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子宫内膜细胞体外三维培养
建立着床期子宫内膜体外模型、探讨胚胎的着床机制对提高体外受精-胚胎移植(IVF-ET)助孕治疗的成功率、降低流产率及有效避孕均具有重要意义.目前,国内外的研究多用分泌期子宫内膜经短期体外培养形成子宫内膜的立体模型,但由于所用分泌期内膜细胞已经受体内因素的作用,而且体外培养时间短,不适用于探讨各种因素对子宫内膜窗口期的影响.本研究利用增殖期子宫内膜上皮细胞和问质细胞,经体外培养建立分泌期子宫内膜模型.现将结果报道如下.
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雌二醇和孕酮诱导猪子宫内膜上皮细胞OPN的表达状况
目的 探讨雌二醇和孕酮对猪子宫内膜上皮细胞内的骨桥蛋白基因作用效果.方法 采用RT-PCR和Western-blot的方法,检测了猪子宫内膜上皮细胞中OPN基因的表达情况;采用半定量RT-PCR法检测添加终浓度为1 μmol/L、0.1 μmol/L、0.01 μmol/L雌二醇和0.1 μmol/L、0.01 μmol/L、0.001 μmol/L孕酮作用24 h和48 h后,OPNmRNA的表达变化情况.结果 猪子宫内膜上皮细胞在非孕期转录OPN mRNA,表达70×103和45×103的OPN蛋白;添加雌二醇24 h后,OPN mRNA的表达水平降低了50%～53%(P＜0.05),48 h后降低了12%～25%(P＜0.01),均显著低于对照组;添加孕酮后,OPN mRNA的表达无显著变化(P＞0.05).结论 雌二醇抑制了OPN的表达,推测孕酮本身对OPN的表达不起作用.
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血管紧张素-(1-7)对血管紧张素Ⅱ诱导的子宫内膜上皮细胞增殖和转分化的影响
目的 了解血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和血管紧张素-(1-7)[Ang-(1-7)]对子宫内膜上皮细胞(EECs)增殖和活性的影响.方法 体外分离、培养和鉴定EECs.试验分4组:对照组、AngⅡ组、Ang-(1-7)组和AngⅡ+Ang-(1-7)组,采用噻唑蓝(MTT)法观察各组EECs增殖的影响;免疫细胞化学染色法检测各组EECs中的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和上皮性钙粘附素(E-cadherin)的表达水平;用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组上清液中Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)和纤粘连蛋白(FN)的含量.结果 在48和72 h时,AngⅡ组EECs数量明显增加;细胞中α-SMA蛋白的表达升高(77.67±1.78),E-cadherin的表达降低(26.56±2.09);ColⅠ和FN分泌均增加(0.8320±0.0292,0.752 8±0.071 2),与对照组相比,其差异有统计学意义(P＜0.05).Ang-(1-7)+AngⅡ组的EECs数量减少;细胞胞质中α-SMA的含量降低(33.58±1.34),而E-cadherin的含量升高(66.86±2.76);Col Ⅰ和FN分泌均减少(0.635 5±0.026 5,0.557 3±0.038 5),与AngⅡ组相比,其差异有统计学意义(P＜0.05).结论 Ang-(1-7)不仅可拮抗AngⅡ刺激的EECs增殖,还可抑制其活性.
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转化生长因子-β1对子宫内膜上皮细胞向肌成纤维细胞转分化的影响
目的 探究转化生长因子-β1 (TGF-β1)对子宫内膜组织中的上皮细胞(EECs)数目和转分化的影响.方法 收集正常子宫内膜组织并分离其上皮细胞.将细胞分为正常组(只加培养液)和实验组(培养液和不同浓度的TGF-β1),采用噻唑兰染色反映活细胞的数量;用酶联免疫法测出各组细胞悬液中Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)和纤粘连蛋白(FN)的分泌情况.免疫印迹法比较各组细胞胞质中的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和钙粘附蛋白-E(E-cadherin)的蛋白含量.结果 经TGF-β1作用后,在第1天时,实验组的细胞数目与正常组相比,差异无统计学意义(P＞0.05),在第2和第3天时,TGF-β1各组EECs的OD值≥0.119 0±0.000 9,且浓度越大,时间越长,增殖率越高;细胞悬液中Ⅰ型胶原[(0.745 6±0.038 9)ng/L]和纤粘连蛋白[(0.724 2±0.041 1)ng/L]的分泌量增多,胞质中表达的钙粘附蛋白-E的量≤0.656±0.028,而α-平滑肌肌动蛋白的量≥0.441±0.031;与正常组比较,其差异有统计学意义(P＜0.05).结论 TGF-β1能刺激子宫内膜组织中的上皮细胞数目增加,还诱导其向肌成纤维细胞转变.
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血管紧张素Ⅱ对人子宫内膜上皮细胞增殖和活力的影响
目的 观察和分析血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对人子宫内膜上皮细胞(EECs)增殖和活力的影响.方法 分离原代EECs并常规培养.试验分为对照组和AngⅡ组.对照组:加入不含血清的培养液;AngⅡ组:加入不同浓度的AngⅡ,通过噻唑蓝(MTT)染色察看各组细胞的增殖率;用ELISA法分析各组孵育液中Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)和纤粘连蛋白(FN)的含量.免疫细胞化学技术分析各组EECs胞质内的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和上皮性钙粘附素(E-cadhenn)的表达水平.结果 不同浓度AngⅡ组的EECs增殖率均显著升高,且表现为剂量依赖的趋势;细胞内α-SMA含量(71.71±1.47)升高,E-cadherin含量(25.32±1.43)降低;Col Ⅰ和FN分泌量(0.774 7±0.048 0;0.758 0±0.042 0)均增加,与对照组比较,其差异有统计学意义(P＜0.05).结论 AngⅡ能使子宫内膜上皮细胞增殖,并刺激使其发生活力改变.
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枸杞多糖对氧化应激损伤人子宫内膜上皮细胞的保护作用
目的 探讨枸杞多糖(LBP)对过氧化氢(H2O2)诱导的人子宫内膜上皮细胞(Human endometrial epithelium cells,EECs)损伤的影响.方法 实验分4组,正常对照组:正常细胞培养,不添加任何药物;H2O2对照组:人子宫内膜上皮细胞中加入0,10 mmol/LH2O2;LBP对照组:细胞中加入100 μg/ml LBP;LBP+H2O2组:细胞先用LBP作用1h,再加入H2O2共同培养30 min.MTT比色法检测各组细胞活力;用比色法检测细胞培养液中过氧化物丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活力;流式细胞仪检测各组细胞凋亡率.结果 H2O2组的EECs存活率降低(52.40±1.31)％,细胞凋亡率增加(45.20±1.32)％,EECs释放MDA的量升高(8.13±1.56) μg/ml,而SOD的活力降低(2,11±0.74) kU/g Pro,与正常对照组相比,其差异有统计学意义(P＜0.01);与H2O2组相比,LBP+H2O2组的EECs存活率升高(95.20±8.25)％,细胞凋亡率减少(15.66±0.26)％,EECs释放MDA的量增加(4.32±t.34) μg/ml,而SOD的活力升高(3.33±0.91) kU/g Pro,其差异有统计学意义(P＜0.01).结论 LBP能抑制H2O2诱导的子宫内膜上皮细胞损伤,对子宫内膜上皮细胞具有明显的保护作用.
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月舒滴丸对大鼠子宫内膜及平滑肌细胞OTR表达的影响
目的:探讨月舒滴丸对大鼠子宫平滑肌细胞缩宫素受体(Oxytocin receptor,OTR)基因表达及对大鼠子宫内膜上皮细胞前列腺素(Prostaglandin,PG)合成的影响,阐明月舒滴丸治疗原发性痛经的作用机制.方法:分别采用雌二醇(Estradiol,E2)和缩宫素(Oxytocin,OT)刺激,复制子宫平滑肌细胞OTR高表达模型,采用RT-PCR法,探讨月舒滴丸对子宫平滑肌细胞OTR基因表达的影响;采用Elisa法观察月舒滴丸干预对大鼠子宫内膜上皮细胞PGF2α、PGE2含量变化的影响.结果:月舒滴丸能明显降低大鼠子宫平滑肌细胞OTR基因表达,并可以显著降低大鼠子宫内膜上皮细胞PGF2α水平,提高PGE2表达,降低子宫内膜细胞PGF2α/PGE2水平.结论:通过月舒滴丸的干预,可减轻缩宫素的刺激,从而使子宫平滑肌细胞OTR低表达,减少子宫平滑肌细胞对OT的敏感性,并且能够有效调节大鼠子宫内膜上皮细胞前列腺素水平.
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子宫内膜上皮细胞与小鼠胚胎共培养对小鼠胚胎早期发育的影响
目的:采用子宫内膜上皮细胞与小鼠胚胎共培养,观察其对早期胚胎体外发育的影响.方法:对小鼠子宫内膜上皮细胞进行分离、培养鉴定,然后与体外受精的小鼠胚胎进行共培养,观察共培养对小鼠胚胎卵裂率、孵化率以及囊胚期胚胎总细胞数的影响.结果:与无上皮细胞相比,共培养明显促进了小鼠桑椹胚率(71.3%和61.2%,P＜0.05),囊胚率(50.0%和39.7%,P＜0.05),囊胚孵化率(34.8%和24.3%,P＜0.05)和胚胎总细胞数(44.1和35.6,P＜0.05).结论:子宫内膜上皮细胞能够促进小鼠胚胎的体外发育,对早期胚胎的体外发育环境具有优化作用.
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人子宫肌瘤上皮细胞的分离培养及GnRH I在其中的表达与意义
目的 分离培养人子宫内膜上皮细胞.仞步探讨GnRH I在其中的表达与意义.方法 分离正常人子宫内膜上皮细胞与子宫肌瘤患者子宫内膜上皮细胞并传代培养,采用角蛋白单克隆抗体进行鉴定后,免疫组化检测GnRH I蛋白的表达,流式细胞术检测GnRH I对子宫内膜上皮细胞凋亡的影响.结果 分离的子宫内膜上皮细胞在体外能够生长良好并能稳定传代,GnRH I在正常子宫内膜上皮细胞不表达或弱表达,在子宫肌瘤患者子宫内膜上皮细胞中高表达或表达增强;流式细胞术检测提示在人子宫肌瘤上皮细胞发生的凋亡率高于正常子宫内膜上皮细胞,两者比较差异有统计学意义. 结论 体外分离培养子宫内膜上皮细胞成功;GnRH I在正常子宫上皮细胞与子宫肌瘤上皮中存在差异表达;GnRH I蛋白能够引起子宫肌瘤上皮细胞发生凋亡,可能通过信号传导通路参与了子宫肌瘤的发生与发展.
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血管内皮生长因子在子宫腺肌病中的表达及意义
目的:观察血管内皮生长因子在子宫腺肌病的腺上皮细胞胞浆中的表达,探讨血管内皮生长因子在子宫腺肌病中的表达意义.方法:方法:选取清远市妇幼保健院手术治疗的患者40例作为观察组,并纳入同时期来本院进行手术的子宫肌瘤患者40例作为对照组.对两组患者组织中的血管内皮生长因子表达水平分为分泌期及增生期的差异进行统计比较.结果:患者的血管内皮生长因子在子宫腺肌病中的位内膜分泌期中在高表达,较在位内膜增生期,差异具有统计学意义(P＜0.05).血管内皮生长因子在腺肌病在位内膜增生期与分泌期的表达均分别高于在正常内膜增生期与分泌期的表达,两组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论:子宫腺肌病病灶及在位内膜中血管内皮生长因子的表达上调,所以可以推断血管内皮生长因子参与了子宫腺肌病的发生与发展过程.
关键词： 血管内皮生长因子 子宫肌腺病 子宫腺肌病腺上皮细胞 子宫内膜上皮细胞 -
新型避孕环对子宫内膜增生的治疗作用
子宫内膜组织增生是临床常见的一组病变,根据子宫内膜上皮细胞有无异型性分为:单纯性增生、复杂性增生和不典型增生.单纯增生和复杂增生属于良性病变,不典型增生属于癌前病变.
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雌、孕激素对体外培养种植窗期子宫内膜腺上皮细胞降钙素表达的调节
目的探讨雌、孕激素对体外培养人类子宫内膜腺上皮细胞降钙素(Ct)表达的影响及其意义.方法建立子宫内膜腺上皮细胞体外培养体系,分别用雌二醇(E2)、孕酮(P4)刺激细胞24 h、48 h,其浓度分别为1×10-7、1×10-8、1×10-9mol/L和1×10-6、1×10-7、1×10-8mol/L,利用流式细胞仪对Ct表达阳性细胞进行检测.结果性激素影响体外培养的人子宫内膜上皮细胞Ct的表达,P4促进Ct表达,并呈剂量依赖性,1×10-6mol/L作用24 h,其促进效应强;而低剂量E2对Ct表达无明显影响,高浓度E2则抑制其表达.结论子宫内膜上皮细胞Ct的表达受性激素调节,在人类胚胎着床过程中起重要作用.
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正常T细胞表达和分泌增强调节因子在体外培养人的子宫内膜上皮细胞中的表达
目的:研究Th1型和Th2型细胞因子在体外培养的人子宫内膜上皮细胞中对正常T细胞表达和分泌增强调节因子(RANTES)产生的调节影响.方法:用Th1型细胞因子[肿瘤坏死因子(TNF)-α和干扰索(IFN)-γ]以及Th2型细胞因子[白细胞介素(IL)-4和IL-13]刺激体外培养的人子宫内膜上皮细胞24h后,用酶联免疫测定法检测上清液中RANTES的浓度.结果:IFN-γ诱导的人子宫内膜上皮细胞产生RANTES,而TNF-α则无此影响.IL-4和IL-13也都同样诱导RANTES的产生.结论:Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4和IL-13都诱导RANTES的产生,提示不论是细胞免疫还是体液免疫反应RAN-TES都参与,可进一步推测在以细胞免疫反应为主的妇女月经、盆腔感染、受精卵着床,以及以体液免疫反应为主的妊娠、妊娠维持过程中,RANTES是必不可少的一种化学因子.
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角质细胞生长因子对无排卵型功血子宫内膜上皮细胞生长与分泌CA125的影响
目的 观察角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor,KGF)对离体培养的无排卵型功血子宫内膜上皮细胞生长和分泌CA125 的影响.方法体外培养无排卵型功血子宫内膜上皮细胞,加入不同浓度的KGF作用后,微量噻唑蓝分析法检测细胞量,了解生长情况,磁酶免法测定CA125分泌,分析两者之间的相关性,并与培养的正常子宫内膜上皮细胞进行比较.结果 ①无排卵型功血子宫内膜上皮细胞与正常子宫内膜上皮细胞的外观特征相似;CK19免疫组化染色结果为无排卵型功血子宫内膜上皮细胞的细胞质被染成棕黄色.②不同浓度的KGF作用体外培养的无排卵型功血子宫内膜上皮细胞后,细胞增生明显,但增生程度不如正常子宫内膜上皮细胞(P<0.05).③不同浓度KGF作用后两组子宫内膜上皮细胞的CA125浓度均升高,无排卵型功血子宫内膜上皮细胞的增高程度明显低于正常子宫内膜上皮细胞(P<0.05).④正常和功血的子宫内膜上皮细胞中二者的吸光度值与细胞培养上清液中的CA125浓度有显著的相关性,两者的相关系数分别为0.681 和 0.885(P<0.05).结论 KGF对体外培养的无排卵型功血子宫内膜上皮细胞有促进生长和分泌CA125的作用,但促进作用的程度不如正常子宫内膜上皮细胞,提示无排卵型功血子宫内膜上皮细胞存在与正常子宫内膜上皮细胞不同的生长机制和功能,可能参与无排卵型功血的发病.
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角质细胞生长因子对无排卵功血子宫内膜上皮细胞PCNA、ER和PR表达的影响
目的 观察角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor,KGF)对离体培养的无排卵型功血子宫内膜上皮细胞EEC中增殖细胞核抗原PCNA、雌激素受体ER和孕激素受体PR表达的影响.方法 体外培养无排卵型功血子宫内膜上皮细胞,加入不同浓度的KGF作用后,免疫组化法检测PCNA、ER和PR的表达变化,RT-PCR检测ER和PR mRNA表达的变化.结果 免疫组化染色结果,PCNA蛋白表达位于细胞核,ER和PR蛋白表达主要位于细胞核内,少数可见细胞质着色;50 ng/ml KGF作用后,正常组和功血组PCNA表达分别较作用前的对照组显著增高,ER和PR表达分别较作用前的对照组显著增高(P＜0.05);PCNA和ER表达的增加幅度在正常组和功血组之间无显著差异(P>0.05);而功血组PR表达的增加幅度显著高于正常组(P＜0.05);50.ng/ml KGF作用后,RT-PCR方法检测正常组和功血组ER和PR的mRNA表达,分别较作用前的对照组显著增高(P＜0.05).结论 KGF对体外培养的无排卵型功血和正常的子宫内膜上皮细胞均有增加PCNA、ER和PR表达的作用,但增加程度有差异,提示两组的子宫内膜上皮细胞生长均受KGF的影响,但无排卵功血可能存在与正常的子宫内膜上皮细胞不同的生长机制.
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孕激素诱导的microRNA-152对子宫内膜上皮细胞增殖的抑制作用
目的 研究孕激素诱导microRNA-152的表达及其对子宫内膜上皮细胞增殖的抑制作用.方法 培养子宫内膜上皮细胞Ishikawa,将其分为4组,分别为空白对照组(control,C组)、10-8 mol/L雌激素处理组(estrogen,E组)、10-6 mol/L孕激素处理组(progesterone,P组)以及相应浓度的雌、孕激素联合处理组(estrogen plus progesterone,E&P组),利用实时定量PCR检测microRNA-152的成熟体microRNA-152-3p的表达.将microRNA-152-3p拟似剂转染雌激素预处理的细胞,microRNA-152-3p抑制剂转染雌、孕激素联合处理的细胞,CCK-8法观察microRNA-152-3p对细胞增殖的影响.利用microRNA靶蛋白数据库预测microRNA-152-3p的靶蛋白,并利用Western blot加以验证.结果 实时定量PCR结果显示E组与C组相比,其细胞microRNA-152-3p的表达量无明显变化(P＞0.05);P组细胞microRNA-152-3p的表达量相比C组增加(P＜0.05);且E&P组的microRNA-152-3p表达量高于C组和P组(P均＜0.05).对microRNA-152-3p靶蛋白的预测表明CDC14A是其一个重要的靶蛋白.转染microRNA-152-3p拟似剂能够抑制雌激素对子宫内膜上皮细胞的增殖效应(P＜0.05),同时下调CDC14A蛋白的表达(P＜0.05).而microRNA-152-3p抑制剂能一定程度解除孕激素对子宫内膜上皮细胞的增殖抑制效应(P＜0.05),同时上调CDC14A蛋白水平(P＜0.05).结论 孕激素可通过诱导microRNA-152-3p的表达抑制子宫内膜上皮细胞的增殖,CDC14A蛋白可能是microRNA-152-3p抑制子宫内膜上皮细胞增殖的靶蛋白.
关键词： 孕激素 microRNA-152 子宫内膜上皮细胞 CDC14A -
OPN与MMP-9在子宫腺肌症内膜上皮细胞的表达和意义
目的 检测OPN与基质金属蛋白酶-9(MMP-9)在分离培养的腺上皮细胞中的表达特点,探讨OPN与MMP-9在子宫内膜腺上皮细胞中的表达意义.方法 通过实时定量反转录-聚合酶链反应(Real-time RT-PCR)测定分离培养的内膜上皮细胞中OPN与MMP-9 mRNA表达.结果 OPN mRNA在子宫腺肌症的增殖期和分泌期均高表达,无明显的周期变化;MMP-9 mRNA在子宫腺肌症分离培养的上皮细胞的分泌期高表达,较增殖早中期差异有统计学意义(P＜0.05);OPN与MMP-9 mRNA在人正常子宫内膜中分离的上皮细胞增殖期低表达,而在月经周期的分泌期呈高表达,差异有统计学意义(P＜0.05);结论 OPN与MMP-9在子宫腺肌症上皮细胞高表达,可能与子宫腺肌病的发生发展有关.
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骨桥蛋白在子宫腺肌病中的表达及意义
目的 应用免疫组织化学S-P法检测骨桥蛋白(OPN)在子宫腺肌病的腺上皮细胞胞浆中的表达,探讨OPN在子宫腺肌病中的表达意义.方法 收集来我院手术治疗的子宫腺肌病患者40例作为观察组,纳入同时期来我院进行手术的子宫肌瘤患者40例作为对照组.比较两组患者间组织中OPN表达水平差异.结果 OPN在腺肌病在位内膜分泌期中的高表达,较在位内膜增生期,差异有统计学意义(P<0.05).OPN在腺肌病在位内膜增生期与分泌期的表达均分别高于在正常内膜增生期与分泌期的表达,两组比较,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 子宫腺肌病病灶及在位内膜中OPN的表达上调,OPN可能参与了子宫腺肌病的发生与发展过程.
关键词： 子宫腺肌病 子宫腺肌病腺上皮细胞 子宫内膜上皮细胞 骨桥蛋白(OPN)
