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PAMAM-D纳米载体介导TFinAODN防治心肌缺血再灌注脂质过氧化损伤的实验研究
目的 研究聚酰胺-胺型树枝状高聚物(PAMAM-D)纳米载体介导组织因子(TF)反义寡脱氧核苷酸防治大鼠心肌缺血再灌注损伤的分子机制.方法 将100只雄性Lewis大鼠随机等分为5组.除假手术组和缺血再灌注组大鼠静脉分别注入0.9%氯化钠溶液和PAMAM-D外,其余3组分别注入与PAMAM-D相藕联的相应寡核苷酸.分别于缺血90 min和再灌注结束后取5组大鼠的血液检测肌钙蛋白T(TnT)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化酶(GSH-PX)的含量.将梗死区及边缘区心肌组织剪下,检测TF基因的转录;另分别检测TF的促凝活性(TF:C)和采用检测TF的抗原含量(TF:Ag).结果 假手术组和其余4组大鼠血液中的TnT、LDH、MDA、SOD和GSH-PX的含量比较,差异有统计学意义(P<0.05或<0.01);而AS/TF防治组与其他3个缺血再灌注组比较,差异有统计学意义(P<0.05或<0.01).假手术组梗死区及边缘区心肌组织中TF基因的转录和表达均弱于其他4组(P<0.01),而AS/TF防治组则较其他3个缺血再灌注组明显减弱(P<0.01).结论 PAMAM-D纳米载体介导的TF AODN通过拮抗组织因子,抑制心肌缺血再灌注过程中的脂质过氧化损伤,对心肌缺血再灌注损伤有明显的保护作用.
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磁性c-erbB2反义探针对SK-Br-3肿瘤细胞株形态及表达的影响
目的:探讨磁性c-erbB2反义寡脱氧核苷酸探针对SK-Br-3肿瘤细胞株形态及表达的影响,阐明该探针是否同时具有诊断与治疗功能.方法:磁性c-erbB2反义探针转染高表达c-erbB2的SK Br 3肿瘤细胞作为实验组,磁性c-erbB2反义探针转染Fuda肿瘤细胞株、SPIO及ASODN转染SK-Br-3肿瘤细胞、未转染的SK-Br-3肿瘤细胞设置为4个对照组,普鲁士蓝染色光镜观察细胞内铁的分布,透射电镜观察其超微结构,并检测细胞cerbB2蛋白表达变化及铁含量,行体外MR成像.结果:光镜显示SK-Br-3肿瘤细胞胞浆内散在分布铁颗粒,透射电镜观察到SK-Br-3肿瘤细胞胞浆内铁颗粒、团状吞饮体,细胞出现胞膜空泡化、细胞固缩、核固缩及凋亡小体,而对照组细胞无上述改变；与对照组比较,实验组SK-Br3细胞蛋白的表达抑制率明显升高,细胞铁含量增加(P＜0.01),MR扫描显示信号减低(P＜0.05).结论:磁性c-erbB2反义探针能够顺利进入SK-Br-3肿瘤细胞,不仅能导致SK-Br-3细胞的凋亡,还能够被体外MR成像所检测,可能成为一种具有治疗与诊断意义的双功能探针.
关键词： 反义寡脱氧核苷酸 超顺磁性氧化铁 SK-Br-3肿瘤细胞 分子探针 -
反义TNF-α寡脱氧核苷酸降低多器官功能不全综合征大鼠死亡率
目的观察反义肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis fa ctor-alpha, TNF-α)寡脱氧核苷酸对酵母多糖A(zymosan A)诱导的多器官功能不全综合征( multiple organ dysfunction syndrome, MODS)大鼠的影响,探讨MODS的发病机制,为采用反义技术降低MODS死亡率的早期临床试验提供实验依据.方法采用静脉注射方法,使反义TNF-α寡脱氧核苷酸(ODN)作用于zymosan A诱导的MODS大鼠:①采用RT-PCR,ELISA检测大鼠肝TNF-α的mRNA和蛋白质的表达水平;②观察大鼠在不同时期的死亡率;③在zymosan A诱导大鼠MODS 24小时后采集股动脉血进行血气分析,采集外周血进行血清生化检测,并进行统计学分析.结果反义TNF-α ODN降低了zymosan A诱导的MODS大鼠的TNF-α的释放,降低了MODS大鼠的死亡率,而正义TNF-α OD N和错配TNF-α ODN与对照组相比,对TNF-α的释放无影响,未能降低MODS大鼠的死亡率. 结论反义TNF-α ODN以序列特异性方式抑制了zymosan A诱导的MO DS大鼠的TNF-α的释放,降低了MODS大鼠的死亡率.
关键词： 反义寡脱氧核苷酸 肿瘤坏死因子-α 多器官功能不全综合征 -
组织因子反义寡脱氧核苷酸防治心肌缺血再灌注损伤的实验研究
目的:研究组织因子(TF)反义寡脱氧核苷酸(AS/TF)对大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用.方法:设计针对大鼠TF的AS/TF、正义寡脱氧核苷酸(S/TF)和错配寡脱氧核苷酸(Sc/TF).50只雄性Wistar大鼠随机分为假手术组(Sham组)、缺血再灌注损伤组(I/R组)、反义寡脱氧核苷酸防治组(AS/TF组)、正义寡脱氧核苷酸防治组(S/TF组)和错配寡脱氧核苷酸防治组(Sc/TF组),每组10只.Shm组和I/R组大鼠经静脉注入生理盐水,AS/TF组、S/TF组和Sc/TF组大鼠分别注入AS/TF、S/TF和Sc/TF.于注射后10 h麻醉大鼠,开胸暴露心脏,于冠状动脉左前降支中1/2处穿线,Sham组只穿线不结扎,其余4组均结扎造成心肌缺血,90min后解除结扎,再灌注1 h.用ELISA检测大鼠血清心肌肌钙蛋白I(cTnI)、血浆凝血酶-抗凝血酶复合物(TAT)和血小板P-选择素的含量.Northern印迹杂交检测大鼠缺血区心肌组织中TF基因的转录,HE染色观察缺血区心肌组织的病理变化.结果:大鼠心肌缺血再灌注后,血清cTnI、血浆TAT和P-选择素含量明显上升(P＜0.001),AS/TF组的上升幅度低于I/R组、S/TF组和Sc/TF组(P＜0.05).Northern印迹杂交显示大鼠缺血区心肌组织TF基因的转录明显增强,AS/TF组TF mRNA的转录弱于I/R组、S/TF组和Sc/TF组.HE染色可见大鼠缺血区心肌组织有灶性坏死、心肌纤维溶解和炎性细胞浸润.AS/TF组大鼠心肌的坏死程度轻于I/R组、S/TF组和Sc/TF组.结论:大鼠心肌缺血再灌注过程中,TF基因的转录和表达增强,针对TF的AS/TF能够特异地抑制TF基因的转录和蛋白表达,减少TF的合成与释放,从而抑制凝血系统的激活,减轻心肌组织的损伤和坏死.
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反义寡脱氧核苷酸在不同作用时点对人胰腺癌细胞系PaTu8988s作用的影响
目的探讨反义寡脱氧核苷酸(ASODN)在不同作用时点对人胰腺癌细胞系PaTu8988s抑制作用的影响.方法用人工合成的与K-ras互补的ASODN在不同作用时点作用于指数生长期人胰腺癌细胞系PaTu8988s,并用四甲基偶氮唑盐(MTT)法作活细胞测定.结果人胰腺癌细胞系PaTu8988s经50μg/ml和100μg/ml ASODN处理后,在12 h、24 h、48 h和72 h的抑制率分别为42.25%、66.29%、69.55%、74.58%和66.20%、91.43%、98.18%、98.33%.结论抑制效应从12 h开始出现,48～72 h为明显,其后出现时间和效率的饱和现象;抑制率的高峰期随着浓度增大而前程.
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反义寡脱氧核苷酸抑制赖氨酸羟化酶2 mRNA表达及胶原形成
肝纤维化主要病理特征是细胞外基质的过度沉积,以Ⅰ型胶原的沉积为主.已明确胶原的形成与赖氨酸羟化酶(lysyl hydroxylase,LH)密切相关,LH包括LH1、LH2和LH3,其中LH2在纤维化的发生中至关重要[1].LH2由赖氨酸羟化酶2基因(procollage-lysine-2-oxoglutarate-5-dioxygenase 2,PLOD2)编码,在纤维化过程中,它的表达量明显增加[2].
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反义N-ras寡脱氧核苷酸对前列腺癌细胞增殖的影响
目的探讨N-ras反义寡脱氧核苷酸(ASODN)对前列腺癌细胞增殖的影响.方法针对N-ras基因转录、翻译起始区分别合成硫代修饰的ASODN,采用3H-TdR掺入、流式细胞荧光免疫和斑点杂交法检测LNCaP细胞增殖和N-ras基因表达.结果两种ASODN单独作用后,LNCaP细胞内N-ras mRNA、p21蛋白和PSA表达水平以及3H-TdR掺入率明显低于对照组,10 μmol/L浓度对细胞生长的抑制率分别达63%,51%;二者联合应用后,N-ras基因表达、PSA水平以及3H-TdR掺入率进一步降低,细胞生长抑制率进一步增高达85%.结论 N-ras ASODN可有效抑制前列腺癌细胞增殖;同时证明N-ras在前列腺癌发生发展中起重要作用.
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ets-1基因的反义寡核苷酸治疗胃癌的研究
目的:研究ets-1反义寡核苷酸对胃癌的治疗作用及其机制.方法:应用ets-1反义、正义寡核苷酸转染SGC-7901细胞,并设PBS对照组.转染后应用逆转录聚合酶链式反应检测ets-1mRNA的变化,克隆形成试验检测细胞增殖活性的变化,Transwell小室检测癌细胞体外侵袭力的变化,并应用裸鼠胃癌皮下转移模型观察对体内侵袭力的影响.结果:转染ets-1反义寡核苷酸后,ets-1mRNA表达降低,形成克隆数目较正义组、对照组明显减少(24.2±4.8 vs 47.6±8.1 vs 44.3±7.6,P＜0.01),穿过小室滤膜细胞数目明显减少(97.1±11.1 vs 198.7±18.3,205.8±22.2,P＜0.01),裸鼠胃癌生长明显受到抑制.结论:ets-1反义寡核苷酸对胃癌有治疗作用,其机制可能与降低胃癌细胞体内外侵袭力有关.
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反义bcl-2寡脱氧核苷酸对BcaCD885细胞内源性bcl-2表达的阻断作用
目的探讨与bcl-2翻译起始部位碱基互补的反义bcl-2寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotide,ODN)对Bca-CD885细胞内源性bcl-2表达的阻断作用.方法以脂质体Lepofectin为载体,一过性转染20μmol/L反义及正义bcl-2 ODN于BcaCD885细胞中,FCM-抗体观测转染后24h、36h、48h细胞内bcl-2基因蛋白表达变化,RT-PCR技术检测转染后24h bcl-2 mRNA的表达变化.结果转染反义bcl-2 ODN后24h、36h、48h BcaCD885细胞内bcl-2基因蛋白表达与对照组相比都明显下降(P<0.05),而正义组与对照组无差异(P>0.05);正反义组bcl-2 mRNA与对照组相比无明显变化(P>0.05).结论反义bcl-2 ODN能在蛋白翻译水平特异性抑制颊癌细胞内源性bcl-2蛋白表达.
关键词： 反义寡脱氧核苷酸 BcaCD885细胞 Bcl-2基因 -
反义bcl-2寡脱氧核苷酸对BcaCD885细胞凋亡的影响
目的探讨反义bcl-2寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotide,ODN)对BcaCD885细胞凋亡的影响.方法以脂质体Lepofection为载体,一过性转染20μmot/L反义及正义bcl-2 ODN于BcaCD885细胞后,通过细胞形态观察及流式细胞术(FCM)分析,从形态学及细胞学水平对凋亡细胞进行检测.结果 20μmo1/L反义bcl-2 ODN转染组,细胞出现了凋亡形态学改变,FCM检测凋亡率与对照组间存在显著差异(P＜0.05).而20μmol/L正义bcl-2ODN转染组与对照组相似,在形态学上未见明显的凋亡细胞出现,FCM检测两者凋亡率不存在显著差异(P＜0.05).结论反义bcl-2 ODN能促进BcaCD885细胞凋亡.
关键词： 反义寡脱氧核苷酸 Bcl-2基因 BcaCD885细胞 凋亡 -
反义寡核苷酸类药物及给药系统的研究
与传统药物相比,反义寡核苷酸(ASODN)类药物具有高特异性、高效性,低毒、安全,易于设计适合对照物以及合成相对较易等诸多优点.但由于这类药物在体内易被酶降解且细胞透过率较低,临床应用受限.为了解决这些缺陷,一方面通过对ASODN类药物自身结构进行修饰和改造,以提高稳定性和细胞透过率,另一方面通过药物传递系统来帮助ASODN类药物躲避酶的识别,并使之具有一定靶向性,终使更多的ASODN类药物能应用于临床.
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c-myb对人绒毛膜促性腺激素诱导的大鼠睾丸间质细胞睾酮分泌的影响
采用离体细胞体外孵育法,观察反义c-myb寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucletides,ODN)对人绒毛膜促性腺激素(human chori-onic-gonadotropin hormone,hCG)诱导的大鼠间质细胞睾酮分泌的影响,并进一步探讨了外源性二丁酰cAMP(dbcAMP)、Ca2+以及蛋白质抑制剂放线菌酮(cycloheximide,CYX)对间质细胞中c-Myb蛋白表达和睾酮分泌的作用.结果表明,反义c-myb ODN呈剂量依赖性地抑制hCG诱导的离体间质细胞的睾酮分泌,同时使间质细胞中c-Myb蛋白免疫组化染色下降;而无义tat ODN没有相应的作用.100 μmol/L的dbcAMP可进一步促使hCG诱导的间质细胞分泌睾酮,并且使间质细胞中c-Myb蛋白免疫组化染色IOD值升高,与hCG组相比,具有统计学意义.钙离子通道阻断剂维拉帕米(10 μmol/L)和蛋白质抑制剂放线菌酮(50 μg/ml)可使hCG诱导的大鼠间质细胞的睾酮分泌下降,并使间质细胞的c-Myb蛋白免疫组化染色降低.该结果说明c-myb参与hCG诱导的大鼠间质细胞睾酮分泌作用.
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c-erbB2对大鼠黄体细胞hCG诱导的孕酮分泌的影响
采用离体细胞体外孵育法,研究反义c-erbB2寡脱氧核苷酸(antisense c-erbB2 ODN)对大鼠黄体细胞hCG 诱导的孕酮分泌的影响,及其与外源性cAMP和Ca2+以及蛋白抑制剂放线菌酮(CYX)之间的关系. 结果表明,反义 c-erbB2以剂量相关方式抑制黄体细胞hCG诱导的孕酮的产生,同时使c-erbB2蛋白染色阳性的黄体细胞百分数下降,无义tat ODN没有相应的作用. 10-4 mol/L的二丁酰cAMP能明显反转反义c-erbB2 ODN对孕酮产生和c-erbB2表达的抑制作用,钙离子通道阻断剂维拉帕米和蛋白抑制剂CYX 对此抑制作用有协同效应. 该实验说明c-erbB2参于hCG诱导黄体细胞生孕酮作用.
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反义MAPK寡核苷酸对AngⅡ及EGF诱导的心肌成纤维细胞增殖的抑制效应
血管活性肽和生长因子是性质不同且胞浆头端信号通路各异的两种具有丝裂原活性的物质.本文研究丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和表皮生长因子(EGF)诱导的心肌成纤维细胞(FB)分裂反应中的作用及反义MAPK寡核苷酸的抗分裂作用和机制.结果如下: (1)AngⅡ或EGF(浓度均为10-8 mol/L)处理培养新生大鼠FB 24 h, FB数增加39%和68%, DNA合成速率(～3H-thymidine 掺入法)增加60%和102%; (2)FB经AngⅡ (5 min)或EGF(10 min)处理后, MAPK活性(γ-～32P掺入法)分别增加202%和305%; 磷酸化MAPK蛋白含量(免疫印迹法)增加545%和646%; (3)脂质体转染法将反义MAPK寡脱氧核苷酸(ODN)导入FB, MAPK蛋白表达显著被抑制; AngⅡ或EGF诱导的FB DNA合成速率比脂质体对照组分别降低58%和46%, 细胞数降低38%和44%; 磷酸化MAPK含量降低85%和90%, MAPK活性降低74.2%和65.9%. 结果提示, 在AngⅡ或EGF诱导的心肌FB分裂反应中均有MAPK激活过程参与, 而反义MAPK ODN通过阻断MAPK蛋白表达抑制AngⅡ或EGF诱导的分裂反应.
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c-jun在人绒毛膜促性腺激素诱导睾丸间质细胞睾酮分泌中的作用
目的:本研究拟通过c-jun反义寡脱氧核苷酸(ASODNs)观察c-jun在调节hCG诱导的睾丸间质细胞(LC)睾酮分泌中的作用.方法:用c-jun ASODNg拮抗c-jun,用hCG诱导体外培养大鼠LC的睾酮分泌,用放射免疫法检测睾酮水平.结果:hCG可刺激LC分泌睾酮,是LC功能研究的有用模型.c-jun ASODNs呈剂量依赖性地抑制hCG诱导下的离体LC的睾酮分泌(P＜0.05).结论:c-jun促进hCG诱导的大鼠LC的睾酮分泌.
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PDE5基因反义寡脱氧核苷酸对人阴茎海绵体平滑肌细胞cNMP的影响
目的: 观察PDE5基因反义寡脱氧核苷酸对人阴茎海绵体平滑肌细胞内cAMP和cGMP的影响,为阴茎勃起功能障碍的基因治疗提供理论和实验依据. 方法: 将PDE5基因反义寡脱氧核苷酸(含第1外显子部分序列)与脂质转染试剂DOTAP共同转染人阴茎海绵体平滑肌原代细胞,以酶联免疫法分别检测转染后不同时间(1～48 h)海绵体平滑肌细胞内cAMP和cGMP的浓度变化,观察反义寡脱氧核苷酸对平滑肌细胞内cNMP的影响. 结果: 转染后,反义实验组平滑肌原代细胞内cGMP水平(1～6 h)显著高于对照组(P<0.01). 结论: PDE5基因反义寡脱氧核苷酸可以增加人阴茎海绵体平滑肌细胞cGMP水平,本研究有助于了解PDE5基因与cNMP在阴茎勃起中的作用,并为阴茎勃起功能障碍的基因治疗提供理论和实验基础.
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胰岛素-反义c-myb-硫代磷酸寡脱氧核苷酸对大鼠主动脉平滑肌细胞增殖的抑制作用
目的研究新制剂胰岛素-反义c-myb-硫代磷酸寡脱氧核苷酸(PS-ODN)对平滑肌细胞增殖的抑制作用.方法大鼠主动脉平滑肌细胞(SMC)置DMEM中培养.用20%胎牛血清刺激SMC快速增殖.胰岛素与反义c-myb-PS-ODN在一定条件下,如反应液、pH、温度、离子浓度,共孵育形成交联物.通过高效液相色谱定性和纯化该交联物.用3 H-TdR掺入率反映SMC增殖抑制效率.结果在加20%FBS的DMEM中生长的SMC胰岛素结合力明显增强.交联物胰岛素-反义c-myb-PS-ODN对SMC增殖的抑制作用比单纯反义c-myb-PS-ODN的抑制作用强,抑制效率分别为48.3%和29.5%.结论胰岛素受体靶向途径可能为一种治疗再狭窄的有效方法.
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沉默Cdk7导致pRb和Cdk2磷酸化水平下降并诱导HepG2细胞凋亡
目的研究转染反义寡脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides, ASODN)对Cdk7特异性的沉默作用及其对体外培养人肝细胞癌HepG2细胞pRb和Cdk2磷酸化水平以及细胞周期进展的影响,确定Cdk7作为抗肿瘤药物研发靶点的可行性.方法以免疫印迹检测转染ASODN对Cdk7 的特异性沉默作用及其对pRb和Cdk2磷酸化水平的影响;以流式细胞术测定转染ASODN后细胞DNA含量,确定细胞周期进展和凋亡情况,透射电子显微镜观察细胞凋亡形态.结果转染ASODN 72 h后,Cdk7蛋白水平显著下降,有明显剂量-效应关系,高可降至对照组的0.12±0.05;在ASODN浓度>100 nmol.L-1时,pRb和Cdk2磷酸化水平显著下降,两种蛋白的磷酸化水平与给药剂量有明显依赖关系.随转染ASODN浓度上升及转染时间的延长,G0/G1期细胞、凋亡细胞比例迅速升高,与对照组比较,出现明显的G0/G1期阻滞(P<0.01)和细胞程序性死亡(P<0.01) ;透射电子显微镜观察显示>50 nmol·L-1各组细胞具特征性凋亡形态.结论用ASODN沉默Cdk7可降低pRb以及Cdk2的磷酸化水平,使其生物活性下降,对体外培养HepG2细胞可产生显著的G0/G1期阻滞,引起细胞周期延长和细胞凋亡,产生抗增殖作用,可以Cdk7作为抗肿瘤药物研发的新靶点.
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脂质体-c-erbB-2反义寡核苷酸对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的治疗作用
目的探讨c-erbB-2反义寡脱氧核苷酸(ASODN)对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的治疗作用.方法将15只裸鼠建立人卵巢癌皮下移植瘤模型,然后随机分成3组予以不同条件处理:对照组(腹腔注射转染液和脂质体),正义治疗组(腹腔注射脂质体-c-erbB-2-SODN),反义治疗组(腹腔注射脂质体-c-erbB-2-ASODN).治疗期间定期观测裸鼠体重和肿瘤体积,计算抑瘤率及肿瘤缩小率.利用RT-PCR技术比较治疗后各组肿瘤组织中c-erbB-2基因水平.结果反义治疗组与正义治疗组的抑瘤率分别为71.2%和7.6%,反义治疗组肿瘤缩小率为22.7%,与正义治疗组相比较有显著性差异.各组裸鼠体重变化无明显差异.RT-PCR结果显示反义治疗组c-erbB-2表达水平降低约61.0%.结论脂质体-c-erbB-2-ASODN对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤有一定的治疗作用,可能成为日后卵巢癌基因治疗的重要途径.
关键词： 反义寡脱氧核苷酸 c-erbB-2基因 卵巢上皮癌 裸鼠皮下移植瘤 -
c-Fos对大鼠间质细胞睾酮生成的影响及其作用机理
目的本研究拟通过反义技术观察c-fosASODNs对hCG诱导大鼠睾丸间质细胞睾酮分泌及睾酮合成过程中限速酶表达水平的变化,并探讨其作用机制.方法 (1)放射免疫方法研究c-fosASODNs对hCG诱导大鼠睾丸间质细胞睾酮分泌的影响.(2)用免疫组织化学方法观察离体大鼠间质细胞Fos蛋白的变化.(3)用RT-PCR法观察在睾酮合成过程中大鼠间质细胞P450C17mRNA表达水平的变化.结果 (1)1.2×10-2IU/mlhCG可显著性地增加间质细胞睾酮的分泌(P<0.01),并使c-Fos蛋白染色阳性的间质细胞百分率和P450 C17mRNA 表达水平显著性地升高(P<0.01).(2)c-fosASODNs呈剂量依赖性地抑制hCG诱导的离体间质细胞的睾酮分泌,同时使c-Fos蛋白染色阳性的间质细胞百分率下降,而无义tatODN没有相应作用.(3)当二丁酰cAMP与c-fosASODNs作用时可明显逆转c-fosASODNs对hCG诱导间质细胞睾酮分泌的抑制作用,同时c-Fos蛋白染色阳性的间质细胞百分率和P450 C17mRNA 表达又恢复至接近hCG刺激水平.(4)维拉帕米(10-6mol/L)对hCG诱导的大鼠间质细胞睾酮的分泌及c-Fos蛋白染色阳性的间质细胞百分率均未见明显改变.结论 c-fos参与hCG诱导大鼠间质细胞睾酮的分泌,其机制很可能是通过cAMP-PKA依赖性途径使c-fos癌基因表达增强,然后激活睾酮合成的关键酶-P450C17mRNA表达.
