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半夏及掌叶半夏毒针晶中共性毒蛋白的研究
目的:寻找天南星科半夏属有毒中药半夏及掌叶半夏毒性物质基础毒针晶中的共有蛋白,研究刺激性相关蛋白的致炎效应.方法:采用溶液内双酶解方法将半夏与掌叶半夏毒针晶中的蛋白降解为混合肽段,采用液相色谱与串联质谱偶联分析降解后的肽段,将质谱分析数据与BIOWORKS软件搜索的NCBI绿色植物Viridiplantae蛋白库比对进行蛋白质检索分析.采用聚丙烯酰胺凝胶电泳对半夏、掌叶半夏毒针晶蛋白进行分析,同时采用胶内酶解后液相色谱与串联质谱偶联的方法,分析并鉴定约13kDa蛋白.提取分离半夏中的凝集素蛋白,并采用中性粒细胞迁移试验和测定腹腔渗出液中PGE2的含量.考察毒针晶及凝集素的炎症刺激性效应.结果:半夏及掌叶半夏毒针晶中均含约13kDa的蛋白条带,此条带经鉴定为凝集素类蛋白,且此13kDa蛋白条带为毒针晶中的主要蛋白之一,凝集素类蛋白可诱导中性粒细胞向大鼠腹腔迁移,可显著增加小鼠腹腔渗出液中PGE2的含量.结论:天南星科有毒中药半夏及掌叶半夏毒针晶蛋白中均含有凝集素类蛋白,且此类凝集素蛋白具有显著的致炎作用,是半夏与掌叶半夏毒针晶中的共性毒蛋白.
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Expasy数据库与基因数据库交联比对法初步分析SELDI蛋白质荷峰
目的 探索确定SELDI识别出的蛋白质荷峰性质的方法.方法 应用基因数据库与Expasy等蛋白数据库交联比对分析方法来初步分析SELDI得到系统性红斑狼疮淋巴细胞候选质荷峰的蛋白性质.结果 应用基因数据库与Expasy等蛋白数据库交联比对分析方法可以初步明确SELDI法建立的蛋白质荷峰的蛋白可能属性的较小范围,为进一步确定蛋白质荷峰的性质提供更加明确的方向,为进一步研究打下基础,该方法有待进一步完善与验证.
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UPLC/Q-TOF-MS法对凝血酶冻干粉中的蛋白组分进行鉴定和定量分析
目的:建立UPLC/Q-TOF-MS法鉴定市售凝血酶冻干粉中的蛋白组分并进行定量.方法:样品经胰蛋白酶消化后的多肽混合物,用超高效液相色谱进行分离,并在线进入ESI-Q-TOF-MS检测,获得的肽段一级母离子和碎片离子的高分辨准确质量数据(MSE方法),经ProteinLynx Global Server(PLGS 2.4)软件蛋白质谱库检索,确定其中的蛋白组分,再以Hi3非标记蛋白定量方法对各蛋白组分进行定量,得到质量百分比定量结果.结果:在以猪血为原料生产的26批凝血酶冻干粉中,鉴定出人血白蛋白和21种猪源蛋白,其中,有1家企业的3批样品中鉴定出猪和人血浆成分,其余23批次样品均为猪血浆成分;样品中的猪凝血酶含量在1.9％ ～43.7％之间.在以牛血为原料生产的3批凝血酶冻干粉中共鉴定出17种牛源蛋白;样品中的牛凝血酶含量在49.4％ ～77.6％之间.结论:UPLC/Q-TOF-MS法灵敏度高,选择性好,通过一次分析可对凝血酶冻干粉中蛋白组分同时进行定性和定量,并可获得有关工艺相关的数据信息如来源和种属等,可用于本品的工艺研究以及质量控制研究.该法可以作为同类生化药物质量研究和组分分析的方法.
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基因工程的下游技术
基因工程的下游技术是现代生物技术的关键技术,它的重要性已越来越为人们所重视.生物技术产品的下游处理技术包括基因工程产物的分离、纯化及分析鉴定.本文综述了基因工程产物的分离、纯化及鉴定的具体方法及鉴定标准.
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自身免疫病伴M蛋白病5例
[例1] 患者男,46岁.患银屑病20年,于1989年10月住院治疗,住院期间发现尿蛋白+ +++,进一步检查发现本周蛋白阳性,骨髓穿刺示幼浆细胞占有核细胞(去红系)15.6%,浆细胞占5%,且伴形态异常.X线摄片示右第九、十肋骨上各有一指甲大小溶骨性损害.血、尿M 蛋白鉴定:游离κ轻链型M蛋白.诊断:1. 银屑病;2. 多发性骨髓瘤(MM),κ轻链型.
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多发性骨髓瘤患者肌肉软组织摄取骨显像剂一例
患者男,48岁,因消瘦、四肢酸痛6个月入院.实验室检查:血红细胞2.43 ×1012/L,血红蛋白71g/L,白细胞11.88×10 9/L,中性粒细胞0.766,淋巴细胞0.197,单核细胞0.027,嗜酸粒细胞0.007,嗜碱粒细胞0.003,血小板383 ×109/L;尿蛋白++;血尿素氮13.4 mmol/L,肌酐236μmol/L;血钙3.2 mumol/L,磷1.1mmol/L;免疫球蛋白分型IgG 3.27g/L,IgA0.44g/L,IgM 0.19g/L,κ轻链1.83g/L,λ轻链2.33g/L,k/λ0.79;尿本-周蛋白λ阳性;M蛋白鉴定血、尿均可见游离λ轻链;碱性磷酸酶(ALP)61 U/L;甲状旁腺素(PTH)42.0 ng/L;抗链球菌溶血素"O"、类风湿因子阴性.骨髓穿刺检查示多发性骨髓瘤.X线胸片未见异常.B超示甲状腺左叶下极占位性病变并弥漫性钙化.诊断为多发性骨髓瘤(λ轻链型ⅢB期).
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叶酸受体α原核载体的构建及表达
PCR法扩增叶酸受体α基因片段,经Nco Ⅰ和EcoRⅠ双酶切后克隆到原核表达载体pet22b,并进行双酶切和测序鉴定;将测序正确的重组质粒通过CaCl2法转入BL21(DE3)表达菌株,IPTG诱导蛋白表达,镍柱亲和纯化,通过SDS-PAGE,Western blot和ELISA鉴定蛋白表达;免疫小鼠,血清效价检测蛋白免疫原性.经双酶切和测序验证,成功构建FRα-pet22b表达载体.Western blot验证表明,叶酸受体α基因能在BL21中表达目的蛋白,但ELISA值较低.经免疫后小鼠血清与市售叶酸受体α亲和力差,预示原核表达虽能得到叶酸受体α,但其构象可能与真核表达蛋白不同.
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转录组和蛋白质组在动物毒素研究中的应用
动物毒素因其结构新颖、生物活性强等特点一直以来都是研究的热点,是药物开发和临床应用等多领域重要的资源.随着转录组测序技术的快速发展和成本降低,使得转录组学研究更加深入,生物质谱技术的不断更新和完善,蛋白质组学研究进入了新的高度.动物毒素的研究初是通过分离单一组分进行结构和功能分析,而如今将转录组测序分析和基于质谱的蛋白质组学技术联合运用到动物毒素的研究中,并通过数据库搜索软件实现质谱数据到蛋白的鉴定,使得动物毒素的研究进入了新的发展阶段,在动物毒素蛋白鉴定,新活性蛋白发现,进化分析等多方面发挥了重要作用.文章综述了近年来通过转录组学和蛋白质组学联用在多种动物毒素研究中的具体应用.
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GST-hS100A9融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定
目的:制备GST-hS100A9融合蛋白.方法:从pHAHA-hS100A9中PCR扩增获取hS100A9基因,亚克隆至原核表达载体pGST-moluc,构建pGST-hS100A9;后者转化BL21菌后,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组菌表达融合蛋白GST-hS100A9,经谷胱甘肽-琼脂糖4B球珠(Gs4BB)分离纯化、SDS-PAGE及Western blot鉴定,BCA法蛋白定量,CCK-8测定GST-hS100A9对乳腺癌细胞MCF-7增殖的作用.结果:经酶切、测序分析证实pGST-hS100A9质粒构建正确;重组菌株经IPTG诱导后,表达相对分子质量约36000的蛋白;纯化后纯度达94%;该蛋白可被S100A9的抗体特异识别;该蛋白产量约为20mg/L菌液;且其抑制MCF-7的增殖.结论:成功构建GST-hS100A9融合蛋白的原核表达质粒pGST-hS100A9;该质粒可在BL21中诱导表达GST-hS100A9,产率高,且对MCF-7增殖有抑制作用.
关键词： GST-hS100A9融合蛋白 诱导表达 蛋白纯化 蛋白鉴定 -
pQE-EGFP原核表达载体的构建及其表达和鉴定
目的:利用分子克隆技术构建原核表达载体pQE-EGFP,在大肠埃希菌中高效表达与鉴定.方法:以质粒pEGFP-N2为模板,采用PCR方法特异性扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因序列,将其克隆于原核表达载体pQE-31,所构建的重组质粒经测序鉴定后转化大肠埃希菌JM109,用异丙基巯基半乳糖(IPTG)诱导表达;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting鉴定表达蛋白质.结果:PCR扩增得到了EGFP全长结构基因.所构建的pQE-EGFP重组质粒经酶切及测序鉴定结果与设计序列一致;转化大肠埃希菌JM109,经IPTG诱导后,目的蛋白表达率约为25%;SDS-PAGE、Western blotting初步测定目的蛋白的相对分子质量约为28 500,与理论预期值一致.结论:pQE-EGFP重组质粒的成功构建、表达和鉴定为TAT-EGFP融合蛋白穿透细胞能力的研究奠定了基础.
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应用蛋白质组学技术筛选急性心肌梗死早期标志蛋白的研究
目的检测急性心肌梗死早期（发病到就诊时间＜2h）患者血清中的蛋白表达谱，筛选并鉴定出特异的标志蛋白。方法选取20例急性心肌梗死早期患者（早期急性心肌梗死组）和40例稳定性心绞痛患者（稳定性心绞痛组），采用激光解析电离飞行时间质谱技术，检测两组患者血清中的蛋白峰强度，寻找差异表达蛋白并建立蛋白分类模式，确定诊断的特异度和敏感度。采用液相质谱技术进一步鉴定已筛选出来的蛋白。结果早期急性心肌梗死组有5个蛋白显著高表达，质荷比分别为1530.32、4301.46、8683.44、23386.1、23625.5Da，与稳定性心绞痛组患者比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。建立决策树，早期诊断急性心肌梗死的敏感度为93.33﹪，特异度为85.00%，阳性预测值为93.33%。经过鉴定，phosphoglycerate mutase 1在急性心肌梗死早期患者中高表达。结论通过蛋白质组学技术可以早期发现急性心肌梗死，phosphoglycerate mutase 1为早期特异表达蛋白。
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人S100A2-GST融合蛋白原核表达和纯化
目的:制备人S100A2-GST融合蛋白(Human S100A2-GST fusion protein,hS100A2-GST),为进一步研究人hS100A2蛋白的功能及其与其它因子或系统的相互作用奠定基础.方法:从pHAHA-hS100A2中双酶切获取hS100A2基因,亚克隆至原核表达载体pGST-moluc,构建pGST-moluc-hS100A2,转化BL21后酶切鉴定,IPTG诱导重组菌表达融合蛋白hS100A2-GST,再经过Glutathion-Sepharose 4B球珠分离纯化、SDS-PAGE及Western Blot鉴定,Bradford法蛋白定量.结果:Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切该重组质粒后获得2个片段,分别约300 bp和5 kb,提示pGST-moluc-hS100A2构建正确;重组菌株经过IPTG诱导后,表达分子量约为36 kD的蛋白,产率达5 mg/L菌液;Glutathion-Scpharose 4B球珠纯化后,该融和蛋白纯度达92%;Western Blot显示该蛋白可以被S100A2的抗体特异识别,证实其为hS100A2-GST融合蛋白.结论:成功构建了hS100A2-GST原核表达质粒pGST-moluc-hS100A2;该质粒可在大肠杆菌中诱导表达hS100A2-GST融合蛋白,产率高;应用Glutathion-Sepharose 4B球珠可获得纯度达92%的该蛋白.为后续有关hS100A2的研究打下了基础.
关键词： 人S100A2-GST融合蛋白 诱导表达 蛋白纯化 蛋白鉴定 -
多发性骨髓瘤治疗后并发急性单核细胞性白血病1例
1 病例介绍 患者，男，51岁。确诊多发性骨髓瘤11年，为巩固治疗于2001年9月入我院。患者1990年10月无明显诱因出现腰背部持续性疼痛就诊外院，X线示：腰4椎体变扁，内似有骨质破坏，拟诊“骨巨细胞瘤”(L4)行腰4椎体弓切除术。术后病理报告为“浆细胞瘤”，M蛋白鉴定示：IgG39.1 g／L，单克隆升高，λ轻链型。Hb140 g／L，肾功能正常。诊断为多……
