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心肌肌球特定基因-肌球蛋白轻链基因可在人脐带间充质干细胞诱导分化为心肌样细胞表达
目的:探讨人心肌肌球蛋白轻链(2v)基因启动子(pMLC2v)驱动的绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶(Luc)报告基因慢病毒载体在人脐带间充质干细胞(hUCMSC)向心肌样细胞分化中的表达.方法:酶消化法原代分离培养hUCMSC,采用流式细胞仪鉴定分析其细胞表面标记物及检测体外向成骨细胞、成脂细胞、内皮细胞诱导分化潜能;经5-氮杂胞苷(5-Aza)诱导hUCMSC定向分化成心肌样细胞;诱导细胞并同时转染pMLC2v-GFP,于d3,d7,d10,d14,d17及d21时间点在荧光显微镜下观察及流式细胞仪检测其阳性率;用生物发光检测仪检测相同时间点的萤光素酶(pMLC2v-Luc)报告基因慢病毒载体转染分化细胞发光特征;在激光共聚焦显微镜下观察pMLC2v-GFP及红色荧光蛋白(RFP)共转染诱导21d后分化细胞蛋白的表达分布状况;与鼠心肌细胞作为对照,脉冲电流激发细胞收缩和细胞内及细胞间的钙离子流,以检测诱导分化细胞“兴奋-收缩”偶联功能;Western blot法检测诱导分化细胞pMLC2v蛋白的表达.结果:原代培养的P3 hUCMSC,经FCM检测CD90、CD105及CD73阳性率均为99％以上为高表达;获得的细胞分别经体外诱导能够向成骨细胞、成脂细胞、成内皮细胞分化;经5-氮杂胞苷(5-Aza)诱导hUCMSC同时并转染pMLC2v GFP,在荧光显微镜下观察并用流式仪检测GFP表达阳性细胞数随诱导时间的延长而增加(P＜0.05);生物发光检测仪检测诱导细胞pMLC2v-Luc表达同样呈阳性递增;pMLC2v GFP及RFPC共转染诱导21d后分化的细胞,细胞浆内形成较清晰的与细胞长轴平行的肌束样结构;诱导后的细胞用共聚焦显微镜检测无细胞内及细胞间的钙离子流动;随诱导时间的延长pMLC2v蛋白表达明显增加(P＜0.05).结论:在hUCMSC体外诱导形成心肌样细胞过程中,pMLC2v基因随诱导时间的延长而表达增加,为监测干细胞的移植在心肌疾病治疗中提供了实验依据.
关键词： 人脐带胶样组织间充质干细胞 心肌样细胞 肌球蛋白轻链 荧光素酶 绿色荧光蛋白 -
小鼠活体内hMSCs干细胞生物发光示踪监测
目的:利用慢病毒载体转染和生物发光技术实时监测小鼠活体内人骨髓间充质干细胞(hMSCs).方法:构建萤火虫荧光素酶(LUC)慢病毒载体,转染hMSCs后注射到小鼠皮下,(IVIS)生物发光成像系统连续检测体外hMSCs和小鼠注射部位的发光强度.结果:1.慢病毒载体对hMSCs的转染率为(29.6±1.5)%,转染后20代的hMSCs仍稳定表达LUC;2.慢病毒载体对hMSCs的生长和增值没有影响;3.小鼠活体内生物发光强度与注射细胞数量成正比(R2=0.9826);4.小鼠活体内生物发光时间持续6 d.结论:可利用慢病毒载体转染LUC对小鼠活体内移植的hMSCs进行生物发光示踪监测.
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人细胞色素P450 4A11基因核心启动子区的鉴定
目的 研究细胞色素P450 4A11基因启动子区对该基因转录活性的影响.方法 运用生物信息学的方法预测细胞色素P450 4A11基因启动子区的重要调控序列,然后采用5'侧翼区缺失的方法将包含重要调控序列的启动子克隆到双报告基因载体中,用脂质体转染HepG2细胞,24 h后检测荧光素酶相对活性.然后使用Alibaba2.0 Transfac4.0预测增强子区域可能存在的转录因子结合位点.结果 ·36～ - 720～+1、-972～+1、-1039～+1区域的启动子活性较高,其中-972～+1区域强,与此相比-536～+1、-720～+1荧光素酶相对活性分别下降了96.9%和70.1%.结论 人CYP4A11基因5'侧翼区的影响转录活性的启动子关键区域位于-972～-720bp范围内.
关键词： 细胞色素P450 4A11 启动子 转录 荧光素酶 -
不同清洁消毒方式对导管室物体表面除菌效果的研究
目的：采用ATP生物荧光检测法，比较不同清洁消毒方式对导管室物体表面的除菌效果，为寻找导管室适宜的清洁消毒方式提供参考。
方法：选择导管室两个操作间及控制室。每个操作间及控制室选取23个固定区域为采样点，包括操作台、抢救台、固定夹、门把手、鼠标、键盘、控制器、对讲器、电话手柄、平车等。对照组：前10天对两个操作间及控制室的23个固定区域采取常规方式进行清洁，由保洁员完成。观察组：后10天对23个固定区域采取由护士实施的加强消毒措施（一天三次，4小时一次，用70%的酒精擦拭）。于清洁消毒后2小时对23个固定区域测定1次RLU值。用生物荧光测试管中的专用棉拭子，在采样点往返涂擦2遍取样。将取样后的棉拭子放人试管中，快速挤入裂解液和荧光素酶，反应后用荧光光度计测定相对光单位值（RLU），RLU值越高说明区域染菌量越高。使用SPSS17.0统计，所有数据采用均值（x±s ）描述；对于两组的比较，采用正态资料t检验，非正态资料非参数秩和检验，P<0.05表示差异有统计学意义。 -
甾体类激素受体AR、ER对前列腺癌中L-plastin表达的调控
目的研究甾体类激素受体AR、ER对前列腺癌L-Plastin基因的调控作用,确定甾体类激素对前列腺癌的调节作用.方法构建L-plastin启动子于含荧光素酶的pGL3质粒,利用PCR定点突变法依次构建切除ARE1、ARE2、ARE3、ERE序列的pGL3重组子,将重组子转染到前列腺癌细胞系LNCaP,检测荧光素酶强度,以了解ARE1、ARE2、ARE3、ER调控L-plastin表达能力.结果成功构建了L-plastin启动子的荧光素酶pGL3重组子以及切除ARE1、ARE2、ARE3、ERE位点的重组子,将这些重组子转染细胞后其荧光素酶强度有明显改变,切除ARE1位点后,荧光素酶活性下降1/3;切除ARE2后,荧光素酶活性与单纯切除ARE1相比下降1/2;切除ARE3后荧光素酶活性升高1倍;切除ERE后,荧光素酶活性下降约4/5.结论在L-plastin启动子转录活性中ARE1、ARE2、ARE3、ERE在前列腺癌中对其下游基因L-plastin起到调控作用,ARE1、ARE2、ERE起促进作用,ARE3起抑制作用.而且,L-plastin启动子上存在其他受甾体类激素调控的位点.
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原位膀胱癌动物模型的建立及其体外活体成像检测
目的 建立可应用于活体成像的原位膀胱癌动物模型并利用生物发光体外活体成像系统检测肿瘤的生长.方法 通过感染能表达荧光素酶的重组慢病毒颗粒,将荧光素酶基因转染至膀胱癌细胞BIU87中.然后向6只裸鼠膀胱壁内注射肿瘤细胞BIU87-1uc,构建原位膀胱癌模型,并在肿瘤细胞种植后的第5天及第10天,利用生物发光体外活体成像系统检测肿瘤的变化.后取各个裸鼠的膀胱制作病理切片观察.结果 BIU87与BIU87-1uc两种细胞的生长、迁移能力没有明显差别.膀胱壁内注射肿瘤细胞后第5天,所检测到的光子信号强度为(1.78±0.48)×106 p/sec/cm2/sr,第10天所检测到的光子信号强度为(5.07±0.81)×106 p/sec/cm2/sr,二者的差别有统计学意义(P＜0.01).终的膀胱病理切片可以看到大量肿瘤细胞聚集生长.结论 荧光素酶标记膀胱癌细胞后,构建的原位膀胱癌动物模型,利用活体成像技术能够动态监测其原位肿瘤的生长.
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NGAL基因5′侧翼区转录调控元件的分段定位鉴定
目的:对中性粒细胞明胶酶相关脂萼蛋白 (neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL) 基因5′侧翼区的转录调控元件进行分段定位鉴定.方法:以双荧光素酶报告基因检测系统检测NGAL基因5′侧翼区(-1 431～+84)转录调控元件与转录调控蛋白之间的相互作用.结果:在NGAL基因5′端-945～-658和-657～-417 2个区段发现了转录增强子元件与转录激活蛋白之间的相互作用,而在-416～-152区段则发现了转录沉默子元件与转录抑制蛋白之间的相互作用.结论:在NGAL基因5′侧翼转录调控区可能至少存在着2个转录增强子元件和1个转录沉默子元件.
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变形链球菌荧光报告株的构建和鉴定
目的 探讨变形链球菌(S.mutans)荧光素酶(luc)基因报告株构建方法,拟为探讨抗菌剂对多菌种生物膜中S.mutans的作用提供研究基础.方法 将S.mutans UA159乳酸脱氢酶(ldh)基因及其上游部分约1 100 000片段克隆至自杀质粒pFW5-luc的多克隆位点,构建重组质粒,并经酶切和测序证实.采用自然转化的方法,实现重组自杀质粒和S.mutans UA159同源序列的单次交换.结果 经过聚合酶链反应(PCR)和测序分析,筛选出具有报告活性的S.mutans ldh-luc 基因荧光报告株.结论 成功构建了S.mutans ldh-luc基因荧光报告株.
关键词： 变形链球菌 荧光素酶 同源重组 ldh-luc荧光报告株 -
VEGF-C基因3'端未翻译区对荧光素酶表达的影响
目的 构建小鼠血管内皮生长因子-C(VEGF-C)基因3'端未翻译区(3'UTR)的荧光素酶表达载体,利用双荧光报告系统观察VEGF-C基因3'UTR对荧光素酶基因表达的影响.方法 通过PCR分别扩增小鼠Lewis肺癌细胞VEGF-C cDNA全长3'UTR(429bp)和一段312bp的编码区序列(CR),采用基因工程方法 将PCR产物克隆至pTA2克隆载体,随后再亚克隆至荧光素酶报告基因载体(pGL3-Promoter)荧光素酶编码基因下游的Xba Ⅰ酶切位点,使用LipofectamineTM 2000真核转染小鼠Lewis肺癌细胞,化学发光法检测荧光素酶的活性,定量RT-PCR检测荧光素酶mRNA水平.结果 PCR成功扩增出与预期长度相符的小鼠VEGF-C CR (312bp)和VEGF-C 3'UTR (429bp).经酶切、测序鉴定,小鼠VEGF-C基因3'UTR和CR均插入到pGL3-Promoter的Xba Ⅰ位点,插入序列碱基组成和插入方向均正确,获得载体pGL3-VEGF-C 3'UTR和pGL3-VEGF-C CR.荧光素酶报告系统和定量RT-PCR检测显示,与pGL3-Promoter组比较,pGL3-VEGF-C 3'UTR转染组荧光素酶活性和mRNA水平均显著降低,而pGL3-VEGF-C CR组与pGL3-Promoter组之间无显著性差异.结论 VEGF-C基因3'UTR可以抑制荧光素酶的表达.
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人胰岛素样生长因子-Ⅰ基因Pl启动子区域单核苷酸多态性——705T》C和——603T》A对启动子活性的影响
目的 探讨人胰岛素样生长因子-I(ICF-I)基因P1启动子区域单核苷酸多态性(SNP)-Y05T＞C和-603T＞A对启动子活性的影响.方法 招募152名健康志愿者参与本研究,取静脉血样品,使用基因组DNA提取试剂盒从血样中提取全基因组DNA.通过限制片段长度多态性分析(RFLP),对每名志愿者的SNP-705T＞C和-603T＞A进行基因分型,统计各基因型的频率.使用PHASE v2.1软件程序分析P1启动子单体型的类型和频率.通过荧光素酶报告基因测定不同P1启动子单体型的活力差异.结果 成功提取了每名志愿者的全基因组DNA并测定了SNP -705T＞C和-603T＞A的基因型.基因型-70ST/T、705T/C、-705C/C的频率分别与-603T/T、-603T/A、-603A/A相同,分别为43.4％、45.4％、11.2％.等位基因-705T、-705C的频率分别与-603T、-603A相同,分别为66.1％、33.9％.SNP -705T＞C和-603T＞A之间存在完全的连锁不平衡,其组成的P1启动子单体型只有-705T/-603T和-705C/-603A两种,频率分别为66.1％和33.9％.报告基因分析结果表明,P1启动子-705C/-603A单体型的活力显著高于-705T/-603T单体型.结论 人IGF-Ⅰ基因P1启动子区域SNP -705T/C和-603T/A能够影响P1启动子的活性.
关键词： 单核苷酸多态性 人胰岛素样生长因子-Ⅰ 荧光素酶 基因 报告 -
小动物生物发光活体成像的条件优化与技术扩展研究
目的 为发掘生物发光活体成像技术的灵敏性和应用潜力,进行在体检测条件的优化和技术扩展.方法 将稳定高表达荧光素酶的乳腺癌细胞(4T-1-Luc+)和肝癌细胞(Huh-7-Luc+)接种于BALB/c 小鼠体内,通过活体成像仪进行生物发光检测灵敏度和毛发的影响分析,利用生物发光结合X线扩展活体成像技术.结果 毛发对小鼠皮下接种的肿瘤细胞的生物发光成像有干扰作用,在局部剃除毛发小鼠内体可以检测到50个细胞的光信号值.通过建立X结合发光的检测模型,实现了既能检测发光信号值强度大小,又能比较清晰地观测到部分脏器和发光体(病变组织)的部位.结论 实现了生物发光活体成像技术的检测条件优化,建立了X线结合发光新的检测模式,为扩展小动物活体成像的应用范围奠定了基础.
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HBV启动子对肝细胞具有特异性转录活性的研究
目的:探讨HBV转录调控核心序列在肝细胞中转录的活性.方法:构建HBV增强子和启动子调控的荧光素酶报告载体,用脂质体转染法将其转染肝细胞和非肝细胞,双荧光素酶报告基因试验检测其在不同细胞中的转录活性.结果:HBV启动子在2.2.15细胞中转录活性高,在其他肝细胞中的转录活性显著高于非肝细胞.结论:由HBV启动子构建的载体可能是一种新颖的有前景的靶向性肝癌细胞基因治疗载体.
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T7 RNA聚合酶体外转录合成siRNA的方法
目的:建立一种应用T7 RNA聚合酶体外转录合成大量siRNA的方法.方法:以萤火虫荧光素酶为靶标,应用T7 RNA聚合酶体外转录合成siRNA,脂质体转染法将其导入HepG2细胞中,通过测定荧光素酶的量,评价siRNA对萤火虫荧光素酶基因表达的抑制作用.结果:合成了以萤火虫荧光素酶为靶标的siRNA,合成的siRNA能特异性地抑制荧光素酶基因的表达,抑制率为80%.结论:建立了一种经济简便的体外合成siRNA的方法.
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感光受体外周蛋白结合蛋白对虫荧光素酶体外折叠的促进作用
目的探讨感光受体外周蛋白结合蛋白(PBP)在体外是否有促进变性蛋白质复性的作用.虫荧光素酶用盐酸胍变性,然后在PBP、HSP70、HSP60存在下进行体外复性,用虫荧光素酶分析系统检测该酶的复性程度.结果显示PBP对虫荧光素酶的复性能力很低,当与HSP70同时作用时,酶活力明显高于PBP或HSP70组,而PBP与HSP60组合对酶的复性能力较HSP60组未见有明显差异;当PBP,HSP70,HSP60三者同时存在时,酶活力恢复率高.去除复性缓冲液中的ATP及其再生系统,酶活力的复性率明显下降.结果表明PBP具有协助HSP70,在ATP依赖的情况下促进变性虫荧光素酶体外复性的分子伴侣功能.
关键词： 感光受体外周蛋白结合蛋白 热休克蛋白质类 荧光素酶 基因表达 突变 -
活体荧光成像技术评价X射线对小鼠乳腺癌移植瘤的治疗效果
目的 建立荧光素酶标记的小鼠乳腺癌细胞爪垫淋巴结转移模型,监测肿瘤早期淋巴结转移,并用荧光成像评价X射线局部治疗效果.方法 将表达荧光素酶的小鼠乳腺癌细胞系4T1-Luc接种至裸鼠爪垫皮下,建立爪垫皮下淋巴结转移模型.通过裸鼠活体荧光成像系统连续观察肿瘤细胞在淋巴结中的转移情况,并将有早期淋巴转移的荷瘤裸鼠按随机数字表法分为对照组和治疗组,活体荧光成像系统观察治疗效果,HE染色观察评价病理形态学变化.结果 成功建立了小鼠乳腺癌淋巴结转移模型,爪垫原发灶肿瘤体积与荧光光子数呈正相关性(r=0.958,P ＜0.001),在肿瘤接种的第24天,治疗组爪垫肿瘤和腘窝处肿瘤部位的荧光光子数较对照组呈显著性降低(t=32.58,P＜0.05);用荧光光子数计算抑瘤率高达85％以上.HE染色观察到治疗组较对照组移植瘤坏死明显.结论 运用活体生物发光成像技术能够动态、客观、灵敏、可视化地评估X射线对小鼠乳腺癌肿瘤的抑瘤效应.
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IDO1天然小分子抑制剂的筛选及抗肿瘤作用研究
PCR扩增人吲哚胺2,3-双加氧酶1(indoleamine 2,3-dioxygenase 1,IDO1)基因启动子上游区域1 245 bp基因片段,将其插入到pGL4.20-basic载体中构建了pGL4-IDO 1-1uc荧光素酶重组质粒.基于双荧光素酶报告基因方法建立IDO1抑制剂筛选模型,筛选能够下调肿瘤细胞中IDO1表达的天然活性小分子化合物.采用MTT、Western blotting和乳酸脱氢酶(LDH)等方法探讨阳性化合物的抗肿瘤作用及其对IDO1的调控机制.化合物川楝素(toosendanin,NS-180)能显著下调IFN-y诱导的肿瘤细胞中IDO1表达.在A549细胞中,NS-180可抑制STAT1和STAT3的磷酸化,从而下调IFN-γ诱导的IDO1蛋白表达.LDH释放实验表明,NS-180可促进NK细胞对A549细胞的杀伤作用.综上所述,筛选获得的天然小分子NS-180是一类新型高效的IDO1抑制剂,可能成为靶向IDO1的肿瘤免疫治疗候选药物.
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Toll样受体2特异性配基细胞筛选模型的构建及TLR2配基多肽的鉴定
Toll样受体2(TLR2)参与多种疾病的发生和进展.为了构建TLR2特异性配基的细胞筛选模型,将TLR2下游NF-κB启动子驱动信号通路的荧光素酶报告基因质粒转染至一系列稳定表达TLR2的人胚肾细胞,通过筛选得到稳定表达的细胞克隆.通过生物淘洗-快速差异筛选配基方法(BRASIL),从噬菌体展示随机7肽库中筛选出与TLR2特异性结合的噬菌体克隆C8.采用酶联吸附免疫法(ELISA)、流式细胞术和免疫荧光实验验证肽段C8可以特异性结合TLR2受体.荧光素酶活性测定验证C8可以激活TLR2/TLR1下游信号通路,促进该通路下游细胞因子的释放.以上结果显示,本研究成功构建了TLR2特异性配基细胞筛选模型并且筛选到一段TLR2特异性结合的肽段.
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应用动物活体生物发光技术观察紫杉醇混合胶束的抑瘤效果
活体动物成像技术是近年来发展成熟并得到认可的一种新型影像检测技术,其突出优越性是可以对活体病灶的形态大小进行在体无损伤直观准确检测~([1]).
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荧光素酶基因标记乳腺癌细胞系鉴定
目的 利用三阴性人乳腺癌MDA-MB-231细胞,对稳定表达荧光素酶的细胞系MDA-MB-231-Luc进行功能评价及鉴定.方法 构建荧光素酶的HIV慢病毒载体,体外感染乳腺癌MDA-MB-231细胞,经嘌呤霉素筛选后得到稳定表达的细胞系,采用MTT法,利用Transwell侵袭模型,应用伤口愈合细胞划痕实验评价细胞增殖、侵袭和转移能力.结果 利用慢病毒转染的MDA-MB-231细胞能稳定表达荧光素酶,与亲本细胞相比,细胞的增殖、侵袭、迁移能力无显著影响(P＞0.05).结论 慢病毒感染乳腺癌细胞能稳定表达荧光素酶,对MDA-MB-231细胞的增殖、侵袭、转移能力无明显影响,为后续的小动物活体成像实验提供细胞模型.
关键词： MDA-MB-231细胞 荧光素酶 增殖 侵袭 转移 -
荷瘤鼠活体成像研究进展
随着荷瘤鼠活体成像技术的发展,非侵袭性成像在临床前研究中发挥了越来越重要的作用.活体成像可以在微创或无创的条件下对活体组织或动物体内的生理生物活动进行成像跟踪.直观灵敏地检测基因的表达模式、标记和示踪细胞、探讨蛋白质间的相互作用.在此围绕可见光成像、核素成像、磁共振成像、计算机断层摄影和超声成像等5种活体成像技术,总结其特点及主要应用,并讨论活体成像技术的发展趋势.
