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单增李斯特菌PCR-ELISA快速检测技术研究
目的 建立快速检测单增李斯特菌的PCR-ELISA方法,将其应用于人工污染的食物样品检测.方法 根据GenBank数据库资料,应用分子生物学软件DNAMAN 6.0和Primer Premier 5.0,以单增李斯特菌的致病基因hlyA为基础,选用PCR引物,应用地高辛标记试剂盒,获得单增李斯特菌特异的地高辛标记片段.根据.PCR目的 片段序列,设计特异性捕获探针,建立了单增李斯特菌PCR-ELIA快速检测方法.应用该方法对不同血清型的单增李斯特菌食品分离株进行了检测,并将PCR方法与PCR-ELISA方法对人工污染单增李斯特菌的牛奶样品的检测敏感性进行了比较.结果 应用单增李斯特菌特异的PCR-ELISA方法完成检测约需6h.该方法对单增李斯特菌分离株检测的结果,与国家食源性疾病检测网的鉴定结果100%符合.经过12h的增菌培养,PCR-ELISA方法低可从25ml样品中检出1CFU,检测敏感性为传统PCR方法的10-100倍.结论 建立了单增李斯特菌PCR-ELISA快速检测方法.该方法敏感性高、特异性强、可靠性好,对于提高食源性疾病预警、预测能力,增强检测的时效性和准确性,具有推广应用价值.
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检测弓形虫PCR-ELISA方法的建立
目的建立检测弓形虫DNA的快速、敏感、特异、稳定的PCR-ELISA方法. 方法将生物素标记的PCR产物与地高辛标记的特异性探针杂交,通过酶免疫显色反应测出A值,判断弓形虫感染情况.优化反应条件,测定方法的敏感性,并与琼脂糖凝胶电泳结果比较.以人、小鼠、疟原虫、旋毛虫等DNA为模板在同样条件下进行测试,以确定该方法的特异性. 结果本实验的佳杂交时间为30 min,佳探针浓度为3 pmol/ml.该方法的检测阈值为20 fg弓形虫DNA,其灵敏度是电泳法的10倍,并且与人、小鼠、疟原虫、旋毛虫等DNA均无交叉反应. 结论 PCR-ELISA是一种快速、敏感、特异、稳定的检测方法,可用于临床弓形虫病的诊断.
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SCL基因在白血病患者骨髓基质细胞中的表达
为了解白血病干细胞(stem cell leukemia,SCL)基因在白血病骨髓基质细胞(BMSC)及骨髓细胞中的表达情况,收集18例急性髓系白血病(AML)、17例慢性粒细胞白血病(CML)、7例急性淋巴细胞白血病(ALL)和33例正常骨髓标本的单个核细胞(MNC)进行体外长期培养,分别收集悬浮细胞(造血细胞)和扩增后的贴壁细胞(BMSC).运用RT-PCR-ELISA检测SCL基因的表达,分析表达率,并以管家基因β2微球蛋白(β2M)为内参照进行半定量分析.结果发现,SCL基因在AML(27.8%)和CML(11.8%)的BMSC中的表达率均低于正常对照组(69.7%,P＜0.05).SCL基因在CML骨髓造血细胞中的表达率(64.3%)高于其对应的BMSC(P＜0.05).半定量分析SCL基因在AML骨髓造血细胞中的表达水平显著高于其对应的BMSC(P＜0.05).结论:SCL基因在AML和CML的BMSC中的相对低表达状态可能与血液病造血调控的异常有关.
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人季节性流感病毒H1、H3、B型PCR-ELISA分型检测方法的建立及应用
目的 建立快捷灵敏的季节性流感病毒PCR-ELISA检测技术.方法 根据甲型流感病毒M基因(M)、H1和H3亚型的HA基因(H1-HA、H3-HA)、乙型流感病毒的NS基因(B-NS)保守序列设计引物探针,通过生物素与地高辛的特异性标记,后通过酶联免疫吸附试验(ELISA)判断PCR扩增的有无.结果 M、H1、H3、B-NS四个基因片段所能检测的低拷贝数分别为:1.43?103、8.67?102、3.86?103、5.45?103拷贝/μl,其敏感度比普通PCR扩增提高了10倍,且不同流感病毒亚型之间、不同种属病毒之间均不存在交叉反应现象.另外还检测了104份临床标本,本文所建立的PCR-ELISA方法的检测结果与细胞培养完全一致.结论 本文通过特异性和敏感性实验显示此方法灵敏度高,特异性强,且操作简单,可以广泛地应用于流感病毒的实验室检测.
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肾综合征出血热患者血清汉坦病毒基因的PCR-ELISA方法建立
目的建立检测肾综合征出血热(HFRS)患者血清标本中HV基因的PCR-ELISA方法.方法设计并合成互补于HV S基因片段的标记引物,对108例HFRS患者血清进行巢式RT-PCR扩增,并用酶免方法分析扩增产物.结果 108例患者不同病日采集的血清标本的巢式RT-PCR平均检出率仅为62.0%,而PCR-ELISA平均检出率为81.5%.结论 PCR-ELISA用于早期HFRS患者的HV基因检测是一种理想的检测方法.
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大肠癌患者外周血循环癌细胞端粒酶活性的表达及其临床意义
目的 探讨大肠癌患者外周血循环癌细胞端粒酶活性的变化与临床意义.方法 外周血经梯度离心分离单个核细胞,其中可含有循环癌细胞,再应用聚合酶链反应-酶联免疫吸附(PCR-ELISA)方法检测120例大肠癌患者外周血循环癌细胞端粒酶活性.结果 120例大肠癌患者中 65 例端粒酶活性明显升高,阳性率为54.12%,端粒酶活性的表达与大肠癌的病理类型,分化程度无明显相关性,但与淋巴结的转移明显相关 .结论 外周血循环癌细胞端粒酶活性水平与大肠癌的转移密切相关.
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端粒酶活性与卵巢上皮性肿瘤临床病理因素相关性分析
目的探讨端粒酶在上皮性卵巢肿瘤发生发展中的作用,评价端粒酶作为卵巢癌诊断及预后指标的价值.方法采用端粒酶PCR-ELISA法对25例卵巢上皮性肿瘤包括8例良性(5例浆液性、3例粘液性)、3例交界性(浆液性)和14例恶性(8例浆液性,4例粘液性,2例内膜样),6例正常卵巢表面上皮进行端粒酶活性定量检测.结果2例良性、2例交界性和12例恶性卵巢上皮性肿瘤及1例正常上皮存在端粒酶活性,端粒酶活性的吸光度(A)平均值分别为0.080±0.070、0.408±0.208、1.659±0.930和0.086±0.060,统计学分析表明恶性卵巢肿瘤中端粒酶活性明显高于良性、交界性肿瘤和正常卵巢组织,端粒酶活性和卵巢上皮性肿瘤组织学类型、临床分期无关;而与肿瘤的分化程度呈负相关.结论研究结果初步证明端粒酶活性增高在卵巢癌的无限增殖中是一重要环节,并提示端粒酶表达有可能成为卵巢癌早期诊断及判断预后的肿瘤标志物.端粒酶PCR-ELISA法具有定性又定量、特异性较高、敏感性强、简易快速、可避免同位素污染等优点.
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养颜青娥丸对小鼠B-16黑素瘤细胞株酪氨酸酶mRNA转录水平的影响
目的观察养颜青娥丸对小鼠B-16黑素瘤细胞株酪氨酸酶mRNA转录水平的影响机制,探讨养颜青娥丸治疗色素增加性皮肤病的作用机制.方法 PCR-ELISA方法检测养颜青娥丸复方不同浓度及不同时间对黑素瘤细胞酪氨酸酶mRNA转录的影响.结果 PCR-ELISA方法研究结果表明在加药6 h后养颜青娥丸对酪氨酸酶mRNA有抑制作用,48 h后抑制作用不太明显;各浓度对mRNA的水平均有抑制作用;在加药6 h后并在2.01 mg/mL抑制作用为显著.结论养颜青娥丸能抑制黑素瘤细胞内酪氨酸酶mRNA转录,对色素增加性皮肤病可能有一定的治疗作用.
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微孔杂交快速检测主要黄病毒方法的建立
目的 建立特异、敏感、实用的登革病毒Ⅰ-Ⅳ型、流行性乙型脑炎病毒及黄热病毒检测及分型方法.方法 在系统分析上述病毒基因组序列基础上,分别设计针对6种病毒的特异性包被探针,扩增、克隆、测序后包被聚乙烯微孔板.随后设计检测用PCR引物,并于引物5'端标记生物素,对待检样品进行扩增后用检测探针进行微孔杂交(PCR-ELISA)反应,并对包被DNA浓度、包被时间、杂交温度、杂交时间等反应条件进行优化.结果 初步建立了微孔杂交快速检测上述病毒的方法,试验结果直观,阳性标本吸光度(A)值在0.5以上,阴性结果A值在0.1以下,S/N值在10.0以上.结论 PCR-ELISA方法敏感、特异,为上述病毒的快速诊断提供了新的方法.
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PCR-ELISA法检测胃癌组织中端粒酶的活性
目的:研究胃癌组织及相应癌旁组织中的端粒酶活性,探讨其作为胃癌肿瘤标记物的可能性.方法:采用PCR-ELISA方法检测36例胃癌组织及36例相应癌旁组织中端粒酶活性的表达.结果:36例胃癌组织中,30例端粒酶呈阳性,阳性率为83.3%;而36例癌旁组织中只有1例阳性.结论:端粒酶是特异性较强的恶性肿瘤基因标志,有可能成为胃癌早期诊断的理想标志物.
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大肠癌及其转移淋巴结中端粒酶活性的研究
目的 研究大肠癌、癌旁组织及转移淋巴结中端粒酶的活性表达,探讨其与大肠癌的生物学特性及预后诸因素的关系.方法 采用PCR-ELISA法定量检测34例大肠癌组织、20例癌旁组织及16例转移淋巴结中端粒酶的活性(TA).结果 34例大肠癌组织中,端粒酶阳性表达31例,阳性率91.2%.20例癌旁正常粘膜组织中,仅2例为阳性(10%).16例转移淋巴结中,13例检出端粒酶活性表达,阳性率为81.3%.淋巴结转移"+"的大肠癌组织与淋巴结转移"-"的大肠癌组织端粒酶活性A值相比有显著差异(P<0.05).大肠癌组织与癌转移淋巴结中端粒酶活性水平明显高于癌旁组织(P<0.01).端粒酶的活性表达与大肠癌的部位、病理类型、分化程度、分期及侵袭范围等临床病理因素无明显相关性.结论端粒酶的活性水平与大肠癌的发生、发展密切相关,是一种特异性很强的恶性肿瘤标志物,有可能成为大肠癌早期诊断的标志物和治疗的新靶点.
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端粒酶活性与肿瘤相关性研究
本研究采用TRAP-银染色法和(或)PCR-ELISA技术进行端粒酶活性研究.1997～1999年对肝癌、胃癌、急性淋巴细胞白血病、子宫颈癌、鼻窦部浆细胞肉瘤、恶性甲状腺瘤、精原细胞癌、阴茎癌等22种肿瘤共115份肿瘤组织标本检测,端粒酶阳性率为80%(92/115),同时检测这些肿瘤的临近正常组织共96份,端粒酶阳性率为5.2%(5/96);34份子宫平滑肌瘤和8份非肿瘤病变组织端粒酶阳性率为7.1%(3/42),它们的临近正常组织阳性率为2.4%(1/42);肿瘤细胞克隆株3例均为阳性.结果表明,恶性肿瘤组织细胞中端粒酶活性明显高于良性肿瘤和正常细胞(P＜0.01);1999-2000年对胃癌组织进行研究,得出同样结果,因此端粒酶活性的检测有望成为一种新的肿瘤标志物用于临床诊断研究.端粒酶活性的增高与恶性肿瘤高度相关,对试图通过调控端粒酶活性来达到对恶性肿瘤的治疗研究提供了一个新的靶点和可靠依据.
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PCR-ELISA技术在寄生虫病研究中的应用
PCR-ELISA是在PCR基础上结合分子杂交技术和免疫学技术的一种新的检测手段,该文就其原理,特点及其在寄生虫病研究中的应用加以概述.
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胃癌组织中端粒酶检测的相关性研究
目的:探讨端粒酶与胃癌的关系.方法:分别对胃癌手术患者取胃癌组织、癌旁组织和正常胃粘膜组织,用PCR-ELISA法检测端粒酶活性.结果:胃癌组织端粒酶阳性率高于癌旁组织和正常胃粘膜组织(P＜0.01).结论:活化的端粒酶在胃癌的发生、发展过程中起了促进作用,同时端粒酶的检测对胃癌诊断具有一定的临床价值.
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PCR-ELISA法检测HBV-DNA的探讨
乙型肝炎表面抗原(HBsAg)为乙肝病毒(HBV)感染主要标志之一.对以低水平存在于血清中的HBsAg进行有效检测,具有重要的临床和流行病学意义,特别对献血者筛检更为重要.
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乙肝病毒DNA定量检测的临床分析
PCR技术检测血清或肝组织HBV-DNA是诊断乙型肝炎病毒感染的指标之一,直接说明病毒的复制和传染性,是临床抗病毒治疗的指征.PCR-ELISA定量检测对检测乙肝病毒含量及考核抗病毒治疗疗效,具有很好的使用价值.为了探讨HBV-DNA在乙肝病毒感染者血清中的水平,我们对92例ELISA检测为阳性的几种模式的乙肝感染者,作了HBV-DNA定量检测和分析.为临床正确诊断和及时有效的治疗提供了可靠的依据.
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人隐孢子虫RT-PCR-ELISA检测方法的建立
目的 建立一种高度敏感和特异的人隐孢子虫的RT-PCR-ELISA检测方法.方法 根据人隐孢子虫与其他隐孢子虫粘附蛋白p23基因的多重比对,设计一对引物(其中p1引物带有生物素标记)用来扩增含高变区目的片段;采用RT-PCR方法扩增目的片段,扩增产物与探针引物进行液相杂交,将杂交产物与微孔板上包被的链霉亲和素结合,再与辣根过氧化酶标记的抗地高辛抗体反应.用所建立的方法对22份临床样本进行检测,并与常规检测方法进行比较.结果 所建立的RT-PCR-ELISA检测方法具有高特异性和敏感性,比常规的PCR方法灵敏度提高了100(0.08:8 ng)左右.临床检测结果显示,该方法的检出率高达86%(19/2),而RT-PCR、蔗糖漂浮法和抗酸染色法的检出率仅为27%(6/22)、27%(6/22)和50%(11/22).结论 本试验成功建立了人隐孢子虫的RT-PCR-ELISA检测方法,检出率比常规检测方法高.
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PCR-ELISA用于HFRS病人早期诊断的研究
目的建立检测HFRS患者血清标本中HV基因的PCR-ELISA方法.方法设计并合成互补于HV S基因片段的标记引物,对98例HFRS患者血清进行RT-nested PCR扩增,并用酶免方法分析扩增产物.结果 98例患者不同病日采集的血清标本的RT-nested PCR平均检出率仅为60.2%,而PCR-ELISA平均检出率为80.6%.结论 PCR-ELISA用于早期HFRS患者的HV基因检测是一种理想的检测方法.
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PCR-ELISA检测弓形虫实验研究
目的建立快速、敏感、特异、稳定的PCR-ELISA方法,并用其检测感染动物体内的弓形虫.方法将生物素标记的PCR产物与地高辛标记的特异性探针杂交,再通过酶免显色反应测出OD值,以判断弓形虫感染情况.测定该方法的敏感性、特异性及稳定性.再分别以104、103弓形虫RH株速殖子腹腔接种小鼠,取全血、肝组织用PCR-ELISA检测小鼠感染情况.结果本实验中,PCR-ELISA方法的检测阈值为20fg弓形虫DNA,其灵敏度是电泳法的10倍,并且与人、小鼠、疟原虫、旋毛虫等DNA均无交叉反应.同一样本重复测试5次,结果经统计学检验,一致性良好(Alpha=0.72).检测感染动物肝组织及全血标本,104、103组分别在感染后第二d、第三d即可测出阳性,两种标本的阳性检出效率无统计学差异( P >0.05).结论 PCR-ELISA是一种快速、敏感、特异、稳定的检测方法,可试用于临床弓形虫病的诊断及流行病学调查.
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胃癌组织及胃液中端粒酶活性的检测及意义
目的:研究胃癌组织和胃液中端粒酶活性与胃癌的关系及对胃癌的诊断意义.方法:用PCR-ELISA方法检测20例胃癌的癌组织和胃液中端粒酶活性,同法检测20例正常胃组织和胃液中的端粒酶活性以作对照.结果:20例胃癌组织中,端粒酶活性阳性为80%(16/20),胃液中端粒酶活性阳性率75%(15/20).正常胃组织端粒酶活性阳性无表达(0/20),胃液中端粒酶活性阳性无表达(0/20).结论:端粒酶可能参与了胃癌的发生发展过程,检测胃液中端粒酶活性可能有助于胃癌的诊断.
