去细胞组织工程心脏瓣膜研究现状与展望

当前临床应用的所有生物瓣,包括无支架生物瓣共同致命弱点是易钙化、衰败,不具有生长活性.而随着组织工程技术的发展,组织工程心脏瓣膜的研究逐渐成为心脏外科领域的研究热点之一.在去细胞同种、异种瓣膜支架的基础上构建的组织工程瓣膜,以其具有低免疫原性、无细胞毒性、植入体内后宿主细胞再细胞化程度高、较好的仿生性、耐久性和机械强度,尤其具有生长功能等多方面的优势,而成为未来组织工程心脏瓣膜研究发展的一个重要方向.本文对近年来去细胞组织工程心脏瓣膜的研究进展进行综述,并指出目前研究中所存在的问题.

在体制备大鼠全肾去细胞支架的程序性分析

目的 通过在体灌注Triton X-100、SDS溶液法制备大鼠全肾去细胞生物支架,并对支架制备过程中的关键步骤进行程序性检测、分析,为制备科学合理的实验用大鼠全肾去细胞生物支架提供基础.方法 SD大鼠40只,随机分为4组,每组10只.肝素化后直接切取肾脏作为对照组(control组);肝素PBS灌注组(H组);肝素PBS、Triton X-100灌注组(HT组);肝素PBS、Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)溶液灌注组(HTS组).HE、Masson、PAS染色及透射电镜观察各组肾组织病理及超微结构改变,免疫荧光结合4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)观察各组胶原蛋白Ⅳ(collagenⅣ)、层黏连蛋白(LN)、纤维连接蛋白(FN)、硫酸乙酰肝素蛋白多糖2(HSPG2)、弹性蛋白(elastin)及细胞核的表达情况,总DNA测定各组DNA残留浓度.结果 Triton X-100、SDS灌注6h左右制备大鼠肾脏去细胞生物支架.在灌注过程中,肾内细胞和细胞碎片逐渐被清洗,终变成半透明状.HE、Masson、PAS染色及透射电镜显示连续分布、形态排列类似肾小球、肾小管轮廓结构的网状结构,基膜连续完整.免疫荧光结合DAPI染色结果表明,去细胞过程中细胞外基质中的重要蛋白collagen IV、LN、FN、HSPG2、elastin都较好的得到了保存,细胞核在灌注过程中逐渐减少,直至完全消失;终残留组织的DNA为4.90μg/g.结论 通过合适浓度和灌注比例的Triton X-100、SDS制备大鼠肾脏去细胞生物支架,并对其进行程序性分析,发现能有效清除大鼠肾内所有细胞成分,较完整的保留网络状肾及肾血管细胞外基质结构和成分,是一种简单易行且较为理想的制备实验用全肾生物支架的方法.

大鼠胰腺去细胞天然支架生物相容性的鉴定

目的：通过离体灌注化学去垢剂的方法制备大鼠胰腺去细胞天然生物支架，并对支架的完整性、生物相容性进行检验。方法健康成年SD大鼠30只，分别经胆管与血管两条途径灌注十二烷基硫酸钠和曲亚通X-100等药品洗脱，获取胰腺去细胞生物支架。通过HE染色、扫描电子显微镜和透射电子显微镜等观察细胞残留于去细胞支架的生物学特性，分光光度计法鉴定残留去垢剂量，酶联免疫吸附剂测定法测定残留支架蛋白含量及生长因子，并用腹壁与皮下包埋实验检验其炎症反应，MTT法测定支架细胞毒性，内皮细胞共培养测定支架生物相容性。结果 HE染色、扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察均表明去细胞支架无细胞残留，细胞外支架连续性完好，脉管支架保存完整；药物残留小于规定标准；细胞外支架生长因子及支架蛋白存留量等指标上血管组均优于胆管组；腹壁与皮下包埋实验显示，去细胞支架炎性反应较对照组明显减轻；MTT法显示无细胞毒性；内皮细胞共培养有黏附趋势。结论使用两种灌注法制备胰腺去细胞生物支架，均可将细胞去除彻底，支架生物相容性好。但就血管组细胞外支架保留完整性，生长因子保留更多，则血管灌注途径优于胆管灌注途径。

离体大鼠胰腺去细胞生物支架的制备与鉴定

目的 通过离体灌注加浸泡的方法制备大鼠胰腺去细胞生物支架(PDBC),为胰岛和胰腺的组织工程研究提供新型天然生物支架. 方法 健康成年大鼠20只,以物理冻融及灌注洗脱法(脱氧胆酸钠+ DNAase),采用胆管、胰管联合逆向在体灌流法获取胰腺去细胞生物支架.并通过基因组DNA定量定性分析,组织化学染色、免疫荧光组织化学染色、荧光积分吸光度分析、透射电镜观察等进一步测定细胞残留以及观察去细胞支架,如胶原IV、纤维连接蛋白和层黏连蛋白等成分的保留. 结果 DNA定性分析显示,实验组未见明显DNA条带,对照组DNA条带可达100bp,定量检测实验组DNA残留不足对照组的5％；组织化学染色和透射电镜观察均表明,去细胞支架无细胞残留,细胞外支架连续性完好,脉管支架保存完整；免疫荧光结果表明,胶原蛋白、弹性蛋白等细胞外支架成分保留较完整,未见明显细胞核成分残留. 结论 运用冻融加浸泡灌注制备的胰腺去细胞生物支架,细胞去除彻底,细胞外支架保留完好.

大鼠单叶肝去细胞生物支架的制备与鉴定

目的 通过灌注法制备大鼠单叶肝去细胞生物支架,并对其进行鉴定.方法 健康成年SD大鼠20只,随机分为去细胞组和正常对照组,每组10只.去细胞组经门静脉灌胃针插管,恒温37℃依次灌注肝素化PBS溶液,1％ Triton X-100(pH 7.5～8.0)及PBS溶液.HE、Masson染色及扫描电子显微镜观察组织学及超微结构改变;免疫荧光结合4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)观察2组胶原蛋白Ⅳ和Ⅰ、层黏连蛋白和纤维连接蛋白观察细胞外基质的主要成分;DNA定性和定量分析组织中残留DNA浓度和片段长度;聚甲基丙烯酸甲酯铸型观察肝脏内血管分布情况.结果 Triton X-100灌注4h左右即可制备单叶肝脏去细胞生物支架.在灌注过程中,肝内细胞和细胞碎片逐渐被清洗,终变成半透明状.HE、Masson、免疫荧光染色及扫描电子显微镜显示,去细胞组肝生物支架较完整地保留了细胞外支架的成分,未见明显细胞及细胞核成分残留;去细胞组支架DNA残留量较正常对照组下降了97.32％,琼脂糖凝胶电泳未见明显的DNA条带.血管铸型标本显示,去细胞组血管分布与正常对照组相仿,其分支完整、清晰.结论 运用Triton X-100灌注法所制备的大鼠单叶肝生物支架去细胞彻底,较完整地保留细胞外基质和血管网络结构,是一种简单易行且较为理想的制备实验用单叶肝生物支架的方法.

去细胞全肾生物支架的制备与鉴定

目的 通过灌注加浸泡法制备全肾细胞外基质支架,并对该生物支架进行鉴定. 方法 健康成年SD大鼠20只,取肾,行肾动脉留置针插管,灌注压3.6mmHg,恒温37℃依次浸泡灌注肝素化PBS溶液、0.05％胰蛋白酶溶液、1％十二烷基硫酸钠(SDS)溶液、1％Trition X-100溶液以及含青、链霉素的PBS溶液.处理后,行DNA定量与定性分析,透射电镜、HE染色及免疫荧光观察残留细胞核成分,进一步丙烯腈-丁二烯-苯乙烯树脂(ABS)铸型观察肾内血管分布情况. 结果 去细胞组DNA含量较对照组下降了97％,琼脂糖凝胶电泳未见明显DNA条带；透射电镜、HE染色及免疫荧光观察去细胞组保留了大量细胞外基质,未见明显细胞核成分残留；铸型标本显示去细胞组血管较稀疏,分支完整、清晰. 结论 联合酶消化法与去垢剂洗涤法,经灌注加浸泡法处理的全肾,可有效清除肾内所有细胞成分,较好地保留细胞外基质支架和血管网络结构,是一种简单易行且较为理想的制备组织工程肾生物支架的方法.

骨膜去细胞生物支架的制备和鉴定

目的 制备兔骨膜去细胞生物支架,为骨缺损、骨不愈的组织工程研究提供天然的生物支架材料.方法 取健康新西兰大白兔,游离双侧胫骨近端内侧骨膜,通过物理冻融(-80℃,24h)、去污剂洗脱(triton-X 100、SDS)和酶消化(DNA酶、RNA酶)获取骨膜去细胞生物支架.通过HE染色、DAPI染色、琼脂糖电泳和基因组DNA定量分析(n=5)测定细胞结构及DNA成分残留;Masson染色和羟脯氨酸测定法(n=6)定性定量检测骨膜细胞外基质的主要成分(胶原)的保留情况;扫描电子显微镜下观察骨膜去细胞生物支架的表面微结构;CCK8法检测支架浸提液毒性;皮下包埋实验(n=4)观察该支架的免疫排斥反应.结果 HE染色和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色表明去细胞支架无残留细胞;琼脂糖电泳未见明显DNA条带;DNA定量检测显示组织去细胞率达95％以上;Masson染色及羟脯氨酸测定表明去细胞支架胶原成分被保留;扫描电子显微镜下细胞外基质呈现三维网状疏松结构;不同体积分数的浸提液对骨膜细胞的增殖与对照组(普通培养基)比较无明显抑制作用(P＞0.05);异体皮下包埋实验显示,该去细胞支架免疫排斥反应不明显.结论 运用物理冻融、去污剂洗脱和酶消化等方法所获取的骨膜去细胞生物支架细胞去除彻底,细胞外基质的结构及主要成分保留完好,生物相容性良好.

脑去细胞生物支架的制备与鉴定

通过化学萃取加震荡法制备脑去细胞外基质,并对其进行形态学分析和成分鉴定.健康成年SD大鼠20只,分成正常对照组和去细胞组.去细胞组大鼠经心脏灌流后取脑,通过化学萃取加震荡法,依次用3％的TritionX-100、1％的SDS、4％的脱氧胆酸钠震荡萃取,无菌蒸馏水漂洗制备脑去细胞外基质(dBECM).通过扫描电镜观察dBECM微观形态,用HE染色和荧光DAPI染色分析其去细胞化的效果,进一步通过Masson染色和免疫荧光染色进行成分的鉴定.通过HE染色及荧光DAPI染色可以发现,该方法去细胞化程度完全(去细胞程度大于99％),仅保留大量细胞外基质,未见明显的细胞及细胞核成分残留;Masson染色和免疫荧光染色发现,dBECM保留弹性蛋白(4.0％±1.1％)、层粘连蛋白(19.0％±1.6％)、纤维连接蛋白(9.0％±2.1％)、Ⅳ型胶原蛋白(16.0％±1.9％)等成分.化学萃取加震荡法可有效地去除大鼠脑组织内的细胞成分,制备得到的脑去细胞外基质较好地维持宏观和微观的三维结构,保留细胞外基质支架的蛋白成分,是一种简便且理想的脑去细胞外基质制备技术.

去细胞异种肌腱复合IGF-Ⅰ修复肌腱缺损的实验研究

目的 探索用去细胞异种肌腱复合胰岛素样生长因子Ⅰ (IGF-Ⅰ)修复肌腱缺损的可行性提供理论依据,为肌腱组织工程的细胞生长支架提供实验依据.方法 切取月龄(6个月)相同Leghorn鸡屈趾肌腱经化学去细胞处理后作为异种肌腱移植供体,健康成熟日本大耳白兔54只,建立双后肢跟腱中间束2cm缺损模型,随机分为3组,每组18只.实验组为去细胞异种肌腱复合IGF-Ⅰ移植组(A组)、对照组Ⅰ为自体肌腱移植组(B组)、对照组Ⅱ为单纯去细胞异种肌腱移植组(C组).术后伸直位管型石膏固定2周,术前3d10只兔及术后第3、7、14天每组10只兔取耳缘静脉血行血常规检测;2、4、9周每组取6只兔对标本行生物力学测定、组织学光镜检测及图像分析.结果 (1)在相同时期内,A、B、C三组血常规白细胞数两两比较差异无统计学意义(P＞0.05).(2)术后相同时间内三组生物力学两两比较,A组与B组之间无统计学差异(P＞0.05),A、B组与C组之间差异有统计学意义(P＜0.05),术后2周时肌腱大抗拉力差,9周时A、B两组大抗拉力接近正常水平.(3)肌腱移植后总体上经历了细胞长入、胶原纤维再生、替代和再塑形的过程,术后相同时间内三组胶原纤维含量两两比较,A、B组与C组之间差异有统计学意义(P＜0.05),A组与B组之间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 (1)化学去细胞肌腱可明显降低其免疫原性,移植后无明显的免疫排斥反应发生,其力学强度亦能满足肌腱移植的需要.(2)化学去细胞异种肌腱复合IGI-Ⅰ修复肌腱缺损的效果优于单纯化学去细胞异种肌腱的修复效果.

脉动流预适应增强组织工程心脏瓣叶上内皮细胞的黏附性

将受体的细胞种植于可降解材料或去细胞的异种或同种瓣膜上制成的组织工程心脏瓣膜无需抗凝,耐久性好,且有生长潜力,理论上是理想的心脏瓣膜替代物.但生理情况下,心脏瓣膜要受到高速、高压的血流冲击,简单的将内皮细胞种到瓣膜支架,经过血流冲击,细胞很快被冲掉.

去细胞结合光氧化技术处理牛颈静脉抗钙化性能研究

目的 探讨去细胞结合光氧化技术处理后的牛颈静脉带瓣管道(BJVC)在体内的抗钙化性能.方法 取新鲜牛颈静脉20根,每根裁出4个带瓣血管片,随机分为A、B、c、D 4组,分别以染料介导光氧化、戊二醛、去细胞及去细胞结合光氧化4种技术处理.建立大鼠皮下包埋模型,2个月后获取组织标本,原子吸收光谱法测定组织钙含量;并应用X线、CT、骨密度扫描检测整体组织钙化情况.结果 (1)D组试片标本形态较完整,柔韧性好,无结节样改变;其整体组织钙盐密度明显低于A组及B组,与C组接近.(2)D组管壁组织钙含量显著低于A组及B组(P＜0.01),与C组差异无统计学意义(P＞0.05);D组瓣膜组织的钙含量显著低于B组(P＜0.01),与A组及c组比较均差异无统计学意义(P＞0.05).结论 去细胞结合光氧化技术与传统戊二醛及染料介导光氧化技术比较,能明显提高牛颈静脉体内抗钙化性能.

骨髓诱导分化内皮细胞构建组织工程心脏瓣膜的实验研究

骨髓基质干细胞(BMSCs)在特定培养条件下能够诱导分化为内皮细胞[1,2],是构建组织工程心脏瓣膜(TEHV)较有前景的种子细胞来源.我们研究探讨应用BMSCs诱导分化的内皮细胞和猪去细胞瓣膜支架体外构建TEHV的可行性.

上皮-间质细胞转化与妇科肿瘤

肿瘤的转移机制可能为侵袭、血管内渗、外渗、黏附并定植[1],即肿瘤细胞失去细胞之间的黏附作用,获得移动能力,离开原位病灶,向邻近周围组织侵袭;肿瘤细胞穿透血管内皮基底膜,进入体循环并存活;肿瘤细胞在血管淋巴管内壁黏附,并形成微转移灶.近年来,上皮-间质细胞转化( epithelial-mesenchymal transition,EMT)在肿瘤侵袭、转移中的作用备受关注,但其机制仍不十分明确.本文对EMT在妇科肿瘤中的作用及其临床意义综述如下.

用去细胞基层皮片和胸锁乳突肌肌皮瓣重建咽部缺损

两种不同肺去细胞支架对人肺腺癌A549细胞α平滑肌肌动蛋白表达的影响

目的：观察正常及纤维化肺去细胞支架对人肺腺癌A549细胞α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达的影响。方法成年SD大鼠20只，按随机数字表法分为正常对照组与肺纤维化组各10只，肺纤维化组予博来霉素诱导建模，分别制备厚度为500μm的正常去细胞与纤维化肺去细胞支架。根据A549细胞植入的支架不同分成正常支架组和纤维化支架组，单独培养的无支架A549细胞设为无支架对照组，各组分别体外培养1周，免疫荧光染色检测各组A549细胞α-SMA蛋白表达，实时荧光定量-PCR检测细胞α-SMA mRNA表达。结果无支架对照组A549细胞α-SMA免疫荧光染色呈阳性表达，正常支架组与肺纤维化支架组免疫荧光染色呈弱阳性表达，其中肺纤维化支架组α-SMA免疫荧光强度显著低于正常支架组（ P＜0.05）；正常支架组、肺纤维化支架组α-SMA mRNA相对表达量均显著低于无支架对照组（0.70±0.11、0.55±0.12比1.28±0.21），且肺纤维化支架组显著低于正常支架组（均P＜0.05）。结论正常及纤维化肺去细胞支架在体外可不同程度下调A549细胞α-SMA表达，其中纤维化肺去细胞支架作用尤为明显。

RGD肽联合转化生长因子-β1对组织工程瓣膜构建的影响

细胞对支架的黏附和生长是构建组织工程心脏瓣膜(tissue engineering heart valve,TEHV)的关键环节.去细胞瓣被认为是一种较理想的TEHV支架[1,2],本实验率先采用RGD肽(精-甘-天冬氨酸,Arg-Gly-Asp)表面修饰以促进细胞黏附[3,4],联合种植转化生长因子-β1(TGF-β1)基因转染细胞以促进细胞及细胞外基质(ECM)增生,观察两种生物活性分子对去细胞瓣体外构建TEHV的影响.

组织器官去细胞的研究进展

经去细胞处理的组织和器官已广泛应用于组织工程和再生医学.组织去细胞的功效与组织来源和去细胞方法密切相关.每种处理方法都会不同程度地影响去细胞后遗留支架的生化组分、超微结构以及机械性能.进而影响宿主对支架材料的反应.拟对常用的去细胞方法及不同方法对生物支架的作用特点作一综述.

化学去细胞同种异体神经的研究进展

周围神经缺损的修复以自体神经移植效果佳.多年来,医学界不断寻找能替代自体神经的生物材料.Fawcett与Keynes[1]认为理想的神经移植体应具备以下特征:(1)无免疫抗原性;(2)能较快地获得血运;(3)再生轴突能长入并通过该移植体到达远端部位;(4)通过移植体的轴突能成熟到具有正常的直径、髓鞘化和传导动作电位;(5)移植体内再生轴突能准确到达靶器官.

去细胞坐骨神经天然支架的成分分析

背景 目前周围神经去细胞的方法较多,应用较多的是化学萃取法和液氮冻融法,但是化学萃取法耗时较长,而液氮冻融法则去除细胞不彻底.作者在查阅大量文献和多次实践的基础上,终确定了冻融+化学萃取+机械振荡的优化法对坐骨神经进行脱细胞处理.目的 对优化法制备的去细胞坐骨神经天然支架进行形态学分析,并对其成分进行鉴定.方法 取Wistar 大鼠双侧坐骨神经,随机分为2 组,对照组不做特殊处理,实验组用冻融+化学萃取+机械振荡的优化法进行脱细胞处理.结果 与结论 用优化法制备的去细胞坐骨神经天然支架呈三维管状立体结构,许旺细胞、髓鞘及轴突去除完全.经免疫组化鉴定,Ⅰ型、Ⅲ型胶原和层粘连蛋白等细胞外基质主要成分得到保留.

制备小鼠去细胞拟胚体对Lewis肺癌细胞的促分化作用

背景：胚胎干细胞或胚胎组织与癌细胞共培养，能够诱导癌细胞分化为正常上皮细胞或恶性程度降低，而去细胞拟胚体保留了胚胎组织的结构和重要细胞因子。
　　目的：成功制备一种来源于小鼠胚胎干细胞的去细胞拟胚体，探讨去细胞拟胚体在小鼠 Lewis 肺癌细胞体外三维培养中的作用。
　　方法：先将小鼠胚胎干细胞(D3)动态培养7 d后形成拟胚体，然后用十二烷基硫酸钠进行去细胞处理。小鼠Lewis肺癌细胞与去细胞拟胚体三维共培养7 d，对照组肺癌细胞在Matrigel上三维培养7 d。Ki67免疫组化染色检测细胞增殖情况，Western blot检测Paxilin，E-cadherin蛋白表达水平，RT-PCR检测Slug和E-cadherin mRNA表达水平。
　　结果与结论：①实验成功制备一种大小均匀的小鼠拟胚体，经十二烷基硫酸钠去细胞处理后，拟胚体的细胞成分完全去除；②小鼠Lewis肺癌细胞在Matrigel上三维培养7 d后形成球形的肿瘤多细胞球体， Ki67免疫组化染色阳性细胞比例高；小鼠Lewis肺癌细胞在去细胞拟胚体支架上三维培养7 d，可见肺癌细胞长入拟胚体，但Ki67阳性细胞比例明显降低；③相对于Matrigel组，去细胞拟胚体组的Paxil in吸光度小于Matrigel组(P<0.05)，而E-cadherin吸光度大于Matrigel组(P<0.05)；④去细胞拟胚体组的Slug mRNA表达明显低于Matrigel组(P<0.05)，而E-cadherin mRNA表达高于Matrigel组(P<0.05)；⑤结果表明，去细胞拟胚体对小鼠Lewis肺癌细胞在体外三维培养有促进分化作用。