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登革2型病毒与整合素β3相互作用机制的研究
目的 观察登革2型病毒(dengue virus+etotype 2,DV2)感染后及转染DV2病毒蛋白的质粒后,EA.hy926细胞中整合素β3表达规律及表达量的变化,以初步明确DV2与整合素β3的相互作用的可能机制.方法 经噬斑法测定DV2在EA.hy926中的增殖规律,并通过间接免疫荧光染色检测DV2感染后及病毒蛋白质粒转染后整合素B3表达量的变化.结果 DV2能够在EA.hy926细胞中增殖,在感染复数为1的条件下,高病毒滴度为10<'5>pfu/ml,出现在感染后第5天,以后随着感染时间延长病毒滴度逐渐下降.DV2感染后整合素B3的表达量增高,且随感染时间的延长有渐增趋势;转染DV2E蛋白可诱导整合素β3的表达,且E蛋白与整合素β3有明显的共存,而DV2的其他病毒蛋白无明显诱导整合素β3表达的作用,且与之无明显共存.结论 DV2感染可诱导EA.hy926细胞整合素B3的表达,而E蛋白可能是DV2与整合素β3相互作用、进而介导病毒进入细胞的重要分子.
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重症登革热临床和实验室特征及其细胞因子的动态变化
目的 观察重症登革热的临床和实验室特征,检测患者血清中细胞因子的表达,为进一步探讨重症登革热的发病机制提供临床和实验依据.方法 回顾性分析重症登革热的临床和实验室特点,采用ELISA法检测32例重症登革热患者与23例非重症登革热患者血清中IL-6、IL-10、IL-17A、IFN-γ、TNF-α及sTNFRⅠ的表达水平.结果 重症患者的临床表现及实验室指标均与非重症患者有显著差异;除IL-17A,上述其他细胞因子在重症登革热患者中的表达水平均比非重症患者高.结论 IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α及sTNFRⅠ在重症登革热的发病机制中均起着重要的作用.
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登革1型病毒NS1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备
目的 重组表达登革1型病毒NS1蛋白并制备多克隆抗体.方法 通过RT-PCR扩增编码登革1型病毒NS1蛋白的基因序列,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)后经酶切测序鉴定,获得重组质粒pET-NS1.进一步使用IPTG诱导表达,经免疫印迹鉴定后,采用蛋白浸提方法从SDS-PAGE胶中纯化回收融合蛋白,并通过透析对目的蛋白进行复性;纯化复性后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光法测定抗体效价.结果 成功构建了高效表达登革1型病毒 NS1蛋白的原核表达载体,表达的重组NS1蛋白占菌体蛋白总量的50%以上,以包涵体形式存在;免疫印迹表明表达的重组NS1蛋白能够为登革病毒兔抗血清识别,纯化后纯度可达95%以上;免疫小鼠后获得了效价>1:1 000的抗登革病毒NS1蛋白的鼠多克隆抗体.结论 原核表达的重组NS1蛋白具有良好的免疫原性,诱导产生的多克隆抗体能够有效识别天然NS1蛋白,为进一步研究登革病毒NS1蛋白及其抗体的生物学功能奠定了基础.
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微孔杂交快速检测主要黄病毒方法的建立
目的 建立特异、敏感、实用的登革病毒Ⅰ-Ⅳ型、流行性乙型脑炎病毒及黄热病毒检测及分型方法.方法 在系统分析上述病毒基因组序列基础上,分别设计针对6种病毒的特异性包被探针,扩增、克隆、测序后包被聚乙烯微孔板.随后设计检测用PCR引物,并于引物5'端标记生物素,对待检样品进行扩增后用检测探针进行微孔杂交(PCR-ELISA)反应,并对包被DNA浓度、包被时间、杂交温度、杂交时间等反应条件进行优化.结果 初步建立了微孔杂交快速检测上述病毒的方法,试验结果直观,阳性标本吸光度(A)值在0.5以上,阴性结果A值在0.1以下,S/N值在10.0以上.结论 PCR-ELISA方法敏感、特异,为上述病毒的快速诊断提供了新的方法.
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登革4型病毒5'非编码区SLB元件对病毒复制和翻译的调控作用
目的 探讨登革4型病毒5'非编码区SLB元件对病毒复制和翻译的调控作用.方法 首先通过mfold 3.2软件对登革4型病毒5'端RNA二级结构进行预测,确定了3个突变位点:SLB1,缺失位于短茎环82-87位5'UAR环化序列,并破坏其保守茎环结构;SLB2,在次环引入突变破坏其环状结构(M77 G/C);SLB3,突变仅涉及核苷酸,不破坏该次环二级结构(M77-78AG/GA).然后在含有海肾荧光素酶(Renilla Luciferase,R.luc)报告基因的复制子(DEN-R.luc2A-RP)基础上,利用重叠PCR构建上述突变体.将突变体(包括相关的阳性和阴性对照复制子)分别线性化并体外转录成RNA后,取等量各转录体RNA,以脂质体法分别转染BHK-21细胞.通过间接免疫荧光(IFA)、RT-PCR、R.luc报告基因技术和实时定量RT-FCR对突变体的复制和翻译水平进行检测.结果 SLB1突变体的翻译水平并未受到显著影响,但其复制水平出现显著下调.SLB2突变体的翻译水平亦未受到显著影响,但其复制水平受到完全抑制;SLB3突变体的复制和翻译水平均受到了完全抑制.结论 登革4型病毒5'非编码区SLB元件对基因组RNA复制和翻译具有重要的调控作用.
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登革1型病毒广州2006年分离株的基因组特征与进化分析
目的 对2006年分离自广州登革热患者血清的4株登革1型病毒(GZ57/06、GZ63/06、GZ69/06和GZ128/06)进行全基因组序列测定,并同其他毒株序列进行比对分析,以了解其基因组序列特征及可能的传播来源.方法 将登革1型病毒分离株基因组分为9个片段进行RT-PCR扩增,5'与3'末端序列采用RACE法扩增,扩增产物纯化后进行PCR测序.通过末端重叠序列拼接成全长病毒基因组序列,利用生物信息学软件对序列进行比对分析.结果 测序获得的4株广州登革1型病毒基因组全长均为10 735核苷酸(m),编码3 393个氨基酸.5'和3'端各有一段非编码区,长度分别为94nt和462nt.4株病毒的编码区与非编码区核苷酸及氨基酸序列存在一些差异,其中GZ57/06、GZ63/06和GZ69/06毒株的基因组核苷酸和氨基酸序列同源性均在99%以上,而GZ128/06株变异较其他3株大,编码区差异尤其明显.序列比对分析表明,GZ57/06、GZ63/06和GZ69/06毒株均与泰国2001年分离毒株ThD1/0049/01和ThD1/0102/01同源性高,而GZ128/06毒株与缅甸1998年分离毒株D1.Myanrmr.31987/98同源性高.这些新分离毒株与东南亚毒株属于同一基因型.结论 新分离毒株可能来自泰国等东南亚国家和地区,不同毒株表型差异可能与其基因组特征具有密切关系.
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抗登革病毒的天然免疫应答
登革热/登革出血热(DF/DHF)是热带地区重要的蚊传播病毒性疾病,造成了非常严重的世界公共卫生问题.理解机体天然免疫应答对登革病毒感染的影响有重要意义.病毒入侵宿主细胞是感染过程的第一阶段,也是关键性的阶段,其过程所涉及的细胞蛋白鉴定与机制大部分仍然未知.间质性树突细胞(DCs)是登革病毒感染的靶细胞,也是机体天然免疫防御抗登革病毒入侵的第一道防线.在病毒感染早期.NK细胞分泌的Ⅰ型干扰素(IFN)非常重要.机体内有两个应答登革病毒感染的天然免疫通道,其中一个信号通道利用Toll样受体(TLR)家族成员,探测经细胞内吞作用进入的内涵体病毒,通过信号蛋白诱导IFN产生,并终活化NF-κB,IRF7、IRF5等转录因子,另一个抗病毒通道则以维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)作为细胞内识别病毒dsRNA的受体.但RNAi天然免疫通道在人类是否存在还有待进一步研究.
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1999年新分离的登革病毒福建株基因组非编码区的结构特征
目的:测定和分析我国登革2型病毒福建株(FJ-11)基因组非编码区(NCR)序列,为探讨其结构特征与功能的关系提供依据.方法:从登革2型病毒感染的C6/36细胞中提取总RNA,采用RACE法扩增病毒基因组5′和3′端片段,分别将其克隆至pGEM-T载体,挑取阳性克隆进行序列测定;利用RNAdraw软件对非编码区二级结构进行预测.结果与结论:我国登革2型病毒FJ-11株基因组5′和3′非编码区长度分别为96?nt和454?nt,具有黄病毒共有的保守序列和二级结构.与登革2型病毒美洲基因型比较显示,5′NCR第69位核苷酸的改变对其二级结构有影响;3′NCR端约70?nt能形成相同的保守结构,而前380?nt呈现多处核苷酸的差异而导致两者预测的二级结构差别较大,它们可能对病毒基因组RNA的复制起重要作用.
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登革1型病毒广州06株基因组全长感染性克隆的构建与鉴定
目的:构建本室新分离的登革1型病毒广州06株基因组全长感染性cDNA克隆,为深入研究登革病毒致病机制奠定基础.方法:根据登革1型病毒广州06株基因组全序列中单一酶切位点设计特异引物,分别扩增并克隆5个病毒亚基因组cDNA片段,将其逐一拼接连入pWSK 29低拷贝质粒载体,获得病毒全长cDNA克隆,并将其体外转录为RNA,再转染细胞获得恢复病毒.进一步通过RT-PCR扩增病毒5′和3′非编码区序列和特异性间接免疫荧光对其恢复病毒进行鉴定.结果和结论:构建获得登革1型病毒广州06株基因组全长感染性cDNA克隆,其恢复病毒与野生型病毒具有相似的生物学特性.
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我国三株登革2型病毒基因组全序列的测定及系统发生树分析
目的:测定我国3株登革2型病毒(dengue 2 virus,DEN2)流行株的全序列并确定其基因型.方法:运用RT-PCR和5′,3′ RACE法测定我国3株登革病毒的全序列,采用邻结法绘制系统发生树.结果:DEN2-04、43、44株的核苷酸及氨基酸差异分布于整个序列之中,DEN2-04与DEN2-43、44共有21个氨基酸位点的差异引起极性或电荷变化.DEN2-04株与JAM株、越南分离株和泰国分离株同为Ⅲ基因型,DEN2-43、44株与台湾、菲律宾和新几内亚株分在Ⅱ基因型.结论:我国不同地区存在同一基因型的DEN2传播,同一地区存在不同基因型的DEN2传播.
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我国登革1型病毒广州株基因组全序列测定与分析
目的:对引起1980年广州登革热流行的登革1型病毒(GZ/80)株的基因组全序列进行测定,为进一步了解病毒基因组结构与功能的关系, 从分子水平探讨登革病毒的传播和流行规律及致病机制提供依据.方法:用广州登革热流行期间从患者血清中分离的GZ/80株病毒感染乳鼠,取鼠脑制备病毒RNA.对基因组编码区分段进行RT-PCR扩增,非编码区采用RACE法进行cDNA扩增.然后将特异产物纯化后与pGEM-T easy载体连接,分别进行克隆测序.结果:GZ/80株基因组全长10?735?nt,5′和3′非编码区长度分别为94?nt和465?nt;基因组单一的读码框架长度为10?176?nt,编码3?392个氨基酸.与登革1型病毒16007株、WestPac74株、新加坡S275/90株和FGA/89株核苷酸序列的同源性分别为94%,93%,95%和91%;推测的氨基酸序列的同源性分别为98.0%,97.9%,97.9%和97.1%.结论:GZ/80株基因组大小及结构与已知的登革1型病毒其他地区分离株一致.系统发生树分析显示,GZ/80株属于第Ⅱ基因型,与台湾87株、88株和泰国80株为同一基因型.提示广州登革热流行的病原可能来自我国.
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扩增我国登革2型病毒全长cDNA分子的融合PCR方法
目的:建立扩增登革2型病毒基因组全长cDNA的融合PCR法,为深入探讨病毒基因组的结构与功能提供有效的技术途径.方法:根据我国登革2型病毒D2-43株序列设计引物,首先采用长链RT-PCR技术扩增病毒基因组5′及3′半分子,然后以半分子采用融合PCR法将两个半分子构建成全长cDNA分子.为进一步证实所构建全长cDNA分子的特异性,再以融合PCR产物为模板扩增5′非编码区序列,与pGEM-T载体连接,在377A型自动测序仪进行序列分析.结果:通过对逆转录反应及PCR扩增条件的优化,建立了制备大片段cDNA及构建全长cDNA分子的融合PCR方法.扩增的我国登革2型病毒的5′及3′半分子的长度均为5 kb左右,采用融合PCR方法制备的全长cDNA长约11 kb,与预期大小一致,非编码区测序结果表明扩增产物为D2-43所特有.结论:所建立的融合PCR方法是构建登革病毒基因组全长cDNA的有效技术.
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抗登革病毒化学药物研究进展
登革热是由埃及伊蚊和白纹伊蚊传播的一种重要虫媒病毒引起的疾病.登革病毒感染能够引起登革热、登革出血热和登革休克综合征等多种症状.迄今为止尚无抗登革病毒药物上市.研发中的药物按照作用机制可分为抗登革病毒的复制周期抑制剂和对抗宿主的宿主因子抑制剂两大类.依据作用靶点不同,前者又进一步分为登革病毒进入抑制剂、衣壳蛋白抑制剂、NS3蛋白抑制剂、NS5蛋白抑制剂、NS4B蛋白抑制剂;后者分为细胞受体抑制剂、脂类合成及代谢途径抑制剂、葡萄糖苷酶抑制剂.目前抗登革病毒的药物研发仍面临巨大挑战,研发作用于登革病毒4种血清型的有效药物具有广阔的应用前景,必将为登革热的防治带来新希望.
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GICA检测登革热病毒NS1抗原和(或)IgG/IgM抗体的临床意义
目的 分析并探讨胶体金免疫层析法(GICA)检测登革热病毒NS1抗原和(或)IgG/IgM抗体的效果.方法 选择我院2014年1月～2015年6月收治的1200例门诊疑似登革热病毒感染者作为研究对象,应用随机分组法将患者分为两组各600例,分别接受聚合酶链反应(PCR)荧光探针法和酶联免疫吸附测定法(ELISA),再将上述两类样本分别随机分为3份,每份200例,A组用GICA检测NSI抗原,B组用GICA检测IgG/IgM抗体,C组共同检测NS1抗原和IgG/IgM抗体.另D组选取60名健康人群使用GICA联合检测NS1抗原和IgG/IgM抗体.结果 ELISA组结果:A组结果与ELISA结果相比,阳性、阴性、总体符合率分别为82.88％、90.00％、83.00％,结果有统计学差异(P＜0.05);B组结果与ELISA结果相比,阳性、阴性、总体符合率分别为88.20％、71.79％、85.00％,结果有统计学差异(P＜0.05);C组结果与ELISA结果相比,阳性、阴性、总体符合率分别为94.87％、47.73％、84.50％,结果无统计学差异(P＞0.05);PCR组结果:A组结果与PCR结果相比,阳性、阴性、总体符合率分别为87.68％、83.87％、86.50％,结果有统计学差异;B组结果与PCR结果相比,阳性、阴性、总体符合率分别为91.45％、85.42％、90.00％,结果有统计学差异(P＜0.05);C组结果与PCR结果相比,阳性、阴性、总体符合率分别为95.43％、60.00％、91.00％,结果无统计学差异(P＞0.05);D组结果均为阴性,特异性为100％.结论 GICA对NIS抗原和IgG/IgM抗体的联合检测结果与ELISA和PCR检测结果较为接近,且特异性比较好,可用于登革热病毒感染的早期筛查和辅助诊断.
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国际研究人员发现登革热病毒新抗体
一个国际研究团队新报告显示，他们发现了登革热病毒的一类新抗体，与此前发现的抗体不同，这类抗体对所有类型的登革热病毒都可发挥作用，有助于开发更有效的疫苗或治疗药物。
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一项关于Zika病毒疾病流行特征的研究
2007年,内科医生报道了在密克罗尼西亚群岛的Yap岛发生的一种疾病,以皮疹、结膜炎和关节痛为特征,尽管在一些病人血浆中发现了抗登革热病毒的IgM抗体,但在临床上不同于以往的登革热,随后的实验运用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)在病人血浆中发现了Zika病毒RNA,而不是登革热或其他病毒的RNA.
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丙型病毒性肝炎及其检测研究进展
丙型肝炎属黄病毒科丙型肝炎病毒属[1],其基本结构与人类黄病毒如黄热病病毒、登革热病毒和乙型脑炎病毒相似,由结构蛋白和非结构蛋白组成.
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莆田市2008年首例输入性登革热病例调查分析
登革热是由登革热病毒引起,通过伊蚊传播的急性传染病,多见于热带和亚热带地区[1].福建省早于1873年厦门岛爆发流行;2004年9～10月份福州市发生爆发流行;2007年8～10月份莆田市涵江区发生局部爆发流行[2].2008年4月11日12时,莆田市疾病预防控制中心(CDC)报告涵江区医院收住1例输人性登革热疑似病例,莆田出入境检验检疫局立即协同CDC对此病例进行了全面调查.
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机场体温筛查和输入性登革热
在世界热带和亚热带地区,尤其是在城镇和城郊地区,登革热病毒是导致相当数量人患病的虫媒病毒.在西太平洋、东南亚和南美洲许多国家由于登革热的高地方流行性,该疾病在这些国家成为了一个重要的公共卫生问题.登革热不是中国台湾的地方流行病,然而由于与东南亚邻国密切的经济往来和航空旅行,登革热病毒的不断输入导致了中国台湾本地登革热的爆发.至今夏季和秋季登革热频繁的本地爆发每次都是由单一一种输入性登革热病毒引起的,而且每次爆发后该病毒都消失了.除1915～1916年、1942～1943年、1987～1988年和2001～2002年外,由于冬季温度相对偏低,约波动在10℃左右,导致了蚊虫密度偏低,因此该季节很少爆发登革热.登革热的爆发主要在中国台湾南部,在该地区埃及伊蚊和白纹伊蚊同时存在;而在中国台湾中部和北部很少爆发登革热,那里只有白纹伊蚊.在中国台湾,登革出血热病例和年龄的增长与二次感染登革热病毒高度相关.
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登革热早期的血液学表现
登革热(Dengue fever)是由登革热病毒引起,经伊蚊传播的急性传染病.2000年6～11月潮汕地区发生登革热的局部流行.期间,我科共收治登革热患者20例.由于登革热整个病程约5～7天,其典型症状、体征多在早期出现,对其早期血液学表现进行分析、总结将有助于临床诊治.
