋白表达的影响.方法 采用酶切法将Akt重组于GFP表达载体中,经酶切序列鉴定后,将该重组质粒GFP/Akt及GFP空质粒通过脂质体转染骨髓MSCs; 荧光显微镜观察其转染及在细胞中的分布; 分别采用Western blot 和反转录多聚酶链反应(RT-PCR)方法检测pEGFP-C1和pEGFP-C1/Akt转染MSCs后对c-kit、Akt 及VEGF mRNA和蛋白表达的影响,pEGFP-C1/Akt转染MSCs后不同浓度SCF对c-kit、Akt及VEGF mRNA和蛋白表达的影响. 结果 GFP/Akt基因表达载体经酶切鉴定和测序分析后确认构建成功,并在MSCs中表达.荧光显微镜下见pEGFP-C1转染后,绿色荧光均匀分布于整个细胞中; pEGFP-C1/Akt转染后,绿色荧光分布于细胞质中.与pEGFP-C1组相比较,pEGFP-C1/Akt转染组Akt及VEGF 的mRNA和蛋白表达均明显增强(P<0.05), c-kit mRNA和蛋白表达则无明显变化(P>0.05).加入SCF后其能增强实验组(SCF+pEGFP-C1/Akt)和对照组(SCF+pEGFP-C1)中c-kit、Akt及VEGF的 mRNA和蛋白表达,并且随着SCF的浓度增高该作用则越明显(P<0.05); 与对照组相比较,实验组c-kit mRNA和蛋白的表达无明显变化(P>0.05),而Akt和VEGF mRNA和蛋白表达则明显增强(P<0.01).结论 成功构建GFP/Akt融合基因表达载体在MSCs中表达,可诱导Akt及VEGF mRNA和蛋白的表达; SCF可能通过PI3/Akt途径刺激c-kit、Akt 及VEGF mRNA和蛋白的表达.
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pEGFP-C1/Akt体外转染骨髓间充质干细胞对后肢缺血大鼠血管生成的影响
目的 探讨经肌肉注射转染pEGFP-C1/Akt的鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)对后肢缺血大鼠血管生成的影响.方法 Wistar大鼠30只,制成双后肢缺血模型,双盲法随机分为基因治疗组(肌注经pEGFP-C1/Akt转染的MSCs)、非基因治疗组(肌注MSCs)及对照组(肌注PBS液).造模前、造膜后即刻及MSCs移植后1～7 d内,每天用红外线皮温仪测定大鼠后肢皮温变化.28 d时经动脉造影观察后肢血管生成情况; 免疫组化染色检测后肢毛细血管密度; 逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测后肢肌肉组织中Akt及血管内皮细胞生长因子(VEGF)的 mRNA和蛋白的表达.结果 移植3 d后基因治疗组大鼠后肢皮温升高明显.28 d时经动脉造影观察基因治疗组后肢侧支血管生成明显; 荧光显微镜观察有绿色荧光细胞在基因治疗组的内收肌和半膜肌分布.毛细血管密度: 基因治疗组为(7.1±0.3)个/高倍镜,非基因治疗组为(4.2±0.4)个/高倍镜,对照组为(1.3±0.2)个/高倍镜,各组间差异均有统计学意义(P＜0.01).Akt及VEGF的 mRNA和蛋白的表达分析: 基因治疗组Akt mRNA(2.44±0.14)和蛋白(1.12±0.13)及VEGF mRNA(1.11±0.11)和蛋白(0.97±0.13)表达水平均明显高于非基因治疗组Akt mRNA(1.58±0.13)和蛋白(0.78±0.12)及VEGF mRNA(0.78±0.14)和蛋白(0.67±0.11)以及对照组Akt mRNA(0.64±0.11)和蛋白(0.36±0.12)及VEGF mRNA(0.56±0.11)和蛋白(0.33±0.13)的表达水平(P＜0.01),后2组间比较差异亦均有统计学意义(P＜0.01).结论 pEGFP-C1/Akt体外转染骨髓MSCs促进后肢缺血大鼠血管生成的效果优于单纯MSCs治疗,为基因转染MSCs治疗缺血性疾病提供可能.
