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荧光MAPREC分析Ⅰ型Sabin株脊髓灰质炎病毒突变率方法的建立和应用
目的 使用CY5荧光标记引物建立定量检测Ⅰ型Sabin株脊髓灰质炎病毒480-A和525-C突变率的MA-PREC.方法 提取Ⅰ型Sabin株脊髓灰质炎病毒样品RNA,反转录合成cDNA后,进行非对称PCR扩增以生成单链DNA,之后采用CY5荧光标记引物进行一步扩增反应以合成双链产物,以DNA内切酶Dde Ⅰ和Nci Ⅰ酶切后电泳分离,获取荧光信号,计算样品的突变率.检测4个国际标准品(100% DNA突变标准品、IS DNA标准品、LMVR标准品和HMVR标准品)的突变率,重复5次,验证方法的准确性和精密度,并进行初步应用.结果 使用CY5荧光标记引物,建立了定量检测Ⅰ型Sabin株脊髓灰质炎病毒480-A和525-C突变率的MAPREC.100% DNA突变标准品、IS DNA标准品、LMVR标准品以及HMVR标准品的标示值分别为100.00%、2.00%、1.84%、2.56%,检测结果分别为95.09%、2.06%、1.45%、1.92%,各标准品的实验间CV值均<15%.Ⅰ型Sabin株口服脊髓灰质炎减毒活疫苗工作种子、单次收获液和原液的突变率为1.05%~1.22%,批间一致性良好.结论 初步建立了基于荧光素标记的MAPREC,可以代替同位素法进行Ⅰ型Sabin株脊髓灰质炎病毒突变率的定量检测.
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miR-122靶向示踪载体 FA-OCC-QDs 的生物学功能
目的:明确小分子 RNA-122(miR-122)靶向示踪载体 FA-OCC-QDs 的生物学功能。方法通过化学修饰得到了带有正电荷的叶酸靶向性双亲壳聚糖衍生物 N-辛基 O-羧甲基壳聚糖(FA-OCC),并通过其疏水腔包裹 CdSe 量子点获得了一种新型靶向性的示踪壳聚糖衍生物FA-OCC-QDs。通过显微结构观察、荧光波长扫描、zeta 电位测定等方法考察 FA-OCC-QDs 的物理及光学活性,并对其靶向性、细胞摄取效率、转染效率及细胞毒性等生物学活性进行考察。结果FA-OCC-QDS具有靶向性高、转染效率高及细胞毒性小的特点。结论小分子 RNA 靶向示踪载体 FA-OCC-QDs 可作为靶向示踪的 miRNA 载体,为后续小分子 RNA 的基础研究提供有利的工具。
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基因芯片及其在肿瘤研究中的应用
基因芯片技术是将成千上万个寡核苷酸序列或cDNA序列规律的排列在1~2cm2的支持物上,然后将荧光标记的样本DNA/mRNA与芯片杂交,并用计算机对杂交信号作出检测从而研究基因表达谱.目前,基因芯片在肿瘤诊断中的应用主要包括肿瘤的分子学分类,预测肿瘤对某些化疗或激素治疗的敏感性,肿瘤的分期,发现新的治疗靶点等方面.本文还对基因芯片的应用前景作一简要介绍.
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大鼠神经干细胞的荧光标记及脑内移植
增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)是绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的人工改造型,在蓝色光(波长488 nm)激发下可以稳定地发出绿色荧光,以EGFP示踪是目前细胞生物学示踪剂研究中的一种重要手段[1].笔者分离培养了胚胎大鼠神经干细胞(neural stem cells,NSCs),以逆转录病毒介导EGFP进行标记,探索标记方法的可行性以及EGFP对NSCs正常功能有无影响.并做标记细胞脑内移植实验,探讨EGFP在NSCs脑内移植中的示踪作用.
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定量检测Ⅲ型Sabin株脊髓灰质病毒突变的荧光MAPREC法的建立和应用
目的:使用荧光标记代替同位素标记,建立定量检测Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎病毒472位U到C突变比例的MAPREC(mutant analysis by PCR and restriction enzyme cleavage)法.方法:提取病毒样品RNA,反转录合成cDNA后进行非对称PCR反应以生成单链DNA扩增产物,之后采用荧光标记引物进行扩增,合成双链产物,以突变位点敏感的限制性内切酶作用后电泳分离,并分析样品的突变比例.结果:采用建立的方法对4个国际标准品进行检测,100% DNA突变标准品、IS DNA标准品、LMVR标准品以及HMVR标准品的标示值分别为100%、0.9%、0.7%、1.1%,检测结果分别为95.59%、0.84%、0.68%、1.07%,与其标示值一致性良好,并且不同实验间RSD均小于15%.检测9个批次样品,结果突变率均小于1%,符合WHO要求.结论:初步建立了基于荧光素标记的MAPREC方法,可以代替同位素法进行病毒突变的定量检测.
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3个miniSTR基因座四色荧光复合分型体系的构建及应用
目的 建立D3S3053、D6S474、D20S482(扩增片段<150bp)3个miniSTR基因座四色荧光复合分型体系,用于高度降解DNA样本的基因分型.方法 采用6-FAM、HEX、TAMRA荧光染料标记D20S482、D3S3053、D6S474基因座上游引物,构建并优化复合扩增体系,在ABI 310遗传分析仪卜对扩增产物进行电泳分析,Genemapper 3.2软件分析产物片段大小并进行分型.采用上述体系对120份河北汉族健康无关个体血样进行检测,并计算群体遗传学参数.比较该体系与ID试剂盒用于高度降解检材的成功率及灵敏度.结果 D3S3053、D6s474、D20S482 3个miniSTR基因座荧光标记复合扩增分型体系稳定可靠,灵敏度达50pg,用于高度降解检材分析的成功率明显高于ID试剂盒.3个基因座在河北汉族人群中的累积个人识别能力为0.998,累积非父排除率为0.84.结论 该系统可用于分析高度降解DNA样本的基因分型,进行法医学个人识别和亲权鉴定.
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8个miniSTR基因座复合扩增系统的建立及其应用
目的 建立扩增片段<200bp,包含CSFIPO,TH01,TPOX,D3S1358,FGA,D7S820,D21S11,PentaD 8个miniSTR基因座的复合扩增体系.方法 采用四色荧光染料标记引物,PCR扩增后,应用ABI3130遗传分析仪进行片段长度分析,对280例无关个体,137例疑难生物物证进行了检验.结果 280例无关个体的调查结果为除1例在CSFIPO基因座外,其余样本的各基因座分型结果与AmpFLSTR ldentifiler试剂盒完全相同.与应用ID试剂盒比较,明显提高了137例疑难生物物证的榆出率.结论 该检测技术方法稳定,结果准确,重复性好,且其判型结果可进行DNA数据库查询、比对,为刑事案件及灾难事故中疑难生物物证的检验提供了一条新的途径.
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荧光标记STR分型技术检验腐败组织基因型
探讨腐败组织荧光标记STR分型检测技术的应用价值.应用含12个STR基因座及一个性别基因座的2个荧光标记的复合扩增系统,对40例1~6周的腐败肌肉提取的DNA进行扩增,用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,PE377测序仪分析基因型.所检测样本在12个STR基因座均扩增出特异性谱带,并可判定其基因型.荧光标记STR检测技术对腐败组织分型可靠,在实际检案中具有较高的应用价值.
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荧光标记STR分型进行烟蒂的个人识别
荧光标记STR复合扩增技术在法医物证中的成功应用,极大地拓展了法医物证检验范围,使微量生物检材个体认定成为可能[1].
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天津地区汉族群体4个STR基因座频率调查
应用荧光标记复合扩增技术对天津地区汉族群体202名无关个体进行了LPL、F13B、FESFPS、F13A01 4个STR基因座检测,得到了上述基因座在天津汉族群体中的基因频率及其统计学数据,现报告如下.
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广西地区回族人群15个STR基因座的多态性调查
应用AmpFISTR Identifi1erTM荧光标记复合扩增系统对286例广西回族无关个体血样DNA进行15个STR基因座的多态性调查,获得了广西回族群体遗传学调查数据,现报道如下.
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深圳地区汉族人群13个STR基因座的遗传多态性
运用荧光标记、复合扩增、ABI3100型基因分析仪电泳、自动荧光检测分型,对居住深圳地区的205个汉族无关个体的D3S1358、vWA、FGA、D8S1179、D21S11、D18S51、D5S818、D13S317、D16S539、TH01、TPOX、CSF1PO、D7S820等13个STR基因座进行了群体遗传多态性分析,获得上述13个STR基因座的频率分布资料,得到多项群体遗传学参数,现报道如下.
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天津地区汉族群体9个STR基因座的频率调查
采用荧光标记复合扩增技术[1],对天津地区汉族260名无关个体进行了D3S1358、D21S11、D5S818、D13S17、D18S51、D7S820、vWA、FGA、D8S1179等9个STR基因座检测后,得到该地区汉族群体各基因座的基因频率及其相关统计数据,现报道如下.
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广西地区京族人群9个STR基因座遗传多态性
286例广西地区京族人群无关个体血样,采用Chelex-100的方法提取DNA,荧光标记复合扩增系统Profiler Plus Kit(ABI公司)扩增D8S1179、D21S11、 D18S51、D3S1358、VWA、 FGA、D5S818、D13S317、D7S820 等 9个 STR 基因座,ASI 377-96全自动测序仪对扩增产物进行检测,Geno Typer软件进行基因分型.
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广州地区汉族人群Penta D及Penta E STR基因座频率
应用PowerPlexTM16 system(Promega)荧光标记复合扩增试剂盒对广州地区汉族无关个体进行遗传多态性调查,报道如下.
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浙江汉族人群9个STR基因座的遗传多态性调查
利用四色荧光标记复合扩增的方法,在同一反应管内复合扩增D3S1358、vWA、FGA、D8S1179、D21S11、D18S51、D5S818、D13S317及D7S820九个STR基因座.扩增产物用ABl310型基因分析仪进行毛细管电泳分离,自动荧光检测予以分型.经对200名浙江汉族无关个体进行群体遗传学调查,获得该9个STR基因座的频率分布,以及各基因座的杂合度(H)、个人识别能力(DP)、偶合率(PM)、非父排除率(EPP)和多态性信息总量(PIC)等群体遗传学参数,为法医学应用提供理论依据,现报告如下.
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荧光标记复合扩增对中国汉族群体8个STR基因座的多态性
应用STR复合扩增技术对FBI推荐的8个SFR基因座,即D5S818,D13S317,D7S820,D16S539,vWA,TH01,TPOX,CSF1PO,进行荧光复合扩增,其产物经ABI377XL序列分析仪检测,对110名中国汉人无关个体进行频率调查,为大规模DNA数据库的建立提供有益探索.
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P30试验阴性检出精子基因型1例
1 案例某男怀疑其女友有外遇,自行提取女友黑色三角内裤一件送检,要求检验是否含人精斑.接案后,按照精斑检验常规,进行酸性磷酸酶(磷酸苯二钠)预试验和胶体金P30抗原检测试剂条(购自公安部物证鉴定中心)试验,结果均呈阴性,阴阳性对照结果准确.沉渣涂片,HE染色,镜下见有大量精子,透明顶体明显,大小一致,未能见明显尾部;分步消化后用硅珠法提取DNA,经荧光标记STR复合扩增技术,检出样品中15个位点的男性DNA.
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酸性磷酸酶及P30试验阴性检出精子基因型1例
1案例某年3月14日,某县一女青年被害,现场在距公路数十米的田地里,死者头部被打出血,衣着不整,初步分析系拦路抢劫强奸杀人.现场提取的大量血痕、毛发经检验均与死者本人一致.提取死者阴道拭子,经酸性磷酸酶预试验呈阴性,经P30试验呈阴性,经PK消化后,离心,取沉淀物涂片,经亚甲基蓝酸性品红溶液染色,镜下检见个别精子,硅珠法[1]提取DNA,经荧光标记STR复合扩增技术,检出样品为混合DNA,其中有男性物质.分型结果见表1.
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烟蒂上DNA作STR分型3例
荧光标记STR复合扩增技术,使微量生物检材个体认定成为可能[1].本文报道3例对烟蒂上人体成份进行STR检验的案例.