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小颗粒低密度脂蛋白的分离、鉴定方法的建立
目的:建立分离、鉴定小颗粒低密度脂蛋白的方法.方法:常规密度梯度超速离心方法分离低密度脂蛋白,琼脂糖电泳鉴定其纯度;第2次密度梯度超速离心分别采用不同离心时间、不同梯度液分离制备小颗粒低密度脂蛋白;酶法测定脂蛋白的胆固醇浓度;Abbo折光仪测定密度,负染电镜观察颗粒大小.结果:第2次密度梯度超速离心时间设定为6小时的分离小颗粒低密度脂蛋白效果好;两种梯度液均适用;分离出小颗粒低密度脂蛋白符合密度范围1.040-1.063 g/ml,颗粒直径〈25.5nm的标准.结论:本文建立的2步法超速离心分离小颗粒低密度脂蛋白效果好,简化步骤并缩短时间,为大量制备小颗粒低密度脂蛋白提供可靠的方法.
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论职业病诊断鉴定程序的立法完善
职业病诊断鉴定程序在实践操作中颇受争议,笔者从举证责任分配不公、鉴定程序错位、救济手段模糊等方面分析存在的立法缺陷,提出合理分配举证责任、科学设置鉴定程序、明确终救济手段,实现程序完善,达到劳动者与用人单位的利益平衡.
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1株少见新型隐球菌的分离和鉴定
我于2000年10月从一患者脑脊液中涂片及分离培养中检出新型隐球菌,此菌较少见.现报道如下.
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GⅡ.3型诺如病毒重组衣壳蛋白的表达和纯化鉴定
目的 通过杆状病毒表达系统,获取高纯度GⅡ.3型诺如病毒重组衣壳蛋白,为制备抗GⅡ.3型诺如病毒单克隆和多克隆抗体提供免疫原.方法 将GⅡ.3型诺如病毒衣壳蛋白基因片段修饰后插入pHTA表达载体中,经测序鉴定,将鉴定正确的重组质粒转化到MAX Efficiency(R)DH10BacTM感受态细胞中,获取表达杆粒并转染SF9细胞,表达GⅡ.3型诺如病毒重组衣壳蛋白.重组蛋白用Ni-NTA His蛋白亲和柱纯化,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹(Western blot)方法鉴定.结果 SDS-PAGE和Western blot结果表达了分子量约为60 kDa的重组蛋白,动物试验表明重组蛋白具有较好的免疫原性,为制备抗GⅡ.3型诺如病毒单克隆抗体和多克隆抗体、建立相应的免疫学检测方法奠定了基础.结论 构建了GⅡ.3型诺如病毒衣壳蛋白表达载体,并获得GⅡ.3型诺如病毒重组衣壳蛋白.
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浓缩乳清蛋白粉及其制品中梭状芽胞杆菌的分离及鉴定
目的 采用多种方法对新西兰进口浓缩乳清蛋白粉及其制品、市售婴幼儿配方粉样品中分离的梭状芽胞杆菌进行鉴定.方法 根据分离菌株的生长特性、革兰氏染色、生化反应、普通显微镜和电子显微镜下形态特征等表型特征,结合16S rRNA基因克隆测序及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱等结果,对分离菌株进行综合鉴定.结果 78份样品中有16份(20.5％)被梭状芽胞杆菌污染,其中2份为浓缩乳清蛋白粉及其制品,14份为婴幼儿配方粉样品.共分离到梭状芽胞杆菌17株,包括生胞梭菌12株、拜氏梭菌2株,丁酸梭菌2株和第三梭菌1株.结论 新西兰进口浓缩乳清蛋白粉及其制品中厌氧微生物污染严重,经鉴定污染的主要微生物为生胞梭菌.
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牛奶主要过敏原β-乳球蛋白的一基因片段的克隆、表达、纯化及抗原性鉴定
目的 克隆并表达牛奶中主要过敏原β-乳球蛋白(β-LG)的一基因片段,并检测其杭原性.方法 利用RT-PCR技术克隆β-LG蛋白基因片段,测序后将目的片段克隆入原核表达质粗pET载体,转化至大肠杆菌origami,经IPTG诱导表达,获得重组β-LG片段蛋白.用Nit~2+亲和层析柱纯化,用Western blot和ELLSA检测重组蛋白与牛奶过敏患者血清IgE的结合活性.结果 克隆获得β-LG片段蛋白,其开放阅读框基因为264 by(含终止密码子),编码87个氨基酸.获得的重组β-LG片段蛋白既以包涵体形式存在又以可溶性形式存在,用可溶性的蛋白进行纯化,经Western blot和ELISA检测具有较好的抗原性.结论 成功地克隆和表达了β-LG的--基因片段,为后续牛奶的免疫原性研究提供参考,也为研制牛奶主要过敏原的单克隆抗体和制备其主要过敏原的检测试剂奠定了基础.
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基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术对阪崎克罗诺杆菌的鉴定及溯源
目的 研究不同样品前处理方法对VITEK(R)基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(VITEK(R) MALDI-TOFMS,以下简称VITEK MS)鉴定阪崎克罗诺杆菌的影响及该方法对阪崎克罗诺杆菌的分型溯源能力,研究VITEKMS与MALDI 7090TMMALDI-TOF/TOF MS(以下简称MALDI 7090)所得图谱的异同.方法 选取3种不同样品前处理方法处理18株阪崎克罗诺杆菌野生菌株、2株阪崎克罗诺杆菌标准菌株和2株非阪崎克罗诺杆菌标准菌株,比较VITEK MS鉴定结果与传统鉴定结果的一致性;通过VITEK MS的鉴定结果和图谱的比对,研究不同样品前处理方法对阪崎克罗诺杆菌鉴定的影响;利用VITEK MS质谱图特征峰的聚类分析,对20株阪崎克罗诺杆菌进行溯源研究;同时比较VITEK MS与MALDI 7090所得图谱,研究两者的异同.结果 20株试验菌株的VITEK MS鉴定结果均为阪崎克罗诺杆菌,与传统的鉴定结果一致,并与2株非阪崎克罗诺杆菌标准菌株能明显地区分;3种不同样品前处理方法得到的鉴定谱图与标准谱图比对获得的鉴定结果可信度之间差异无统计学意义(P＞0.05),但质谱图中质谱峰数量和相对峰强度有明显差异,其中甲酸提取法在2 000～ 15 000 m/z范围内,相对峰强度＞5 mV的质谱峰数量达15个以上.在相似水平为80％的条件下,VITEK MS的聚类分析将甲酸提取法的20株阪崎克罗诺杆菌分为5个群,通过聚类分析及菌株来源能够推测阪崎克罗诺杆菌传播途径.VITEK MS和MALDI 7090得到的谱图,两者特征峰的出峰位置与相对峰强度无明显差异.结论 MALDI-TOF MS技术可以准确鉴定阪崎克罗诺杆菌:甲酸提取法更适用于阪崎克罗诺杆菌的MALDI-TOF MS鉴定;MALDI-TOF MS技术对阪崎克罗诺杆菌的溯源研究具有重要价值;VITEK MS与MALDI 7090所得谱图无明显差异.
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广西市售婴儿食品中克罗诺菌分离株基因特征及进化分类鉴定
目的 分析广西市售婴儿食品中的克罗诺菌分离株的种类、表型和基因特性.方法 将保存的试验菌株进行复苏,通过API 20E生化条和ompA基因扩增检测进行初步鉴定,扩增16S rRNA基因后进行测序,将获得的全16S rRNA基因序列在GeneBank数据库上比对,构建进化树,确认是否为克罗诺菌.将试验菌接种于显色平板观察其表型和黄色素的产生情况,通过手工生化进行分型,确定其种属.结果 9株分离菌确定为克罗诺菌,有5种生化型,属于4个克罗诺种.检出Cronobacter sakazakii 6株菌,C.malonaticus、C.muytjensii和C.dublinensis各有1株;7株菌符合API 20E鉴定结果,9株分离菌均可检测到ompA基因.结论 广西市售婴儿食品中克罗诺菌的污染以C.sakazakii为主,生化表型、种属及基因型具有多样性;鉴定时仅以单一的生化或其他表型作为判别依据存在很大的局限,需辅以分子生物学手段加以鉴别.
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COI及cytb基因对河鲀鱼鱼种鉴定的适用性研究
目的 建立河鲀鱼DNA条形码鉴定方法,探讨细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COI)及细胞色素b(cytb)基因对我国常见东方鲀属、兔头鲀属河鲀鱼鱼种鉴定的适用性.方法 野捕河鲀鱼经形态学鉴定后,钓取COI及cytb基因序列并测序.从GenBank下载已有河鲀鱼参考序列,分别构建COI及cytb基因分子进化树,确定样品种属并与形态学鉴定比对.应用所建方法对中毒样品进行河鲀成分鉴定.结果 COI和cytb基因分子进化树将57份样品聚类到东方鲀属和兔头鲀属的9个鱼种,除棕斑兔头鲀和暗鳍兔头鲀(COI进化树)、暗纹东方鲀和晕环东方鲀(cytb 进化树)外,2种条形码均能对其余鱼种进行有效区分.中毒样品经鉴定均含有月兔头鲀.结论 所建立的DNA条形码方法可有效鉴定河鲀鱼鱼种,弥补形态学鉴定的缺陷.
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多重PCR鉴定动物源空肠弯曲菌和结肠弯曲菌方法的建立
目的 建立鉴定空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的多重PCR(mPCR)方法.方法 分别以16S rRNA、马尿酸酶和16S-23S rRNA基因为靶序列设计特异性引物,建立多重PCR方法检测37株菌株样品,同时采用in gene CAMnested PCR检测试剂盒检测验证,进行结果比较分析.结果 该多重PCR方法可扩增出空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的特异性条带,其他对照菌株均未扩增出条带,具有较好的特异性;检测敏感性可达0.81 pg/μl空肠弯曲菌DNA,0.93 pg/μl结肠弯曲菌DNA.多重PCR方法和试剂盒检测结果的符合率为100％,二者与国标GB/T 4789.9-2008方法的符合率达97％以上.结论 本试验建立的多重PCR方法操作快速方便、节约试验成本,具有较好的特异性、敏感性和重复性,可用于弯曲菌的鉴定.
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生肉中单核细胞增生性李斯特菌的分离与鉴定
目的 了解哈尔滨市售生肉中单核细胞增生性李斯特菌的污染状况.方法 将显色培养基法、API试剂条法和PCR法联合应用对哈尔滨市售128份生肉进行单核细胞增生性李斯特菌的分离鉴定.结果 共分离出单核细胞增生性李斯特菌18株,检出率为14.06%.其中生猪肉检出率高,达20.00%.结论 哈尔滨市售生肉中单核细胞增生性李斯特菌污染状况比较严重,应引起有关部门的重视,加强管理和监测.
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淀粉及面制品中“吊白块”的鉴定试验探讨
"吊白块"原名甲醛次硫酸氢钠[(CH-2OHSO-2Na)*2H-2O],是一种工业漂白剂,在一定条件下分解产生甲醛和次硫酸氢钠,具有很强的漂白作用.人若误食"吊白块"会损伤肾脏,危害身体健康.国家严禁将"吊白块"掺入食品.但近年来,仍有食品生产经营者在加工面粉、淀粉等食品过程中,掺入少量"吊白块".因此,鉴定食品中是否掺有"吊白块",是当前整顿社会主义市场经济秩序、打击制假、售假和保护人民安全的一项重要任务.
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水产品中溶藻弧菌基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱快速鉴定方法建立
目的 建立水产品中溶藻弧菌的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)的快速鉴定方法.方法 以溶藻弧菌标准菌株(CICC 10889)为研究对象,采集不同样品处理方法(直接涂抹法和甲酸提取法)、激光强度和菌株传代次数的MALDI-TOF MS图谱并加以分析比较,探讨上述因素对方法准确性的影响.将溶藻弧菌标准菌株(CICC 10889)的MALDI-TOF MS图谱主产物(MSP)添加到数据库中,使用36株分离菌株及8株与溶藻弧菌近缘的弧菌标准菌株验证数据库的补充对鉴定结果可信度的影响.结果 甲酸提取法处理所得图谱特征峰多、基线平滑、信噪比高,图谱质量优于直接涂抹法;激光强度对MALDI-TOF MS图谱有影响,过高或过低均会导致图谱质量的下降;标准菌株补充数据库后可提高鉴定可信度,分离株的鉴定分值均达到2.300以上;传代次数对鉴定结果没有影响.结论 MALDI-TOF MS方法可将溶藻弧菌准确鉴定到种水平.该方法准确、可靠,可用于溶藻弧菌的快速鉴定.
关键词： 溶藻弧菌 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 鉴定 影响因素 水产品 -
GC/MS选择离子检测法鉴定污染食物中的毒鼠强
毒鼠强又称424,是一种急性剧毒杀鼠药,化学名称为四次甲基二砜四胺.其化学性质稳定,对所有温血动物有剧毒,可在生物体内蓄集,极易造成二次中毒.在环境中存在可达4年之久.国家有关部门已严令禁止使用.但是市场上仍有销售含有毒鼠强的鼠药.人畜误食屡有发生.本文论述了用GC/MS选择离子监测法鉴定污染食物中的毒鼠强.定性准确,灵敏度高.
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实时荧光PCR法快速检测肉类中貉源性成分
目的 建立貉源性成分的实时荧光PCR快速检测手段.方法 根据貉的线粒体Cytb基因序列设计引物和探针,通过优化扩增反应体系进行实时荧光PCR(RT-PCR)扩增,产物进行快速检测.结果 此方法特异性良好,灵敏度可达到10-4ng貉源性DNA的量.在混合或纯肉样品以及常见的肉制品中均可检测.结论 本方法可以满足实际工作中肉类掺假检测的要求.
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用Cytb基因序列分析鉴定肉制品掺假
目的 采用Cytb基因进行肉制品真伪鉴定的尝试性探索.方法 随机采集21份肉制品样品,首先采用CTAB法方法提取样品DNA,基于Cytb基因的通用引物对21份样品DNA进行PCR扩增,把扩增产物进行测序,然后采用DNAMAN软件进行序列的比对分析.结果 CTAB方法适合肉制品的DNA提取.10份牛肉样品中9份与标注吻合,1份检测出是猪肉;2份羊肉样品中1份与标注吻合,1份检测是猪肉;2份猪肉样品中1份与标注吻合,1份检测是鸡肉;1份鸡肉样品与标注吻合;6份牦牛肉样品中2份与标注吻合,4份检测是水牛肉.结论 用Cytb基因序列分析比对方法适合肉制品的真伪鉴定,市场上内制品存在掺假问题.
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一起民事诉讼案中有关食品查封、保全问题的探讨
1案情简介1998年9月18日下午嘉兴市正泰食品有限公司(下称正泰公司)来人反映,该公司前期从安徽省界首市光武食品站(下称食品站)购进的11 t咸猪腿已发臭,要求我局封存、鉴定.9月19日上午我局监督员前往现场调查,发现11 t咸猪腿已于9月16日被界首市人民法院(下称界首法院)查封(扣押),此时正要运往界首市,实行异地封存(扣押).原来,食品站因与正泰公司有购销合同纠纷,于9月14日向界首法院提请财产保全.我局提出对界首法院封存的咸猪腿进行抽检,界首法院表示,不管这批咸猪腿卫生质量如何,他们都要拉走,并将请界首市卫生监督机构鉴定.在场的我市秀城区法院的法官及正泰公司的律师均无异议,我们只能要求反馈该批肉品的终处理结果,至今无回音.
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2011年北京市38批保健食品中污染菌的分离与鉴定
目的 了解保健食品中污染菌的种类和特点.方法 按照食品安全国家标准GB 4789-2010对38批次的保健食品进行检验,采用全自动细菌鉴定系统对污染菌进行鉴定.结果 从38批次的保健食品中分离、鉴定出69株污染菌,在大肠菌群、沙门菌和金黄色葡萄球菌的检验过程中分离得到致病菌和条件致病菌.结论 需从控制原料、控制生产环境以及严格消毒灭菌三方面提高保健食品的卫生质量.
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椰毒假单胞菌酵米面亚种食物中毒的病原分离鉴定
目的 通过对食物中毒病原菌的分离鉴定,为查明中毒原因提供科学依据.方法 分离鉴定和毒性试验按照国家标准方法WS/T 12-1996《椰毒假单胞菌酵米面亚种食物中毒诊断标准及处理原则》和GB/T 4789.29-2003《食品卫生微生物学检验椰毒假单胞菌酵米面亚种检验》进行.米酵菌酸检测按照GB/T 11675-2003《银耳卫生标准》执行,采用液相色谱-质谱联用法对样品开展检测.结果 经VITEK 2 COMPACT全自动微生物生化鉴定仪和基因指纹鉴定仪进行鉴定,4份样品中3份鉴定结果为唐菖蒲伯克霍尔德菌,小鼠毒性试验阳性.4份样品均检测出米酵菌酸.结论 本次食物中毒源于食源性椰毒假单胞菌酵米面亚种污染.
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非脱羧勒克菌YT-1107生理生化特性研究及16S rRNA序列分析
目的 菌株YT-1107是一株从污染食物中分离得到的非脱羧勒克菌,对其进行生理生化特性研究及16S rRNA序列分析确定其归属.方法 根据流行病学调查及临床表现,选择疑似病原菌,用ATB微生物自动鉴定系统对采集的样品进行病原菌分离与鉴定.对菌株的16S rRNA基因测序结果进行同源性分析,采用MEGA4.0软件的Neighbor-Joining方法构建系统发育树.结果 对该菌株生理生化特征的研究及16S rRNA序列分析表明,该菌株是革兰阴性菌,属于Enterobacter asburiae.结论 通过16S rRNA基因序列的同源性比对,系统进化树的构建,初步认定菌株YT-1107与Enterobacter asburiae LF7a为同一物种.
