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乳腺癌原癌基因HER-2反义寡脱氧核苷酸-叶酸诱导乳腺癌细胞凋亡的研究
目的:研究乳腺癌原癌基因HER-2反义寡脱氧核苷酸(ASODN)对乳腺癌细胞SK-Br-3凋亡和蛋白表达的影响.方法:采用DNA原位末端标记染色和Annexin-V荧光标记法检测ASODN-叶酸(FA)对乳腺癌细胞凋亡的影响,免疫组化检测p185蛋白的表达.结果:与空白对照组比较,ASODN-FA组凋亡指数、早期凋亡细胞阳性率、p185表达平均光密度值2组分别为(4.60±1.76)%、(17.37±2.78)%,(2.75±1.09)%、(18.62±1.80)%,0.31±0.06、0.11±0.02(P＜0.05).结论:HER-2 A-SODN可诱导乳腺癌细胞SK-Br-3的早期和晚期凋亡,p185蛋白表达降低.
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脂质体-c-raf-1反义寡核苷酸治疗人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤
目的:探讨c-raf-1反义寡脱氧核苷酸(ASSODN)对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的治疗作用.方法:将15只裸鼠建立人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型,然后随机分成3组予以不同条件处理:对照组(腹腔注射转染液和脂质体),正义治疗组(腹腔注射脂质体-c-raf-1-SODN),反义治疗组(腹腔注射脂质体-c-raf-1-ASODN).治疗期间定期观测裸鼠体重并测量肿瘤体积,计算抑瘤率及肿瘤缩小率.结果:反义治疗组与正义治疗组的抑瘤率分别为68.1%和6.8%,反义治疗组肿瘤缩小率为16.7%,与正义治疗组相比较有明显的差别.各组裸鼠体重变化无明显差别.结论:脂质体-c-raf-1-ASODN对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤有一定的治疗价值,可能成为日后基因治疗的重要方向.
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ATP50对生长激素诱导大鼠睾丸间质细胞睾酮分泌的影响
目的:研究ATP50在SD大鼠睾丸Leydig细胞中对生长激素(Growth hormone,GH)诱导睾酮合成及生长激素受体功能的影响.方法:采用离体细胞体外孵育法,观察反义ATP50寡脱氧核苷酸(Oligo deoxy nucletides,ODN)对GH诱导大鼠睾丸Leydig细胞分泌睾酮的影响及GH受体功能的影响,以睾酮放射免疫试剂盒测定睾酮合成的情况,cAMP放免试剂盒检测cAMP含量来评定GH受体的功能,免疫组织化学检测ATP50蛋白的表达.结果:反义ATP50 ODN呈剂量依赖性抑制GH诱导睾丸Leydig细胞睾酮的分泌(P＜0.05),同时使Leydig细胞中ATP50蛋白表达下降,而无义tat ODN则没有相应的作用,免疫组织化学显示ATP50蛋白阳性颗粒在Leydig细胞中中呈密集性分布,表达强度明显高于GH组(P＜0.05).结论:在SD大鼠睾丸Leydig细胞中,ATP50可能通过增强GH受体的功能,进而刺激GH诱导睾酮的合成.提示ATP50参与GH诱导大鼠睾丸Leydig细胞睾酮的分泌过程.
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纳米微粒介导反义寡脱氧核苷酸逆转乳腺癌细胞多药耐药的实验研究
目的 探讨纳米微粒介导耐药基因mdr-1、mrp反义寡脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)转染对多药耐药乳腺癌MCF-7/ADR细胞的影响.方法 采用纳米微粒介导mdr-1、mrp-ASODN转染耐药细胞株MCF-7/ADR,RT-PCR、Western blot检测转染48 h后细胞耐药基因mdr-1、mrp的表达;MTT法检测经转染后MCF-7/ADR细胞对阿霉素(ADR)、表柔比星(epimbicin)、5-氟脲嘧啶(5-FU)和紫杉醇(paditaxel)的敏感性.结果 纳米微粒介导mdr-1、mrpASODN转染48 h后,MCF-7/ADR细胞的mdr-1、mrp在mRNA和蛋白质表达水平上均显著降低(P<0.05);细胞对ADR、表柔比星、5-氟脲嘧啶和紫杉醇的耐药指数均显著降低(P<0.05).结论 耐药基因反义寡脱氧核苷酸能在体外抑制耐药基因的表达,从而提高细胞的药物敏感性;纳米微粒具有较好的体外介导反义寡脱氧核苷酸转染效果.
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磁标记反义探针对小鼠的急性毒理观察
目的 评价SPIO标记的c-erbB2反义寡脱氧核苷酸探针对小鼠的急性毒性,为进一步将该探针用于活体MR基因成像与靶向基因治疗奠定基础.方法 60只清洁级昆明种小鼠分为口服灌胃、静脉注射、腹腔注射3组,采用大给药苗法,口服灌胃:总剂量为2 104.8 mg/kg,给药容积40 ml/kg;静脉注射:总剂量为438.5 mg/kg,给药容积25 ml/kg;腹腔注射:总剂量为1 578.6 mg/kg,给药容积30 ml/kg;各组还另设20只小鼠按相应方式给予等量生理盐水作为对照.所有实验小鼠均在25℃室温下连续饲养14 d,观察并记录饲养期问小鼠的一般情况、主要脏器的病理学、血常规、凝血指标和血清主要生化指标改变.结果 在观察期间,各组小鼠均末出现死亡,仅个别出现食欲下降、饮水量增多、腹泻、嗜睡、活动增加等,但均在3 d内恢复正常.脏器系数无统计学差异,肝、脾、肾、心、肺、骨髓、生殖器等主要脏器颜色、形态未见明显异常改变,HE染色切片肝、脾、肾、心、肺、生殖器等细胞和Wright染色的骨髓细胞均无水肿、变性、坏死等改变,普鲁士蓝染色仅见肝、脾内分布少许监色铁颗粒.各组血常规、凝血指标及生化指标无统计学差异.结论 SPIO标记的c-erbB2反义寡脱氧核苷酸探针对小鼠无急性毒性.
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高精度原子力显微镜显示磁性反义探针与SK-Br-3肿瘤细胞mRNA核苷酸连接
为了将高精度原子力显微镜(AFM)用于显示超顺磁性氧化铁标记的c-erbB2癌基因反义寡脱氧核苷酸探针(磁性反义探针)与SK-Br-3肿瘤细胞mRNA核苷酸的连接,我们在磁性反义探针转染SK-Br-3肿瘤细胞基础上,用AFM对转染后的肿瘤细胞进行观察,并同时对转染后的肿瘤细胞进行蛋白表达检测及MRI成像,以进一步证实AFM的观察结果.从AFM显示的磁性反义探针转染SK-Br-3肿瘤细胞后单个细胞的全貌图及局部放大图发现,探针中反义寡脱氧核苷酸中的脱氧胞嘧啶核苷酸闭环与肿瘤细胞mRNA嘌呤核苷酸环相连接;此外,磁性反义探针能特异性抑制SK-Br3细胞c-erbB2的蛋白表达,MRI显示磁性反义探针转染SK-Br-3肿瘤细胞的信号强度低(P＜0.05).实验表明,AFM可以清楚显示磁性反义探针与SK-Br-3肿瘤细胞核mRNA核苷酸的连接.
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反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸对HL60细胞Bcl-2表达的抑制作用
目的 探讨Bc1-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸(AS-PS-ODN,ASPO)是否抑制HL60细胞Bc1-2的mRNA及其蛋白的表达,以及不同浓度ASPO产生抑制作用的程度、效应发生和持续时间的差异.方法 应用免疫细胞化学染色、流式细胞仪和RT-PCR半定量法对与Bc1-2的ASPO共培养后的HL60细胞Bc1-2蛋白及mRNA表达进行检测.结果 Bc1-2的ASPO能在mRNA水平产生抑制作用,并减少Bc1-2蛋白的合成,且在培养24小时即出现效应,同时随着ASPO剂量的增加和作用时间的延长其抑制作用更显著,但72小时后出现回升现象.结论 Bc1-2的ASPO能特异抑制HL60细胞Bc1-2的mRNA和蛋白表达,且具浓度和时间的依赖性,同时又存在作用暂时性的问题.
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端粒酶RNA的反义寡核苷酸抑制裸鼠移植瘤生长的研究
背景与目的 许多研究已证明:端粒酶的激活在肺癌的发生、发展中具有重要作用,因而成为肺癌基因治疗的重要靶点之一.本研究旨在探讨针对人端粒酶RNA成分的反义寡核苷酸对裸鼠移植瘤的生长抑制作用.方法 应用人肺腺癌细胞株A549细胞构建裸鼠皮下移植瘤模型,18只荷瘤裸鼠随机分为反义寡核苷酸组(Antisense Oligodeoxynucleotide Group,Group ASODN)、正义寡核苷酸组(Sense Oligodeoxynucleotide Group,GroupSODN)和生理盐水对照组(Normal Saline Group,Group NS),每组6只,瘤体内分别注射反义寡核苷酸/阳离子脂质体复合物、正义寡核苷酸/阳离子脂质体复合物和生理盐水,均为每日1次,共14次,观察移植瘤的生长情况.结果 反义寡核苷酸组、正义寡核苷酸组的体积抑瘤率分别是43.94%、6.91%,统计学检验有非常显著性差异(t=6.17,P＜0.001).治疗过程中裸鼠对药物耐受良好,无恶心、呕吐等消化道症状,未见皮下出血,治疗结束时各组裸鼠的体重较治疗开始时略有增加.结论 瘤体内注射脂质体包封的端粒酶RNA的反义寡核苷酸能够明显抑制裸鼠体内移植瘤的生长.
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硫代反义Bcl-xL寡脱氧核苷酸对BcaCD885颊癌细胞凋亡及热敏感性的影响
目的探讨硫代反义Bcl-xL寡脱氧核苷酸(AS-sODN)对BcaCD885颊癌细胞凋亡及热敏感性的影响.方法以脂质体Lipofectin为载体,转染AS-sODN于BcaCD885细胞内,倒置显微镜观察细胞形态学改变,TUNEL原位末端标记检测细胞凋亡,流式细胞技术(FCM)测定细胞凋亡率及Bcl-xL蛋白表达水平;转染AS-sODN于BcaCD885细胞内,再以43 ℃,40 min加热细胞,FCM检测细胞凋亡率.结果AS-sODN转染后,BcaCD885颊癌细胞出现皱缩、呈浮起状,TUNEL原位末端标记阳性,Bcl-xL蛋白表达明显下降(P<0.05),热诱导细胞凋亡率明显提高(P<0.05).结论硫代反义Bcl-xL 寡脱氧核苷酸能诱导BcaCD885颊癌细胞凋亡并能提高其热敏感性.
关键词： 反义寡脱氧核苷酸 Bcl-xl BcaCD885细胞 凋亡 热敏感性 -
整合素连接激酶反义寡脱氧核苷酸对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞株的作用
目的探讨整合素连接激酶(ILK)反义寡脱氧核苷酸(ASODN)对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞株生物学特性的影响及抑制ILK活性以控制喉鳞状细胞癌细胞生长的可能性.方法应用脂质体包裹的ILK ASODN转染喉鳞状细胞癌Hep-2细胞,阻断ILK表达;应用光学显微镜观察凋亡细胞的形态学改变;通过细胞生长曲线检测细胞的增殖活性;于处理后120h采用膜联蛋白(An-nexin-V)/碘化丙啶(PI)联合标记法于荧光显微镜下观察细胞凋亡;于处理后72h以流式细胞术测定细胞凋亡及细胞周期.结果ASODN组转染后,Hep-2细胞生长受到抑制,细胞凋亡增加,细胞周期发生显著变化:G0/G1期细胞数增多,S期及G2/M期细胞数则减少,与对照组相比,差异有显著意义(P＜0.05);而SODN及NODN组与对照组相比则无明显变化(P＞0.05).结论ILK ASODN可以抑制喉鳞状细胞癌Hep-2细胞的生长和增殖,诱导细胞凋亡;应用反义技术抑制ILK活性可能对喉鳞状细胞癌的治疗有意义.
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EGF受体介导c-erbB2癌基因反义寡核苷酸对p185蛋白表达的影响
目的研究c-erbB2癌基因反义寡核苷酸探针99mTc-ASODN～EGF对SK-Br-3乳腺癌细胞c-erbB2蛋白表达的影响.方法将反义寡脱氧核苷酸与次乙酰双半胱氨酸偶联,用锝(99mTc)标记,再与表皮生长因子联合,形成分子复合物99mTc-ASODN-EGF.将该复合物给予SK-Br-3乳腺癌细胞,用免疫组化方法测定细胞膜c-erbB2蛋白的表达.结果99mTc-ASODN-EGF明显抑制c-erbB2蛋白表达,免疫组化的平均光密度值低,对照正义和无义组对蛋白表达的影响较小.结论c-erbB2反义寡脱氧核苷酸明显抑制目的基因表达,使p185蛋白减少,细胞活力减弱.
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bcr/abl及c-myb原癌基因反义寡核苷酸对K562细胞的作用研究
目的为反义基因治疗慢粒白血病(CML)奠定实验基础,并进一步提示CML的发病机制.方法设计并合成针对bcr/abl嵌合基因和c-myb原癌基因的反义寡脱氧核苷酸(asODN)及其硫代衍生物.观察其对K562细胞的生长、DNA合成及bcr/abl基因转录、表达以及细胞凋亡的影响.结果针对bcr/abl基因及c-myb癌基因的asODN可显著抑制K562细胞的生长、DNA合成及bcr/abl基因转录、表达,并使K562细胞发生凋亡,其中硫代asODN的作用效果更好,两种asODN联合用药几乎可完全抑制bcr/abl基因的转录.结论①bcr/abl在CML发病中既能促使细胞增殖也能抑制细胞的凋亡;②联合应用针对几种与CML发病有关的癌基因的asODN,对反义基因治疗CML具有一定的实际意义.
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c-erbB2反义寡脱氧核苷酸联合紫杉醇对乳腺癌细胞SK-Br-3的抑制作用
目的:探讨以c-erbB2 mRNA为靶点的反义寡脱氧核苷酸(ASODN)联合紫杉醇对乳腺癌SK-Br-3细胞的抑制作用.方法:实验分为7组:ASODN组,紫杉醇组,赫赛汀组,表阿霉素组,ASODN+紫杉醇组,赫赛汀+紫杉醇组,表阿霉素+紫杉醇组.分别处理乳腺癌SK-Br-3细胞72 h,MTT法测定细胞抑制率,中效原理判定药物联合应用的效果,WesternBlot检测细胞c-erbB2,Bcl-2蛋白表达水平.结果:各组中SK-Br-3细胞的抑制率均随药物浓度的增加而增大;紫杉醇的中效浓度紫杉醇组为0.14 umol/L;ASODN+紫杉醇组为0.07umol/L,其合用指数(CI)<1,为协同作用.ASODN+紫杉醇组c-erbB2,Bcl-2蛋白表达明显低于紫杉醇组,两组相比较,差异具有统计学意义(P<0.05).结论:ASODN可明显增强紫杉醇对乳腺癌SK-Br-3细胞的抑制效应,可明显降低紫杉醇的用药量.
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Ets-1反义寡核苷酸抑制裸鼠胃癌生长的实验研究
目的研究Ets-1反义寡核苷酸对裸鼠胃癌生长的影响及其机制.方法建立裸鼠胃癌皮下种植模型,分别应用Ets-1反义、正义寡核苷酸与PBS行瘤内注射,观察种植瘤生长的变化;应用逆转录聚合酶链式反应检测瘤组织Ets-1 mRNA的变化,并应用免役组织化学检测瘤组织微血管密度的差异.结果经Ets-1反义寡核苷酸治疗后,反义Ets-1组较正义组及PBS组裸鼠胃癌生长明显受到抑制[(0.60±0.11)g vs(1.18±0.11)g vs(1.28±0.13)g,P＜0.01];瘤组织Ets-1 mR-NA表达降低,微血管密度显著低于正义组与PBS组[(10.4±3.1)vs(24.5±8.4)vs(20.6±7.5),P＜0.01].结论Ets-1反义寡核苷酸能够抑制裸鼠胃癌的生长,其机制可能与减少微血管形成有关.
