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骨形态发生蛋白-2和转化生长因子-β1双基因共表达对骨髓基质细胞向软骨细胞分化基因表达的影响
目的 观察骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和转化生长因子-β1 (TGF-β1)双基因真核共表达载体对兔骨髓基质细胞(MSCs)向软骨细胞分化mRNA表达的影响。方法 pIRES-BMP-2-TGF-β1、pIREES-BMP-2 and pIRES-TGF-β1质粒通过质脂体介导转染MSCs,采用荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测MSCs内Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA的表达。结果 转染后2、4d双基因组MSCs内的Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达量60.4±10.1、606.0±88.5和42.6±6.0、411.2±73.6均明显高于转染后单一BMP-2(28.7±4.0、236.7±48.5和26.9±4.3、208.2±36.7)及TGF-β1(30.9±4.54、205.5±38.7和28.4±3.7、184.9±30.9)组(P＜0.05)。结论 pIRES-BMP-2-TGF-β1双基因真核共表达载体诱导MSCs向软骨细胞分化的作用强于单一基因BMP-2及TGF-β1。
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巨噬细胞LRG47/EBP50真核共表达质粒的构建及表达鉴定
目的:构建能共表达LRG47和EBP50的重组质粒pBud-LE,实现目的基因LRG47、EBP50在真核细胞中的表达,以便于后续从分子和细胞水平研究其抗结核分枝杆菌(Mtb)感染的效果和机制.方法:用RT-PCR方法从RAW264.7细胞中扩增获得小鼠的lrg47基因和ebp50基因,分步克隆入真核共表达质粒pBUDCE4.1中,构建真核共表达质粒pBud-LE.同时构建ebp50和红色荧光蛋白表达基因(rfp)的融合基因,置换pBud-LE中的ebp50基因,构建共表达LRG47和EBP50-RFP的重组质粒pBud-LER;将pBud-LE、pBud-LER通过脂质体转染入293T细胞,以pBud-LER转染观察转染效果,再分别采用RT-PCR和免疫印迹法鉴定质粒在真核细胞系中表达LRG47和EBP50的能力.结果:成功构建了真核共表达质粒pBud-LE和pBud-LER;转染293T细胞后,LRG47和EBP50在RNA水平和蛋白水平都明显升高.结论:成功的构建了真核共表达质粒pBud-LE.
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苯并[a]芘作用下HSP70、P53在人胚肺细胞中定位及共表达的研究
目的:探讨苯并[a]芘(BaP)作用下HSP70、P53在人胚肺细胞(HEL)中的定位及共表达.方法:培养正常人胚肺二倍体细胞,分别以0,10,50,100,200 μmol·L-1BaP染毒3 h,用双重免疫荧光组织化学法和激光扫描共聚焦显微镜检观察HSP70、P53的表达.结果:HEL细胞经不同浓度的BaP染毒3 h后,HSP70在胞浆、胞核均有表达,随BaP染毒浓度的增加,逐渐由细胞浆表达向核转移;而P53表达在胞浆、胞核均呈增加趋势(除200 μmol·L-1BaP外),胞核中P53蛋白表达水平略高于胞浆;小于50 μmol·L-1BaP处理的HEL细胞,HSP70和P53以细胞浆共表达为主,而BaP 浓度大于50μmol·L-1时,主要表现为胞核共表达.结论:BaP染毒的人胚肺细胞HSP70、P53的分布及定位方式具有浓度依赖的趋势,表现为随BaP染毒浓度的增加,HSP70与P53由胞浆共表达转变胞核共表达.
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H5N1禽流感病毒血凝素和神经氨酸酶基因在杆状病毒中的共表达
目的 构建共表达H5N1禽流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白的杆状病毒表达系统.方法 利用PCR方法分别扩增A/Hubei/1/2010(H5N1)病毒的HA和NA基因,克隆至经改造带有对虾白斑综合病毒(wSSv)早期启动子iel的mpFastBac Dual载体,构建mpFast Bac-HA-NA表达质粒,转化DH10Bac感受态细胞,用获得的Bacmid-HA-NA穿梭质粒转染sf9细胞,获得重组杆状病毒Bac-HA-NA;提取重组杆状病毒Bac-HA-NA的DNA并使用PCR方法检测;利用Western blot检测HA和NA表达,并分别检测重组杆状病毒Bac-HA-NA红细胞凝集能力和神经氨酸酶活性.结果 经PCR鉴定,构建的质粒Bacmid-HA-NA正确;Western blot检测表明Bacmid-HA-NA能在sf9细胞中有效表达HA和NA蛋白,生物活性检测表明Bac-HA-NA能引起红细胞凝集并具有神经氨酸酶活性.结论 获得了能同时表达禽流感病毒HA和NA的重组杆状病毒Bac-HA-NA,为进一步研究流感疫苗奠定了基础.
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Ⅰ,Ⅱ期宫颈癌组织HIF-1α与COX-2蛋白共表达对预后的影响及机制
目的 探讨Ⅰ,Ⅱ期宫颈癌组织中HIF-1α与COX-2蛋白的共表达对预后的影响及可能的机制.方法 免疫组织化学法分析71例宫颈癌标本的HIF-1 α和COX-2的共表达情况;RT-PCR法检测标本中HIF-1 α mRNA和COX-2 mRNA的表达水平.X 2检验分析不同表达组患者1、2和3年存活率的差异;采用KM生存分析法了解不同表达组患者的存活时间的差异;采用相关分析了解蛋白及mRNA表达水平的相关性.结果 HIF-1α和COX-2共表达组患者的3年存活率低于非共表达组(P ＜0.05);HIF-1 α和COX-2共表达组患者的存活时间低于非共表达组(P＜0.05);在Ⅱ期患者中,HIF-1 α的蛋白水平与COX-2mRNA的水平正相关(rs=0.594,P＜0.05).结论 在Ⅰ,Ⅱ期宫颈癌中,HIF-1α和COX-2共表达组预后较差;HIF-1 α蛋白可能正向调控COX-2mRNA的表达.
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卵巢癌中C-erbB2和CD44v5的表达及临床意义
目的 检测C-erbB2、CD44v5在卵巢肿瘤中的表达,分析这些分子的表达与肿瘤临床病理相关性,旨在为卵巢癌的发病及转移机制的探讨提供理论依据及其临床意义.方法 免疫组织化学s-P连接法检测C-erbB2、CD44v5 20例卵巢上皮良性肿瘤及41例卵巢癌中的表达.结果 C-erbB2和CD44v5在卵巢癌中的表达率均明显高于卵巢上皮良性肿瘤,差异极为显著(P＜0.01),C-erbB2表达率与表达强度在中、低分化组织高于高分化组织,两者相比差异极为显著(P＜0.01),CD44v5表达率与表达强度在淋巴转移者高于无淋巴转移者,相比差异极显著(P＜0.01),C-erbB2和CD44v5表达率、表达强度和共表达率在卵巢癌Ⅲ、Ⅳ期患者高于Ⅰ、Ⅱ期患者,且差异显著(P＜0.05).结论 C-erbB2和CD44v5分子卵巢癌的发生有关;C-erbB2分子过表达的癌细胞增生活跃,预示着差的预后;CD44v5在卵巢癌的淋巴转移过程中发挥一定作用;C-erbB2和CD44v5 2种分子在功能上可能存在联系,共同在卵巢癌的转移、浸润过程中发挥作用.联合检测C-erbB2和CD44v5在卵巢癌中的表达,对评价卵巢癌的恶性程度、转移及预后具有一定的临床价值.
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成人急性白血病中CD117与CD34共表达的临床意义
背景与目的:c-kit受体(c-kit receptor,c-kit R,CD117)是干细胞因子受体.CD117在急性非淋巴细胞白血病(acute non-lymphoblastic leukemia,ANLL)中高表达,可作为髓系免疫学标记物,对诊断ANLL有一定参考价值.但是,CD117也可在部分急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)中表达.CD34为造血干(祖)细胞抗原标记物,在ANLL和ALL中均有高表达.本研究旨在探讨CD117和CD34在急性白血病中共表达的临床意义.方法:采用流式细胞术(flow cytometery,FCM)分别检测92例ALL和81例ANLL初诊患者骨髓单个核细胞(BMMNC)CD117的阳性率和阳性细胞水平;比较ALL和ANLL患者CD117/CD34共表达率的差异,并比较ALL患者中CD117和CD117/CD34共表达率的差异.设立20例健康成人为对照组.结果:在ALL和ANLL患者中CD117阳性率分别为15.2%和71.6%,CD117/CD34共表达率分别为5.4%和55.5%,差异有显著性(P＜0.001).ALL患者中CD117表达率和CD117/CD34共表达率分别为15.2%和5.4%,差异有显著性(P=0.029).结论:CD117可作为急性白血病的MIC分型诊断之髓系免疫学标志,用以协助ANLL的临床诊断;较之CD117表达,CD117/CD34在ALL中的共表达率更低,可籍此协助排除ALL.
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一种检测同一部位两种蛋白共表达的新方法-CSA/SP双染色法
1993年,Key等开始尝试用两种不同种类的抗体检测同一组织或细胞的两种不同抗原,即双染色法[1],来检测同一组织或细胞不同部位表达的两种蛋白;利用两种蛋白在同一部位,其混合颜色与单独显示两种抗原颜色不一致,来推断两种蛋白是否共表达于同一部位.但是,由于两种抗原在同一部位,如果用常规免疫组化检测方法显示第一种抗原,其反应产物广泛沉淀,极易覆盖第二抗原的结合位点,从而影响第二抗原的检测反应.这一直是困扰双染色法检测的问题.
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7种RNA沉默抑制子对植物病毒载体表达系统表达水平的影响
目的 探索不同植物病毒RNA沉默抑制子对植物病毒载体表达系统重组蛋白表达水平的作用,为合理高效地利用这一新型的外源基因表达平台奠定基础.方法 构建了7种不同的RNA沉默抑制子瞬时表达载体,以农杆菌渗滤法,与马铃薯X病毒表达载体PVXdt-GFP共侵染寄主植物本明烟,通过对报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的荧光观察,并以Western blotting、ELISA 和RT-qPCR等测定GFP在烟草中的表达情况,分析不同RNA沉默抑制子对植物中外源基因表达水平的作用和特点.结果 7种病毒RNA沉默抑制子对外源基因GFP在烟草中表达水平的作用效果和持续时间存在差异,其中,番茄丛矮病毒的P19蛋白的增效作用好,作用时间也长；非洲木薯花叶病毒的AC2蛋白和水稻黄斑驳病毒的P1蛋白无明显的增效作用.结论 RNA沉默抑制子可以通过抑制病毒诱导的RNA沉默来提高外源基因在植物中的表达水平和表达持续时间,但是不同的植物病毒载体表达系统需要通过筛选获得其佳的共表达沉默抑制子“伴侣”.
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PDX1和BTC共表达的骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠糖尿病的实验研究
目的 观察共表达PDX-1和BTC基因的大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)植入1型糖尿病大鼠肾包膜下对糖尿病的治疗作用.方法 分离纯化SD大鼠MSCs,将pTRE2hyg-PDX1,pTRE2hyg-BTC 和pTet-On共同转染MSCs,诱导MSCs分化为胰岛样细胞(pancreatic islet-like cells PILCs),并移植到糖尿病大鼠肾包膜下,进行血糖、糖耐量实验、胰岛素的监测并作组织学分析.结果 PDX-1和BTC共表达的MSCs置于基础分化培养基7 d后,形成分泌胰岛素的PILCs,移植组在移植PILCs后,血糖水平明显降低,体内胰岛素水平明显上升,腹腔糖耐量试验接近正常水平,与假手术组的差异有统计学意义(P<0.05).移植组大鼠肾组织中检测到胰岛素的分泌.结论 通过基因工程技术可促使MSCs分化为胰岛样细胞,移植PILCs后能够有效改善糖尿病大鼠葡萄糖处理能力,缓解糖尿病症状,是一种糖尿病基因治疗的新途径.
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卵巢上皮性肿瘤中PTEN和survivin的表达及意义
目的:研究卵巢上皮性肿瘤中PTEN和survivin的表达.方法:采用免疫组织化学法检测PTEN和survivin在57例卵巢上皮性癌、20例卵巢良性上皮性肿瘤和10例正常卵巢组织标本中的表达.结果:卵巢上皮性癌中survivin的阳性表达率(64.91%)明显高于正常卵巢组织(0%)及卵巢良性上皮性瘤(0%),P＜0.01.卵巢上皮性癌中PTEN的阳性表达率(38.60%)明显低于正常卵巢组织(100%)及卵巢良性上皮性瘤(95.00%),P＜0.05;survivin的阳性表达、PTEN的阴性表达及survivin阳性与PTEN阴性的共表达与卵巢上皮性癌的临床分期、病理分级正相关(P＜0.05).结论:Survivin的表达上调及PTEN的表达下调与卵巢上皮性癌的发生相关,并且在卵巢上皮性癌的发生发展中有协同作用,联合检测其中的指标对于评价卵巢上皮性癌的恶性程度、转移及预后具有临床价值.
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共表达折叠调节因子对尿激酶功能性表达的影响
白的正确折叠,提高尿激酶表达产物的活性.
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T-bet和c-FLIP双基因共表达质粒的构建及生物学活性检测
目的 构建携带T-bet和c-FLIP双基因的真核表达载体及检测其生物学活性.方法 采用RT-PCR方法从人外周血淋巴细胞的总RNA中扩增出T-bet和c-FLIP cDNA,利用pIRES和pEGFP-C1,构建T-bet和c-FLIP双基因真核表达载体pEGFPT-bet-IRES-c-FLIP.采用非脂质体的脂质型介导载体将pEGFPT-bet-IRES-c-FLIP转染至外周血淋巴细胞,观察T-bet和c-FLIP在外周血淋巴细胞中的表达,并检测其诱导淋巴细胞的抗凋亡作用及Th1/Th2细胞偏移.结果 成功构建pEGFPT-bet-IRES-c-FLIP质粒,运用非脂质体的脂质型介导载体将该质粒转染淋巴细胞,其转染率为34.6%.流式细胞仪分析未经pEGFPT-bet-IRES-c-FLIP预处理的淋巴细胞在CH-11作用24 h后,细胞的凋亡率分别为(50.12±8.02)%;经pEGFPT-bet-IRES-c-FLIP预处理1 d的淋巴细胞,其细胞凋亡率分别下降到(5.73±0.37)%;双基因表达的淋巴细胞的Th1型细胞因子IFN-γ表达水平明显高于空载体表达的淋巴细胞及未经处理的淋巴细胞组(P<0.01),且Th2型细胞因子IL-4表达水平较空载体表达的淋巴细胞及未经处理的淋巴细胞低(P<0.01),差异有统计学意义.结论 转染T-bet和c-FLIP共表达基因后的T淋巴细胞可产生抗凋亡作用及向Th1细胞分化.
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雪旺细胞与神经元共培养时NGF、CNTF和GDNF mRNA共表达的计算机成像
目的研究雪旺细胞与背根节神经元共培养条件下多种神经营养因子共表达的计算机数字成像技术.方法运用多色荧光原位杂交技术和计算机图像处理技术, 对相同视野下分别采用绿、红、蓝单色滤光片摄取的NGF(绿)、CNTF(红)和GDNF(蓝)mRNA表达的荧光图像以及明视场细胞图像进行其共表达分布的图像合成.结果在单个雪旺细胞内同时显示出NGF、CNTF和GDNF mRNA表达所对应绿、红、蓝色区域及其在细胞相同部位同时表达所对应的由绿、红、蓝色混合而衍生的白、黄、紫红和浅蓝色区域.结论应用多色荧光原位杂交技术和计算机图像处理技术可对雪旺细胞中多种神经营养因子的共表达进行可视化研究.
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miRNA靶基因实验验证的研究进展
miRNAs是一大类非蛋白编码的小分子RNA,他们已成为基因表达的重要调节因子[1-3].目前已有约500个mRNAs被分离并鉴定[4].然而,目前有研究报道人类基因组中含有约1 000个miRNAs[5,6].miRNAs通过使其靶mRNAs的翻译抑制或降解来抑制基因表达[7-9].每个miRNA都有数百个进化上保守的靶基因,以及几倍的非保守的靶基因.目前估计人类30%的基因可能被miRNAs调控[10].
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SEA和B7-1基因真核共表达载体的构建及在B16细胞的表达
目的构建葡萄球菌肠毒素A(SEA)和小鼠B7-1基因真核共表达载体.方法采用PCR和RT-PCR方法分别克隆了带B7-1跨膜区的SEA(SEA-B7tm)和小鼠B7-1基因,中间通过内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site,IRES)序列的连接克隆至真核表达载体pcDNA3.1+.利用阳离子脂质体将重组质粒转染B16细胞,间接免疫荧光法检测B7-1和SEA分子在B16细胞膜表面的表达情况.结果测序结果与Genebank中公布的SEA、小鼠B7-1 cDNA序列相符,双标记间接免疫荧光检测结果表明B7-1、SEA同时在转染的B16细胞膜上表达.结论成功构建了SEA和小鼠B7-1真核共表达载体,为进一步研究SEA和B7-1联合应用抗肿瘤免疫治疗及其免疫机理奠定了基础.
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hVEGF_(165)及hBMP-7共表达重组腺相关病毒载体的体外生物学活性研究
目的 通过体外实验探讨hVEGF_(165)和hBMP-7共表达重组腺相关病毒载体(recombinant adeno-associated virus,rAAV)体外生物学活性,为体内应用其进行骨坏死的基因治疗奠定理论基础. 方法 分别采用rAAV-hVEGF_(165)-内部核糖体进入位点序列(internal ribosome entry site,IRES)-hBMP-7(实验组)、绿色荧光蛋白(green fluores-cent protein,GFP)标记的rAAv-IRES-GFP(对照组)转染体外培养的第3代兔BMSCs,于转染后1、2、3、7及14 d应用ELISA法及转染后14 d应用Western blot法鉴定两组hVEGF_(165)和hBMP-7表达;转染后14 d行细胞免疫荧光染色观察hVEGF_(165)和hBMP-7表达一致性.应用第3代人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)管状血管形成实验检测hVEGF_(165)蛋白活性.取第3代BMSCs行诱导成骨实验,Gomori钙钴法ALP染色及茜素红法钙盐染色检测hBMP-7蛋白活性. 结果 ELISA检测示随转染时间延长,两组hVEGF_(165)和hBMP-7表达逐渐升高;实验组各时间点hVEGF_(165)和hBMP-7表达量均明显高于对照组(P＜0.05).Western blot检测示实验组可见hVEGF_(165)和hBMP-7表达,对照组未见阳性表达.细胞免疫荧光染色观察示实验组hVEGF_(165)和hBMP-7染色呈阳性,表达部位和强度具有较好一致性;对照组未见阳性表达.HUVEC管状血管形成实验示实验组HUVEC拉长变形、出芽且相互交联成管状样结构;与对照组相比,管状血管数比较差异有统计学意义(P＜0.05).ALP染色见实验组细胞出现深染颗粒,对照组细胞内浅着色;与对照组相比,矿化结节数比较差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 双基因共表达rAAV-hVEGF_(165)-IRES-hBMP-7体外具有良好的生物学活性.
关键词： 重组腺相关病毒载体 hVEGF_(165) hBMP-7 共表达 生物学活性 -
融合头的改变对抑制重组抗菌肽毒性的影响
为进一步完善G13结构域的原核表达系统,人工合成编码G13的基因片段,PCR扩增后克隆于原核表达载体pET28a中,构建的重组质粒pET28a-G13转化于E.coli BL21(DE3)中.另外对pET28a-G13进行突变,改变其G13片段N端上游处的融合头的电荷数,转化于E.coli BL21(DE3)中.构建pThiohisA突变体并与pET28a-G13共转化于E.coli BL21(DE3)中.用诱导剂诱导所构建的各个工程菌,然后比较A_(600)值变化及蛋白表达量,分析不同的融合头对G13毒性抑制效果,发现融合头对G13毒性抑制效果与其净负电荷数及酸性氨基酸的相对位置有关.
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不相容双质粒共表达人内皮抑素及简化人纤溶酶原饼环区5
目的 构建人内皮抑素(human endostatin,hES)原核表达质粒pET28a/hES并与简化人纤溶酶原饼环区5(predigested human plasminogen kringle 5,predhPK-5)在大肠杆菌中实现共表达. 方法 RT-PCR法从人肝癌组织中扩增人内皮抑素基因,利用基因克隆技术构建原核表达质粒pET28a/hES.在卡那霉素与氨苄青霉素的选择压力下,将其与pGEX-1λT/predhPK-5共同转化E.coli BL21(DE3),并诱导表达重组蛋白.同时从连续培养时间与传代次数两方面检测了共转化子的稳定性. 结果 成功构建了重组质粒pET28a/hES,其与pGEX-1λT/predhPK-5的共转化子在双抗生素压力下可以共存,并在E.coli BL21(DE3)中成功共表达了人内皮抑素及简化的人纤溶酶原饼环区5,其表达量分别占蛋白总量的20%和21%.在双抗性培养基中培养16 h及传代120代,共转化子存活率均大于75%,具有较好的稳定性.结论 不相容质粒pET28a/hES与pGEX-1λT/predhPK-5在大肠杆菌中的成功共表达,对基因共表达方法作了有益探索,验证了不相容质粒共表达方法的可行性.
关键词： 抗血管生成 人内皮抑素 简化人纤溶酶原饼环区5 不相容质粒 共表达 -
慢性髓系白血病初诊患者M-bcr/abl与m-bcr/abl融合基因转录子共表达的临床意义
目的探讨慢性髓系白血病(CML)初诊患者M-bcr/abl与m-bcr/abl融合基因转录子共表达的临床意义.方法对111例初诊CML患者抽取骨髓,分离单个核细胞后,使用巢式PCR检测m-bcr/abl融合基因转录子的表达.结果111例CML患者M-bcr/abl和m-bcr/abl共表达率为51.4%;共表达与单M-bcr/abl阳性的初诊CML患者相比在血红蛋白浓度、白细胞数、中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)比例及积分、Ph染色体比例和肝脾肿大均无差异,仅血小板数差异有统计学意义(P＜o.05).b3a2型共表达患者血小板数比单M-bcr/abl阳性患者高(P＜0.05);b2a2型共表达和单表达患者比较差异均无统计学意义.有2例患者阴茎异常勃起,均为m-bcr/abl阴性CML患者.结论共表达m-bcr/abl的b3a2型初诊CML患者易有血小板数增高;共表达m-bcr/abl对b2a2型初诊CML患者的临床表现无影响.
