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不相容双质粒共表达大肠杆菌肉碱脱水酶基因caiB及其辅因子合成酶基因caiE
基因caiB和基因caiE分别编码肉碱脱水酶及其辅因子合成酶,携带这两个基因的重组菌可以共表达两个外源蛋白,得到高活性肉碱脱水酶.分别构建这两个基因的表达质粒pET28caiB和pET22caiE,利用双抗生素筛选法,获得能稳定遗传的双质粒转化子.经IPTG诱导,两个基因共表达,表达量分别占菌体总蛋白的39%和20%,共转化菌的酶活力比pET28caiB单转化菌提高了2.3倍,并由此建立了不相容双质粒共表达外源基因的新方法.
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不相容双质粒共表达人内皮抑素及简化人纤溶酶原饼环区5
目的 构建人内皮抑素(human endostatin,hES)原核表达质粒pET28a/hES并与简化人纤溶酶原饼环区5(predigested human plasminogen kringle 5,predhPK-5)在大肠杆菌中实现共表达. 方法 RT-PCR法从人肝癌组织中扩增人内皮抑素基因,利用基因克隆技术构建原核表达质粒pET28a/hES.在卡那霉素与氨苄青霉素的选择压力下,将其与pGEX-1λT/predhPK-5共同转化E.coli BL21(DE3),并诱导表达重组蛋白.同时从连续培养时间与传代次数两方面检测了共转化子的稳定性. 结果 成功构建了重组质粒pET28a/hES,其与pGEX-1λT/predhPK-5的共转化子在双抗生素压力下可以共存,并在E.coli BL21(DE3)中成功共表达了人内皮抑素及简化的人纤溶酶原饼环区5,其表达量分别占蛋白总量的20%和21%.在双抗性培养基中培养16 h及传代120代,共转化子存活率均大于75%,具有较好的稳定性.结论 不相容质粒pET28a/hES与pGEX-1λT/predhPK-5在大肠杆菌中的成功共表达,对基因共表达方法作了有益探索,验证了不相容质粒共表达方法的可行性.
关键词： 抗血管生成 人内皮抑素 简化人纤溶酶原饼环区5 不相容质粒 共表达
