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草酸和草酸钙结晶损伤肾小管上皮细胞的差异蛋白质组学研究
目的 分析并鉴定草酸和一水草酸钙(COM)结晶损伤人肾小管上皮细胞(HK-2)后细胞蛋白质谱的表达变化,探讨肾小管上皮细胞受损在肾结石形成中的可能作用.方法 体外培养正常HK-2细胞至90%融合后,换无血清培养基,随机分为2组.实验组培养基内加入2 mmol/L草酸+200 mg/L COM结晶,37 ℃孵育.分别抽提2组细胞的总蛋白,双向凝胶电泳结合液相色谱-电喷雾离子阱质谱(LC-ESI-MS/MS)技术对2组中差异表达的蛋白质进行分离和鉴定.蛋白印迹法对鉴定出的蛋白进行验证.结果 成功建立细胞总蛋白的双向凝胶电泳图谱,经软件分析和质谱鉴定出差异蛋白质12个:FK506结合蛋白4、α-烯醇酶、M2型丙酮酸激酶、ATP合成酶α亚单位、3′,5′-二磷酸核苷酸酶1、核磷蛋白2、L-乳酸脱氢酶B、芽胞发芽蛋白3、Cofilin-1、Fascin、40S核糖体蛋白S17和胞液氨基肽酶1.差异蛋白涉及细胞能量代谢、细胞增殖、凋亡、钙离子通道活性调控、细胞运动及信号转导等多种生理活动.蛋白印迹法检测示HK-2细胞损伤后ENO1蛋白表达上调,而Cofilin-1表达下调,证实双向凝胶电泳和质谱分析可靠.结论 高浓度草酸和COM结晶可使正常人HK-2细胞蛋白表达发生改变,这些差异表达蛋白既可起到细胞的自我保护作用,又可能通过相应途径在肾结石的形成中起重要作用.
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肾小管上皮细胞转分化在慢性移植肾肾病中的作用
目的 探讨肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化在慢性移植肾肾病(CAN)的发生、发展中的作用.方法 36例移植肾穿刺标本分为正常组(N组),CAN组(C组),依Banff 97标准将C组按CANⅠ、Ⅱ、Ⅲ级分为C1、C2、C3组,每组9例.免疫组化染色半定量分析比较α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(VIM)、角质蛋白(CKAE1/AE3)和转化生长因子β1(TGF-β1)在各组中的表达,线性相关分析TGF-β1和α-SMA、VIM、CKAE1/AE3表达的相关性.结果 C1、C2、C3组α-SMA表达积分分别为0.95±0.07、1.78±0.12、2.42±0.31,VIM表达积分分别为0.74±0.05、1.31±0.18、2.34±0.25,组间呈递增趋势,均明显高于N组α-SMA表达积分0.07±0.02、VIM表达积分0.09±0.02(P＜0.05);移植肾组织中TGF-β1表达与α-SMA、VIM呈正相关(r分别为0.73、0.68,P＜0.05),而与CKAE1/AE3表达呈负相关(r＝-0.71,P＜0.05).结论 肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化参与了CAN的发生、发展,而局部肾组织中TGF-β1的表达上调可能是介导肾小管上皮细胞转分化的重要原因.
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牛磺酸对草酸和草酸钙晶体诱导的肾小管上皮细胞损伤的保护作用
目的 探讨牛磺酸在体外细胞培养中对草酸和草酸钙晶体诱导的肾小管上皮细胞损伤的保护作用及机制.方法 将体外培养的人远端肾小管上皮细胞(HK-2)随机分为5组:第1组,单纯HK-2细胞;第2组,HK-2细胞中加入草酸和一水草酸钙(COM);第3组,HK-2细胞中加入草酸、COM和牛磺酸;第4组,HK-2细胞中加入草酸、COM和夹竹桃麻素;第5组,HK-2细胞中加入草酸、COM和过氧化氢酶.培养6h后收集各组细胞上清液检测乳酸脱氢酶(LDH)、过氧化氢(H2O2)、8-异前列腺素(8-IP)含量及单核细胞趋化蛋白质-1(MCP-1)蛋白水平,RT-PCR法检测细胞内MCP-1 mRNA、P47 phox mRNA表达水平;MTT法测定培养24 h后的细胞存活率.结果 培养24 h后MTT法检测第1组细胞的吸光度A值为0.996±0.044,第2组为0.626±0.011,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05).培养6h后第1组细胞上清液H2O2、8-IP、LDH含量分别为(18.68±0.70) mmol/L、(12.72±1.69) ng/ml、(194.05±7.91) U/L,第2组分别为(53.27±1.88) mmol/L、(57.53±3.11)ng/ml、(484.34±29.44) U/L,两组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).第1组MCP-1蛋白水平为(17.32±2.32) pg/ml,第2组为(69.21±3.39) pg/ml,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05).第1组与第2组细胞的MCP-1 mRNA、P47phox mRNA表达水平倍增比值分别为1/3.51和1/1.38,两组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).MTT法检测第3、4、5组细胞的吸光度A值分别为0.748±0.033、0.825±0.078、0.815 ±0.037,与第2组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).第3、4、5组细胞上清液H2O2、8-IP、LDH含量均明显少于第2组.第3、4、5组细胞上清液MCP-1蛋白水平分别为(60.13±1.83)、(28.53±1.41)、(56.44±1.13) pg/ml,与第2组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).第3、4、5组细胞MCP-1 mRNA表达水平相对第1组的倍增比值分别为1/2.55、1/1.58、1/2.37,与第2组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).第3、5组细胞P47phox mRNA表达水平相对第1组的倍增比值分别为1/1.25、1/1.35,与第2组比较差异均无统计学意义(P＞0.05);第4组的倍增比值为1/0.61,与第2组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 草酸、COM可诱导HK-2细胞氧化应激损伤,细胞的P47phox mRNA和MCP-1 mRNA表达增加.牛磺酸可以减轻细胞的损伤,但机制可能不是通过抑制P47 phox表达的途径进行.
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草酸和一水草酸钙结晶对人肾小管上皮细胞的影响
目的 观察草酸和一水草酸钙结晶对体外培养的人肾小管上皮细胞(HK-2)的毒性作用和蛋白表达的影响,探讨上皮细胞受损在肾结石形成过程中的可能作用.方法 体外培养正常人HK-2细胞至长满后,换成无血清培养基,加入草酸至不同终浓度,显微镜下观察结晶的形成及其对细胞的粘附.收集结晶以傅立叶红外光谱仪(FT-IR)分析其成分.CCK-8试剂盒检测1、2、5和10mmol/L草酸分别作用4、12和24 h后对HK-2细胞的毒性反应,Bradford法检测HK-2细胞表达总蛋白量的变化.结果草酸加入含Ca2+的DMEM培养基后,数分钟内显微镜F即可见结晶形成并粘附于细胞表面.FT-IR分析表明结晶成分为一水草酸钙.草酸和一水草酸钙对HK-2的毒性作用呈明显浓度依赖性,但在1～10 mmol/L草酸浓度下毒性作用不随时间延长而增加.1、2、5mmol/L草酸作用12 h和对照组HK-2表达蛋白量分别为(358±51)、(365±43)、(328±52)和(329±60)mg/L,P值均＞0.05,而10 mmol/L草酸作用12 h后,HK-2表达蛋白量为(264±76)mg/L,显著低于对照组(P＜0.05).结论 草酸和一水草酸钙可对正常人HK-2细胞产生毒性损伤,造成细胞表达蛋白的改变,可能在肾结石的形成中起重要作用.
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肾小管上皮细胞损伤促进草酸钙结石形成的研究进展
泌尿系结石是一种常见的全球性多发病.我国成年人群尿石症的患病率高达6％[1],而且泌尿系结石复发率较高,10年内复发率高达30％[2],因此,了解泌尿系结石的发病机制对于结石的治疗和预防复发具有重要意义.草酸钙结石是为常见的泌尿系结石 [3],但确切机制尚未完全阐明 [4-5].目前的研究显示肾小管上皮细胞损伤之后,其细胞膜的结构及相关生理功能发生变化,是草酸钙结石形成的重要因素之一 [6-7].
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急性肾损伤的体外细胞治疗
急性肾损伤是临床常见病，其发病率有逐年升高趋势。伴有急性肾损伤的危重症患者往往具有高死亡率的特点。近年来，开展了众多不同于传统疗法的治疗研究，以期改变急性肾损伤患者预后不佳的现状。其中，细胞疗法逐渐发展为一种用于治疗大量临床疾病的新方法。出于安全考虑，体外细胞疗法可能会是一种更好的选择，因为其不仅替代了受损细胞的功能或调整了病理生理过程，而且提供了免疫绝缘屏障。本文就肾小管上皮细胞、粒细胞及血管内皮细胞的不同体外细胞疗法做出阐述。相比于传统的连续性肾脏替代治疗，肾小管上皮细胞、粒细胞的体外细胞疗法对于急性肾损伤患者的存活有着重大且积极的影响。上海交通大学医学院附属第九人民医院肾脏科构建了一种血管内皮体外细胞治疗系统，可明显改善脓毒症动物的血流动力学稳定性及多种脏器功能，并提高存活率。这些研究对于改善急性肾损伤患者的预后具有积极意义。
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P2X4介导高糖刺激肾小管上皮细胞分泌白介素-1β的作用
目的 探讨P2X4 介导高糖刺激肾小管上皮细胞分泌白介素(IL)-1β 的作用.方法 利用不同浓度(5 ~ 50 mmol/L)葡萄糖刺激肾小管上皮细胞株(HK-2)0 ~ 72 h,观察细胞上清液中三磷酸腺苷(ATP)和白介素(IL)-1β 的表达.利用细胞外ATP 分解酶(Apyrase)与高糖(35 mmol/L)同时刺激HK-2 细胞48 h,观察细胞上清液IL-1β 的水平.利用小干扰RNA(siRNA)基因沉默HK-2细胞的P2X4 基因,观察高糖对细胞内钾离子钙离子浓度变化和细胞上清液中IL-1β水平的影响.利用PBFI-AM染色剂检测细胞内钾离子,利用Fluo-3/AM检测细胞内钙离子.两组间检测均数的比较采用t 检验.两组以上检测均数的比较进行单因素方差分析.结果 高糖刺激下HK-2 细胞上清液中IL-1β、ATP水平升高呈剂量和时间依赖性.Apyrase 能完全阻断高糖刺激细胞分泌IL-1β(8.2±4.9 μg/L与18.5±4.0 μg/L,P < 0.05).高糖刺激下HK-2 细胞内钾离子浓度降低,钙离子浓度升高.P2X4 基因沉默能够显著阻断高糖刺激下IL-1β 的分泌(12.5±2.9 μg/L与20.3±5.3 μg/L,P < 0.05).结论 P2X4 可介导糖尿病肾病肾小管上皮细胞分泌IL-1β,从而促进肾间质炎症反应.
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EGCG对氧化应激诱导的大鼠NRK细胞Nrf2和γ-GCS基因表达的影响
目的 研究表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对过氧化氢(H2O2)诱导的肾小管上皮细胞(NRK)抗氧化反应的机制.方法 将培养细胞分正常对照组、H2O2模型组、EGCG治疗组.MTT法检测细胞活力,实时定量PCR法检测NRK细胞核因子-E2相关因子2(nuclear factor-E2 related factor2,Nrt2)mRNA和γ-谷氮酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamylcystein synthase,γ-GCS)mRNA表达,免疫组化法检测NRK细胞中Nrf2、γ-GCS蛋白的表达,Western blot法测定NRK细胞Nrf2、γ-GCS蛋白表达量.结果 正常对照组NRK细胞的活性为97.61±6.33,模型组NRK细胞的活性明显降低(56.38±5.57)(P<0.01).当EGCG浓度分别为5、10、20 me,/L时,细胞活性为77.42±5.31、83.27±5.94、90.24±5.72,明显高于模型组(P<0.05,P<0.01).EGCG可以上调NRK细胞Nrf2和γ-GCS mRNA和蛋白的表达,且具有剂量依赖性.结论 氧化应激能导致大鼠NRK活力下降,凋亡增加,EGCG通过促进Nrf2、γ-GCS表达的增加,提高NRK细胞的抗氧化能力,促进氧化应激后损伤的修复.
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缺血再灌注损伤对新生鼠肾小管上皮细胞calpain的影响
calpain是一种钙依赖性半胱氨酸蛋白酶,钙离子浓度升高使其激活.细胞骨架蛋白和膜蛋白都是calpain的水解底物.过去calpain被认为介导了缺氧对心脏、肝脏和大脑所致的损伤.
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胚胎后肾间充质细胞移植对急性肾小管坏死肾小管上皮细胞凋亡和增生的影响
以往普遍认为肾小管损伤的修复机制为周围剩余的上皮细胞分裂、增殖代替坏死的小管上皮细胞.近年来研究表明,减少肾小管上皮细胞的程序化死亡,或使处于程序化死亡中的上皮细胞"复活",也可促进急性肾小管损伤的修复[1-2].
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斑蝥素抗肾小管上皮细胞低氧损伤的研究
斑蝥素作为细胞蛋白磷酸酶(PP2A)抑制剂,具有稳定病理状态下肾小球内皮细胞肌动蛋白微丝(Factin)骨架系统的抗低氧损伤作用[1,2].能否抗肾小管上皮细胞低氧损伤未发现文献报道.
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保元排毒丸对顺铂引起的LLC-PK1细胞凋亡干预作用研究
目的:观察保元排毒丸对顺铂(DDP)所致猪肾小管上皮细胞(LLC-PK1)凋亡的影响.方法:LLC-PK1细胞分三组培养,空白血清组采用不含药血清进行培养,模型组分别以10和6μg/mL不同浓度的DDP进行培养,模型+含药血清组是在不同浓度的DDP基础上予以10%保元排毒丸含药血清进行培养.培养24 h后分别以荧光显微镜、电镜、流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果:与空白血清组比较,荧光显微镜下模型组凋亡细胞增多,而模型+含药血清组凋亡细胞数明显减少;电镜下模型组细胞受损明显,而模型+含药血清组细胞形态基本正常.流式细胞仪检测细胞凋亡率,空白对照组为2.45%;各DDP组明显增加,10μg/mL组和6μg/mL组分别为31.80%和30.98%,与空白对照组比较差异有统计学意义,P＜0.001;各含药血清组明显减少,DDP 10μg/mL+含药血清组和DDP 6μg/mL+含药血清组分别为15.21%和14.27%,与相应模型组比较差异有统计学意义,P＜0.001.模型组bcl-2基因及突变型p53基因的表达均明显降低,相应含药血清组的表达均有所上调.结论:保元排毒丸能减轻顺铂所致LLC-PK1细胞的凋亡,上调凋亡抑制基因bcl-2和突变型p53,可预防或降低顺铂引起的肾毒性.
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PI3-K的激活在TGF-β1诱导肾小管上皮细胞间质转分化过程中的作用
目的探讨磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-K)的激活在转化生长因子β1(TGF-β1)体外诱导人肾小管上皮细胞(HKCs)间质转分化(EMT)过程中的作用及意义.方法将HKCs细胞株分为正常对照组(C)、不同浓度TGF-β1组、TGF-β1+PI3-K抑制剂Wortmannin组.选取不同时相,采用免疫印迹法(Western blot)测定总Akt(t-Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和E-钙黏素(E-cadherin)蛋白水平的表达变化;Akt磷酸化水平用磷酸化Akt与总Akt水平的比值表示.结果正常体外培养的HKCs经10ng/ml TGF-β1刺激1h后p-Akt水平显著升高;α-SMA蛋白表达水平在10ng/ml TGF-β1诱导48h后表达显著升高,而E-cadherom蛋白表达水平在TGF-β1诱导48h后表达显著下降.同时加用Wortmannin 10nmol/L组,p-Akt、α-SMA表达明显抑制,E-cadherin表达显著升高.结论PI3-K在TGF-β1诱导的EMT过程中被激活,并且参与TGF-β1诱导的EMT过程,特异性阻断PI3-K的激活可有效抑制TGF-β1介导的HKCs的EMT过程.
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转化生长因子β1对人肾小管上皮细胞表达桩蛋白的影响
目的探讨重组人类转化生长因子β1(rhTGF-β1)对人近端肾小管上皮细胞(HKC)桩蛋白(Pax)表达时相的影响.方法将体外培养的HKC随机分为4组.对照组(C组):无血清培养基(FSM)培养;rhTGF-β1培养组(T1、T2、T3组):分别用含10ng/ml TGF-β1的FSM培养,取不同时相点(T1 组24h,T2组48h,T3组72h)终止培养.MTT法检测rhTGF-β1诱导HKC增殖的时效关系,RT-PCR检测HKC的Pax mRNA表达,免疫组化和Western blot检测Pax蛋白的表达.结果 C组可检测到Pax mRNA和蛋白表达;Pax mRNA和蛋白表达T组明显高于C组,且T2、T3组明显高于T1组(P<0.01).结论 TGF-β1诱导HKC合成Pax具有时间依赖性.
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Cyr61基因过表达对人肾小管上皮细胞表达细胞外基质成分的影响
目的观察Cyr61基因过表达对人肾小管上皮细胞(HKC)表达细胞外基质成分的影响,探讨Cyr61在常染色体显性多囊肾病(ADPKD)发病中的作用及机制.方法 RT-PCR扩增Cyr61全长基因,构建pcDNA3.1+Cyr61重组质粒,转染HKC细胞.经RT-PCR、Western blot鉴定转染细胞系Cyr61基因的整合及表达.荧光定量PCR检测空白HKC、空质粒pcDNA3.1转染的HKC、Cyr61转染的HKC和囊肿衬里上皮细胞内Cyr61、I型和Ⅳ型胶原、层黏连蛋白的基因表达.结果构建了pcDNA3.1+Cyr61重组质粒并转染HKC细胞.Cyr61基因转染组和囊肿衬里上皮细胞内Cyr61蛋白表达显著高于空白HKC组,Cyr61基因转染组的I型和Ⅳ型胶原、层黏连蛋白mRNA表达都明显增高,且Ⅳ型胶原的基因表达增高程度远大于Ⅰ型(P<0.01).但Cyr61基因转染组上述细胞外基质成分的表达仍显著低于囊肿衬里上皮细胞(P<0.01).结论过表达Cyr61的HKC表达细胞外基质成分明显增强,尤以Ⅳ型胶原为著.过表达的Cyr61可能通过调节细胞外基质成分,促进细胞外基质重构,参与ADPKD囊肿的形成和发展.
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死亡相关蛋白(DAP-5)在庆大霉素诱导的人肾小管上皮细胞凋亡过程中的表达变化及机制
目的 建立庆大霉素诱导人肾小管上皮细胞(HK2)凋亡模型;观察死亡相关蛋白5(DAP5)在HK2凋亡过程中的表达变化,并探讨其与PI3K/Akt/mTOR通路之间的关系.方法 以3.2mg/ml庆大霉素作用于HK2,应用琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞DNA条带,流式细胞仪测定细胞凋亡率.采用Western blotting法观察DAP5与Akt、P-Akt表达的改变,应用雷帕霉素阻断PI3K/Akt/mTOR通路后观察DAP5的表达变化.结果 庆大霉素作用24h后HK2细胞即出现凋亡,凋亡率随时间延长而增加,24、36, 72h的凋亡率分别为5.9％,23.0％,49.9％(P＜0.05).与此同时,细胞DAP5活化裂解生成DAP5/p86,且表达逐渐增加(P＜0.05).在凋亡的同时p-Akt蛋白的表达水平也逐渐增加(P＜0.05),应用雷帕霉素阻断PI3K/Akt/mTOR通路后,裂解产生的DAP5/p86减少(P＜0.05).结论 庆大霉素可诱导HK2细胞发生细胞凋亡,凋亡率随时间的延长而增加.在诱导HK2细胞凋亡过程中DAP5裂解活化产生DAP5/p86,且这一过程可能是经过PI3K/Akt/mTOR途径来完成的.
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微小RNA-374a对高糖诱导人肾小管上皮细胞单核细胞趋化蛋白-1等炎症因子表达的影响
目的 研究微小RNA-374a (miRNA-374a) 对高糖环境下人肾小管上皮细胞 (HK2) 中单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1) 及相关炎症因子表达的影响, 探讨miRNA-374a调控促炎因子表达介导炎症反应参与糖尿病肾病进展的可能机制.方法 体外培养人近端肾小管上皮细胞系 (HK2), 按如下处理分组: (1) 正常对照组 (D-葡萄糖5.6 mmol/L);(2) 甘露醇组 (D-葡萄糖5.6 mmol/L+D-甘露醇24.4 mmol/L);(3) 高糖组 (D-葡萄糖30 mmol/L);(4) 转染对照组;(5) miRNA-374a mimics转染组;(6) miRNA-374a inhibitor转染组.培养24 h收获细胞.Western印迹法检测细胞单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1) 蛋白的表达, 实时荧光定量PCR (qRTPCR) 法检测细胞miRNA-374a、MCP-1 mRNA的表达, ELISA法检测细胞白介素6 (IL-6) 、白介素18 (IL-18) 、肿瘤坏死因子α (TNF-α) 蛋白的表达.结果 与正常对照组相比, 高糖组细胞miRNA-374a表达明显减少 (P＜0.05), MCP-1蛋白及mRNA表达明显增加, IL-6、IL-18、TNF-α蛋白的表达均增加 (均P＜0.05) .与高糖组相比, miRNA-374a mimics转染组细胞MCP-1蛋白及mRNA表达明显减少, IL-6、IL-18、TNF-α蛋白的表达均相应显著降低 (P＜0.05) .与高糖组相比, miRNA-374a inhibitor转染组细胞MCP-1蛋白及mRNA表达明显增加, IL-6、IL-18、TNF-α蛋白的表达均显著增加 (P＜0.05) .结论 高糖环境下miRNA-374a很可能通过调控肾小管上皮细胞MCP-1等炎症因子的表达参与糖尿病肾病炎症反应的发生发展.
关键词： 糖尿病肾病 肾小管上皮细胞 微小RNA 炎症 单核细胞趋化蛋白-1 -
基质硬度对人肾小管上皮细胞形态和葡萄糖转运蛋白表达的影响
肾小管间质纤维化以细胞外基质沉积、瘢痕硬化为特点,是慢性肾脏疾病发展至终末期肾衰竭的共通途径.本研究拟构建体外细胞培养模型探索基质硬度对肾小管上皮细胞形态和功能的影响.采用光催化成胶的聚丙烯酰胺凝胶(PAA gel)制备模拟肾间质纤维化组织硬度的凝胶基质(1～40 kPa);接种人肾小管上皮细胞(HK-2)于不同硬度的PAA gel表面,采用免疫荧光染色和共聚焦显微镜考察基质硬度对HK-2形态的影响,并对HK-2细胞上的葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)、葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)和葡萄糖转运蛋白5(GLUT5)的分布进行定性和半定量考察.研究发现,随着基质硬度增加,HK-2细胞上的GLUT1表达量显著降低,GLUT5在细胞整体的表达量显著下降,而GLUT2的表达和分布未见明显改变.
