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免疫荧光组织变性的原因及对策
免疫荧光检查是肾脏疾病免疫病理学中一个重要手段,多采用恒温冷冻切片.作为冰冻切片的标本应为未经任何处理的新鲜组织,才能使其抗原保存满意,达到检查的目的.对我院2001-05～2002-03接收外院免疫荧光组织标本变性22例其变性原因、操作过程及技巧总结如下.
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严重急性呼吸综合征实验室检测
目的为严重急性呼吸综合征(SARS)病例的诊断提供科学依据.方法连续、系统地采集2003年12月至2004年1月广东省新发4例SARS怀疑病例不同发病时间的各类标本,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光测定(IFA)、中和试验等血清学检测技术和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、荧光定量聚合酶链反应等分子生物学技术检测采集的标本,并对检测结果进行分析.结果血清学检测结果显示,4例病例在发病后6～8d,均可检测到SARS-CoV IgM和IgG抗体;前3例病例SARS-CoV抗体有4倍或4倍以上增长,第4例病例SARS-CoV IgG抗体虽无4倍增长,但却有明显的抗体阳转过程.采用ELISA、IFA和中和试验的检测结果基本一致.用荧光定量PCR检测咽拭等标本的SARS-CoV核酸,结果只有病例1的3份咽拭标本阳性,其他标本均阴性.对阳性标本,采用RT-PCR扩增出SARS-CoV的M、N、S基因并测序,S基因序列和种系发生分析提示,该病毒与从广东省果子狸中分离到的SARS毒株接近.未能从这4例SARS病例的任何标本中分离到病毒.结论检测结果证明,该4例病例报告可以确认为SARS实验室确诊病例.
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合肥地区急性呼吸系统感染病原体的流行病学调查
目的 了解合肥地区急性呼吸道感染(ARI)病原体分布情况和影响其病原体分布的因素.方法 入选2006年5月-2007年4月急性呼吸道感染患者530例,咽拭子法取鼻咽部分泌物和咳出的深部痰标本,采用直接免疫荧光法检测急性呼吸道感染常见病毒抗原,应用荧光定量PCR法检测肺炎支原体、肺炎农原体核酸.结果 530例急性呼吸道感染患者病原体阳性例数421例,检出阳性率为79.43%;腺病毒抗原阳性例数多为73例,占受检人群13.77%,其后依次为流感病毒A 68例(12.83%),流感病毒B 56例(10.56%),呼吸道合胞病毒48例(9.05%),副流感病毒1 47例(8.86%),副流感病毒3 42例(7.92%),副流感病毒2 33例(6.22%),肺炎支原体32例(6.03%),肺炎衣原体22例(4.15%);冬季病原体检出阳性率高(85.07%).结论 合肥地区急性呼吸道感染以急性上呼吸道感染多见,约75%是由病毒引起,其中以腺病毒感染为多见,一年中又以冬、春季节多发,非典型病原体感染不容忽视.
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自身抗体对副肿瘤综合征诊断价值的探讨
目的探讨自身抗体对副肿瘤综合征的诊断价值.方法利用间接免疫荧光法对48例疑诊副肿瘤综合征患者进行抗Yo抗体、抗Hu抗体、抗Ri抗体测定和临床随访,并与正常人和神经系统其他疾病患者对照.结果 48例中,1例病前有肺癌史,2例检查中发现肿瘤,4例随访3～18个月后发现肿瘤.正常对照组和神经系统其他疾病组自身抗体均为阴性,患者组中有1例呈副肿瘤性脑脊髓炎,其抗Hu抗体阳性,相对分子质量为38 000,病理检查证实为小细胞肺癌.结论自身抗体测定对此病的早期诊断有一定价值,但阳性率不高,其临床价值尚需进一步随访证实.
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阿尔茨海默病患者海马雌激素受体α和β共表达减少
目的探测雌激素受体在阿尔茨海默病(AD)患者海马中的变化.方法运用免疫荧光细胞化学双标和激光共聚焦扫描显微镜,对10例AD患者和10例对照组海马进行观察,并进行统计分析.结果在老年对照组和AD患者组中,雌激素受体α(ERα)和雌激素受体β(ERβ)均主要在锥体层神经元中表达,而放射层和始层中稀少;且多分布于胞质,胞核较少.ERα和ERβ免疫荧光双标细胞可分为三种类型:(1)胞质双标细胞;(2)胞核双标细胞;(3)ERα核染色而ERβ质染色细胞.海马CA1区胞核双标神经元与ERα阳性神经元的比率或与ERβ阳性神经元的比率, AD组分别为2.6%±0.5%和1.7%±0.3%,均低于对照组(分别为5.0%±0.7%和3.9%±0.6%),均(P<0.001).结论雌激素受体α和β核双标细胞的减少可能在AD发病机制中起重要作用.
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抗髓鞘相关糖蛋白抗体的检测及相关周围神经病研究
目的 研究抗髓鞘相关糖蛋白(myelin-associated glycoprotein,MAG)抗体相关周围神经病的临床及电生理特点、抗体检测方法以及治疗和预后,以提高对该病的认识.方法 总结2014年4月至2018年2月北京协和医院和山东大学齐鲁医院共6例抗MAG抗体阳性的IgM型单克隆丙种球蛋白血症相关周围神经病患者病例资料,对其临床特点、电生理特征、辅助检查结果包括抗MAG抗体检测结果进行分析,并随访其治疗和预后.结果 6例患者中,男性5例,女性1例,发病年龄50~77岁,病程3个月~6年.6例均以肢体远端麻木起病,渐发展至肢体近端受累,其中3例出现运动受累(肢体肌力Ⅲ~Ⅳ级).5例出现行走不稳,双足踩棉感,1例伴下肢远端过电样疼痛.5例出现四肢腱反射减低,6例均有长手套、袜套样深浅感觉减退.5例患者行腰椎穿刺,脑脊液蛋白0.75~1.33 g/L.6例患者均发现血清单克隆蛋白,其中4例为IgM κ型,2例为IgG κ和IgM κ双克隆型.原发血液病诊断:4例诊断为意义未明的单克隆免疫球蛋白血症,2例诊断为巨球蛋白血症.6例患者均行肌电图检测,提示四肢多发性周围神经病,脱髓鞘损害,感觉神经损害为主,下肢重;2例针极肌电图可见自发电位,运动单位时限增宽、波幅增高,主动收缩募集减少,提示继发慢性轴索损害.6例均行基于转染细胞和动物周围神经组织的间接免疫荧光检测抗MAG-IgM抗体,结果均阳性.4例在确诊前给予激素以及静脉注射免疫球蛋白治疗,症状仍逐渐进展.确诊后3例行RCD(利妥昔单抗+地塞米松+环磷酰胺)化疗,1例好转[治疗前/后改良Rankin量表(mRS)评分为3/2分,随诊3年],1例平稳(治疗前/后mRS评分为2/2分,随诊2年),1例随诊中;1例给予利妥昔单抗治疗,病情好转(治疗前/后mRS评分为3/1分,随诊1年).结论 抗MAG抗体相关周围神经病临床表现为缓慢进展的远端对称性周围神经病,感觉受累为主,可合并运动受累,电生理符合脱髓鞘性周围神经病;其M蛋白类型多为IgM κ型,间接免疫荧光检测血清抗MAG-IgM抗体阳性对于诊断可提供帮助,RCD化疗可改善周围神经症状.
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半导体量子点-Smad4单克隆抗体荧光探针的制备及免疫特异识别能力的检测
目的 制备半导体量子点(semiconductor quantum dots,SQD)单克隆抗体荧光探针-Smad4(SQD-Smad4),并检测其光学件质和免疫特异性识别能力,为视踪检测活细胞内蛋门质等生物分子提供实验手段.方法 用化学偶联法制备水溶性SQD-Smad4探针,测定其荧光比值、光稳定性、吸收光谱和发射光谱;采用SP免疫组化法和SQD-Smad4直接免疫荧光成像法观察比较Smad4在大鼠牙乳头细胞内的分布.结果 在紫外线持续照射12 h前后605 SQD和605 SQD-Smad4的相对荧光比值分别为250、254和240、242.SQD与Smad4单抗通过共价结合形成稳定的SQD-Smad4,其对大鼠牙乳头细胞内Smad4分子在TGF-β1刺激牙乳头细胞24 h后发生核移位,说明具有特异性的识别能力;SQD-Smad4仍具有SQD所具有的激发光谱宽、发射光谱窄、荧光度强、光化学稳定性好等光学特征.结论 SQD和单抗共价结合形成分子探针后仍具有特异免疫识别能力和独特的光学性质,为SQD原位、长时间视踪检测活细胞内生物分子运动提供了实验基础.
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西藏环状病毒细胞生物学特性研究
目的:了解从西藏血蜱标本中分离的环状病毒(Ti3010)的细胞生物学特性和敏感细胞范围,与国内其他地区环状病毒进行比较,为全面认识西藏地区环状病毒的特点和进一步确切分类提供依据.方法:将病毒平行接种BHK13、Vero、C6/36、HeLa 4种细胞,逐日观察病毒的致细胞病变效应(CPE),特异荧光发生部位和细胞数量,超薄切片电镜观察病毒的形态发生以及进行TCID50滴定.结果与结论:Ti3010环状病毒接种BHK13细胞后第3天产生CPE,32%～35%的细胞有病毒增殖,胞浆内检出特异荧光;电镜观察到胞浆内的病毒颗粒呈聚集状态,多呈晶格状排列,并具有病毒包涵体.TCID50滴定在BHK13细胞为7.1,Vero为5.8,C6/36和HeLa为0.结果显示Ti3010病毒与从鸟、鼠等标本中分离的Ti2066和Ti2076病毒一样,对BHK细胞敏感,产生CPE;Vero细胞次之,对C6/36和HeLa细胞不敏感,在BHK13细胞中上述3株病毒具有相同的复制特点.结合其RNA基因组特点,该病毒同国内其他地区分离的环状病毒有较大差异,该差异显示了西藏地区特殊生态环境下环状病毒的独有性状.
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PTEN调节神经样细胞微管相关蛋白tau的聚集及意义
目的：观察体外诱导成人骨髓基质干细胞（BMSC）向神经细胞分化过程中，在第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物基因（PTEN）调节细胞骨架中轴突标志分子微管相关蛋白tau（MAPT）分布及聚集的特征，并探讨其意义。方法从成人骨髓中分离基质干细胞，在体外经细胞因子诱导分化2周后成为神经样细胞，将未分化的BMSC作为对照组；应用半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot方法研究MAPT的表达变化；经PTEN抑制剂BPV作用于该细胞后，用结合有荧光剂的鬼笔环肽直接染色细胞微丝肌动蛋白，并联合用免疫荧光细胞化学方法染色MAPT，在激光共聚焦显微镜下观察MAPT和肌动蛋白的定位及关联性。结果成人骨髓来源的基质干细胞经诱导分化后，MAPT的mRNA在分化1周和2周时相对表达水平为0.24±0.04和0.52±0.04，高于对照组BMSC的0.04±0.02（P＜0.05）。MAPT蛋白表达水平分别为0.18±0.03和0.44±0.05，高于对照组0.06±0.04（P＜0.05）。细胞染色后，经BPV作用后MAPT由弥散状态变为聚集状态，并分布于细胞一侧，神经样细胞开始出现极性。结论 BMSC来源的神经细胞分化成熟时，PTEN参与调节细胞骨架中轴突标志分子MAPT的转运和聚集，为神经细胞的轴突进一步生长提供物质支持。
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免疫荧光技术中不同固定剂对细胞p65核移位观察效果的影响
目的 观察免疫荧光技术中不同固定剂以及Triton X-100不同渗透时间对小鼠腹腔巨噬细胞p65蛋白核移位的影响,找出适合观察p65蛋白移位的固定方法及Triton X-100渗透时间.方法 采用免疫荧光的方法观察使用不同固定剂(甲醇,1％～4％甲醛)固定,0.1％ Triton X-100渗透3～15 min的条件下,观察脂多糖刺激2h后,p65蛋白细胞内定位的情况.结果 p65蛋白在对照细胞主要定位于细胞质,脂多糖(LPS)刺激后p65蛋白移入胞核.甲醇固定后细胞荧光染色显色很弱且核区不明显,染色弥散；1％、2％甲醛固定不良可引起细胞收缩；4％甲醛固定后,核区与胞质p65蛋白荧光染色对比明显.0.1％Triton X-100作用3～5 min效果佳,而作用10～15 min对照细胞核内也有较强荧光.结论 本实验表明,在免疫荧光技术中采用4％甲醛固定20 min,0.1％Triton X-100渗透3～5 min可更好的观察LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞p65核移位.
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一例合并肾病综合征的胎盘部位滋养细胞肿瘤患者的围手术期护理
胎盘部位滋养细胞肿瘤（placental site trophoblastic tumor, PSTT）是指起源于胎盘种植部位的一种特殊类型的妊娠滋养细胞肿瘤。临床罕见，占妊娠滋养细胞肿瘤的1%～2%。多数不发生转移，预后良好[1]。通常情况下，PSTT 分泌低水平的人绒毛膜促性腺激素，肿瘤生长缓慢，发病数月或数年后发生转移，对联合化疗不敏感。因此，手术是其主要治疗方法[2]。原发性肾病综合征（primary nephrotic syndrome，PNS）是指由多种原因导致肾小球疾病引起，临床症状以出现大量蛋白尿、低血浆蛋白、高脂血症和身体水肿为特征的综合性疾病[3]。 PSTT 伴发肾病综合征可能是因为肿瘤释放的促凝物质激活凝血系统导致弥散性血管内凝血形成，使纤维蛋白裂解产物增多，形成免疫复合物沉积在肾小球，而引起滤过膜破坏[4]。张杰和许俊龙[5]报道1例 PSTT 合并肾病综合征，行肾穿刺活组织病理检查提示肾小球毛细血管襻内大量纤维蛋白样物沉积，免疫荧光测定 IgM 阳性，病理诊断肾皮质区肾小球局灶性阶段性硬化，以肾病综合征常规治疗效果不佳，2年后患者因产后停经6个月，不规则阴道流血10 d 再次就诊，刮宫病理诊断为PSTT，遂行子宫全切术后症状缓解。2014年6月5日我院妇科病房收治1例由肾内科转入的 PSTT 患者，本文总结其护理体会，现报道如下。
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激光共聚焦图像系统与免疫荧光双标记对脊髓缺血再灌注损伤中ICAM-1表达定量分析
目的 采用激光共聚焦显微镜与免疫荧光双标记进一步探讨实验脊髓缺血再灌注损伤ICAM-1的表达变化规律.方法 采用Zinin法建立脊髓缺血再灌注损伤模型.以荧光探针Fluo23PAM负载后,通过激光扫描共聚焦显微镜(InsightplusIQ Meridian,USA)检测脊髓微血管内皮细胞表面ICAM-1mRNA荧光强度.结果 在激光扫描共聚焦显微镜下,可以清晰地观察ICAM-1微量表达于脊髓微血管内皮细胞表面,而单纯缺血不引起ICAM-1表达.再灌注后损伤区ICAM-1表达先后发生了改变;再灌注4 h,ICAM-1 mRNA表达量明显升高,再灌注12 h其在单位微血管面积上的荧光强度约比单纯缺血组增加了1/2.提示脊髓损伤后微血管内皮细胞初始ICAM-1表达增加是由再灌注损伤激发,其后延迟递增性规律性表达增强,说明ICAM-1参与了脊髓再灌注损伤的炎症病理过程.结论 应用激光扫描共聚焦图像分析与免疫荧光双重标记技术能对黏附分子进行精确的定位定量研究.ICAM-1可做为评判脊髓损伤程度和脊髓I/R后炎症反应程度的监测指标.
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丙型肝炎和自身免疫性肝炎自身抗体的特点分析
目的 分析自身抗体在丙型病毒性肝炎和自身免疫性肝炎中的特点方法应用间接免疫荧光法(IIF),检测233例丙型肝炎(HCV)患者和45例自身免疫性肝炎(AIH)患者血清中相关的自身抗体.结果 233例HCV患者自身抗体检测阳性率分别为抗核抗体(ANA)44.6%(104/233)、抗平滑肌抗体(SMA)18.0%(42/233)、抗线粒体抗体(AMA)14.2%(33/233)、抗肝肾微粒体抗体(抗LKM-1)1.7%(4/233)、抗肝特异性蛋白抗体(LSP)10.7%(25/233)、抗细胞骨架抗体(CS)7.7%(18/233)、抗胃壁细胞抗体(APCA)6.0%(14/233)、抗心肌抗体(AHRA)6.9%(16/233).HCV组和AIH组ANA和SMA检测结果比较,HCV组ANA、SMA抗体 1:100滴度阳性率分别为69.2%、27.9%,ANA及SMA抗体以低滴度为主,AIH组ANA及SMA抗体则以高滴度为主(62.2%、28.9%).ANA抗体高滴度(1∶1000)的HCV患者ALT、AST、Tbil、GGT、IgM的水平明显高于低滴度(1∶100)患者(P＜0.05),而IgA和IgG两组间比较差异无统计学意义.AIH组抗LKM-1检测阳性率高于HCV组.结论 丙型肝炎患者血清中存在多种自身抗体但滴度较低,自身免疫性肝炎患者自身抗体滴度较高,HCV引起的自身免疫紊乱是造成机体免疫损伤、加重丙肝病毒血症的一个极其重要因素.
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水浸束缚应激大鼠胃壁细胞形态和泌酸功能的研究
背景:应激性溃疡(SU)是临床危重疾病的常见并发症,通常认为胃黏膜缺血是SU的主要发病机制,而胃酸则在此基础上起重要作用,但胃酸在SU发病中的确切作用尚未完全阐明.目的:研究水浸束缚应激(WRS)大鼠胃壁细胞形态和泌酸功能的变化,以进一步阐明胃酸在SU发病中的作用.方法:将15只Sprague-Dawley大鼠随机分为WRS2 h组、WRS 4 h组和正常对照组,予相应处理后测定胃液pH值,处死大鼠,评估胃黏膜溃疡指数(UI),以免疫荧光技术标记H+/K+-ATP酶后用激光共聚焦扫描显微镜观察壁细胞形态并进行分类和计数.分析胃液pH值与胃黏膜UI和分泌期壁细胞数之间的关系.结果:WRS 2 h组和WRS 4 h组的胃液pH值均较正常对照组显著降低(P＜0.01),两组WRS组之间则无显著差异.WRS 2 h组和WRS 4 h组的胃黏膜UI和分泌期壁细胞(网格样细胞)数均显著高于正常对照组(P＜0.01),其中WRS 4 h组显著高于WRS 2 h组(P＜0.01).正常对照组的胃液pH值与分泌期壁细胞数呈负相关(r＝-0.81,P＜0.05),WRS组的胃液pH值与胃黏膜UI和分泌期壁细胞数均呈负相关(r=-0.85,P＜0.05;r=-0.89,P＜0.05).结论:WRS大鼠的胃酸分泌与胃黏膜UI和分泌期壁细胞数呈正相关,从细胞学水平证明胃酸增高在SU的形成中起重要作用.
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骨髓基质干细胞趋瘤性及神经分化潜能
目的:观察骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)向脑胶质瘤的趋向性及在荷瘤大鼠脑内的分化,初步探讨其机制.方法:培养BMSCs后,在体外应用显微镜直接观察及Transwell试验检测BMSCs向胶质瘤细胞及血管内皮细胞生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、血小板源性生长因子(PDGF)等的迁移特性,免疫荧光方法检测其在颅内向脑胶质瘤迁移的情况.在体外诱导条件下,观察BMSCs的分化;BMSCs移植到脑荷瘤大鼠脑内15 d后,免疫荧光方法检测其在体内的分化.结果:骨髓基质干细胞在体外表现出明显的向胶质瘤细胞及PDGF、EGF的迁移特性,在体内表现了明显的向脑内胶质瘤迁移的特性,并可迁移到肿瘤卫星灶周围.在体外诱导条件下BMSCs可分化为神经前体细胞(8.4%±3.5%)、神经元(53.7%±7.4%)及胶质细胞(22.3%±5.2%);在移植到荷瘤鼠脑内后,也可分化为神经前体细胞(8.3%±3.6%)、神经元(15.7%±4.3%)及胶质细胞(32.5%±7.2%),两者向神经元分化的比例存在差异(P＜0.05),向神经前体细胞及胶质细胞的分化比例相似(P＞0.05).结论:骨髓基质干细胞有明显的胶质瘤趋瘤性,其向神经细胞分化的方向可能与其局部微环境有关.
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乙型肝炎病毒感染者血清肝特异性自身抗体的检测及临床意义
目的探讨慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者血清肝特异性自身抗体的检出率及临床意义。方法采用间接免疫荧光法检测186例慢性HBV感染者血清肝特异性自身抗体，回顾性分析AST、ALT、ALP和GGT等生化指标与自身抗体检出率的相关性。结果在186例慢性HBV感染者中检出自身抗体阳性66例（35.5%）；在60例HBV携带者、74例慢性肝炎和52例肝硬化患者肝特异性抗核抗体（ANA）检出率分别为25.0%、24.3%和21.2%，明显高于30例健康对照人群（6.6%，P＜0.05）；自身抗体阳性者以低滴度为主，主要以抗核抗体（ANA）和类风湿因子（RF）阳性为主，免疫荧光模式以“均质型”和“颗粒型”为主；66例自身抗体阳性的HBV感染者血清ALT、AST、ALP和GGT分别为268.4±213.6u/L、241.5±21.3.0u/L、287.2±175.0u/L和168.9±54.7u/L，均显著高于120例自身抗体阴性者（分别为130.8±29.0u/L、118.2±27.3u/L、142.0±63.5u/L和36.5±17.2 u/L，P<0.01）。结论慢性HBV感染可诱导自身免疫反应而有可能产生多种自身抗体，后者的检出率与肝功能指标显著相关，可能是感染HBV后肝组织损伤的重要因素。
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两种不同培养基对体外培养脊髓神经元的影响
目的 建立体外稳定获取大数量及高纯度脊髓神经元的培养方案,比较当前国内外常用的无血清培养基(Neurobasal+B27,NCM)与传统含血清培养基(DMEN/F12+10%胎牛血清+5%马血清,SCM)对体外培养脊髓神经元生长状态的影响.方法 取E14-15 d Wistar大鼠的胚胎脊髓组织行胰酶消化获取脊髓神经元的单细胞悬液,分别用NCM与SCM进行培养,差速贴壁法及Ara-C干预纯化培养的神经元.于接种后第1、2、3、4、5、6、7 d倒置相差显微镜下观察细胞生长状态的变化,并用免疫荧光细胞化学法比较两种培养基培养下获取的神经元纯度.结果 采用NCM培养的脊髓神经元生长良好,对环境变化如换液及加入Ara-C更为耐受;NCM培养的神经元的纯度为(87.70±8.70)%,SCM培养的神经元纯度为(78.61±7.00)%,前者纯度更高(P=0.019).结论 NCM较之SCM更加适合脊髓神经元的体外培养.
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脊髓组织存放时间对冰冻组织切片免疫荧光的影响
目的:研究脊髓组织在4％多聚甲醛固定液中的存放时间对冰冻切片抗原NeuN表达的影响.方法:固定于4％多聚甲醛中1年、3月、2月、1月、2周、1周及24 h的脊髓组织,在相同的条件下制作冰冻切片,通过对神经元核抗原(NeuN)的免疫荧光的检测,观察脊髓组织标本在4％多聚甲醛中的固定时间对NeuN表达的影响.结果:在脊髓前角NeuN的表达中,组织固定1月、2月、3月及1年的NeuN阳性率与新鲜标本及组织固定1周、2周比较呈现显著性下降(P＜0.05);在脊髓后角NeuN的表达中,组织固定2月、3月及1年的NeuN阳性率与新鲜标本相比呈现显著性下降(P＜0.05),同时组织固定1年的NeuN阳性率与组织固定1周相比也呈现显著性下降(P＜0.05);在脊髓中央管NeuN的表达中,组织固定3月、1年的NeuN阳性率与新鲜标本及组织固定1周相比呈现显著性降低(P＜0.05),在脊髓组织整体NeuN的表达中,组织固定3月及1年的NeuN阳性率与新鲜标本及组织固定1周、2周比较呈现显著性下降(JP＜0.05),同时组织固定2月与新鲜组织及组织固定1周比较呈现显著性下降(P＜0.05).结论:在同样的环境和条件下,冰冻切片的组织标本越新鲜,其抗原的表达越强.
