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流体切应力对中性粒细胞内Ca2+的影响
流体切应力是中性粒细胞的重要功能环境,但以往的研究很少涉及力学作用对中性粒细胞的影响.我们利用旋转粘度仪提供的流体切应力作用于分离的中性粒细胞,采用Fura-2/AM与细胞内游离Ca2+结合,检测其荧光强度,研究不同力学条件下细胞内游离Ca2+浓度的变化情况;另外,分别以f-MLP和TNF两种刺激因子作用中性粒细胞,使之激活,与此同时考察流体力学作用对中性粒细胞激活程度的影响.结果显示:定常剪切流,切变率由低变高时,中性粒细胞内的游离Ca2+水平先是显著下降,切变率达到一定程度后,[Ca2+]i逐渐回升,并且会超过静止时的水平;两种刺激因子在静态下激活中性粒细胞均可使游离Ca2+大幅度上升,同时给予定常流作用,在较低切变率作用下,这一上升被明显抑制,当切变率升高到一定程度后,[Ca2+]i回复到静态激活水平甚至更高.正弦振荡剪切作用于中性粒细胞,[Ca2+]i随大切变率增大而升高,当激活剂和剪切流同时作用时,[Ca2+]i随大切变率升高而下降,逐渐接近大切变率相同时的单纯振荡切应力作用的水平.由此我们认为:体内不同血流环境将影响中性粒细胞的[Ca2+]i,在不同循环部位的血管血流中,流体切应力对中性粒细胞的[Ca2+]i有着不同的调节作用.
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流体切应力下SIVA-1凋亡诱导因子促成骨细胞增殖分化的双向调节作用
目的 探讨流体切应力(fluid shear stress,FSS)对KM小鼠成骨细胞增殖分化及相关细胞凋亡诱导因子(SIVA-1)的调节作用. 方法 将传至3代成骨细胞分为应力刺激组(试验组)和非应力刺激组(对照组).5个试验组分别给予1.2 Pa FSS作用0.25,0.5,1,2,4 h;对照组为0 h.MTT法测定细胞增殖,检测碱性磷酸酶(ALP)活性,半定量RT-PCR测定凋亡诱导因子SIVA-1的表达水平. 结果 FSS促增殖作用在短期(0.25,0.5 h)明显,且细胞生长曲线前移;但在1,2,4 h却有明显抑制增殖作用.FSS同样增加了ALP活性,尤其在应力作用0.5 h时显著(ALP含量为2.4320±0.205金氏单位/100 ml,相对对照达158%)(P＜0.05);而应力作用1,2,4 h后减低了ALP的表达.应力初期SIVA-1 mRNA表达量明显下降,尤其在FSS作用0.5 h后SIVA-1/GAPDH相对表达量为0.099±0.002,相对对照明显下调了71.3%(P＜0.01),此效应在作用1 h后减退,SIVA-1 mRNA表达开始升高,4 h后升高明显. 结论 1.2 Pa FSS在短时间刺激下可刺激成骨细胞增殖分化,尤其在0.5 h后效应明显.早期促细胞增殖和ALP水平升高主要与SIVA-1 mRNA表达下调有关,而后期抑制作用可能与SIVA-1 mRNA表达升高有关.
关键词： 流体切应力 成骨细胞 增殖分化 SIVA-1凋亡诱导因子 -
急性胰腺炎胰腺血液流变学改变与细胞粘附分子的表达
目的探索急性胰腺炎(AP)实验动物模型的早期胰腺局部血液流变学改变、流体切应力作用下中性粒细胞表面粘附分子表达在AP发展中的作用. 方法将21只Wistar大鼠随机分为3组,用蛙皮缩胆囊肽(caeralein)诱发AP动物模型,用Low-shear 30血流流变仪检测全血表观粘度,用流式细胞仪分析切应力介导的中性粒细胞表面粘附分子的表达. 结果 (1)各实验组血清淀粉酶升高,与正常组相比,差异有显著性(t=69.029,t=79.734,P＜0.05).(2)不同切变率下各实验组的全血表观粘度均增高,尤以低切变率下增高更为显著(0.512 s-1: t=10.725,t=16.945; 5.96 s-1: t=12.781,t=11.992,P<0.05).(3)在切变率作用下各组CD18的表达随着切变率的升高而增加,且在切变率为94.5 s-1和128.5 s-1时,有显著性差异(94.5 s-1: t=7.403,t=13.323,t=16.655;128.5 s-1: t=10.092,t=28.531,t=24.563,P＜0.05).(4)低切变率作用对不同组别CD 62L的表达无显著影响,当切变率升高≥94.5 s-1 时,各组CD 62L的表达开始下调, 差异有显著性(94.5 s-1: t=10.687, t=19.376,t=12.848;128.5 s-1: t=26.152,t=48.402,t=56.814,P＜0.05). 结论 AP早期胰腺微循环全血表观粘度增高、中性粒细胞表面粘附分子CD18在低切变率下表达增加,CD 62L在切变率≥90 s-1的条件介入,与CD18和共同介导了白细胞的粘附和游出;这对阐明AP胰腺微循环障碍的发生机理及AP的防治有重要意义.
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流体切应力对骨髓来源破骨细胞空泡面积影响的相差显微镜观察
牙槽骨在咬合力和正畸力作用下进行着改建,尤其在牙列缺损或缺失后,牙槽骨内骨吸收速度超过骨沉积速度.研究应力对体外培养的骨组织来源细胞的作用,有助于深入了解牙槽骨改建的机制.我们应用平行平板流体切应力系统,对破骨细胞施以不同时间和强度的流体切应力,用相差显微镜观察破骨细胞内空泡面积的变化.
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流体切应力促进组织工程骨成骨和血管化的研究进展
流体切应力在组织工程学中得到越来越多的重视.通过模拟流体切应力作用于骨组织后对感应细胞(成骨细胞和血管内皮细胞)产生刺激,达到骨量增多和快速血管化的目的 .通过阐述流体切应力对成骨细胞和血管内皮细胞的作用机制,为促进组织工程骨的成骨和血管化提供思路和依据.
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Akt调节切应力诱导骨髓间充质干细胞Bmi-1基因的表达
目的 探讨流体切应力对骨髓间充质干细胞(bone marrow nmesenchymal stem cells,BMSCs)中Bmi-1基因表达的影响及可能的信号机制.方法 原代体外分离培养大鼠BMSCs,应用平行平板流动腔系统,给BMSCs施加不同强度(0.5、1.5、3.0 Pa)和不同加载时间(1、2、6、24 h)的层流切应力,用实时定量RT-PCR法检测Bmi-1基因的表达水平,用免疫印迹法检测磷酸化Akt和ERK1/2的表达水平,利用Wortmannin(PI3K特异性抑制剂)、PD98059(ERK1/2 MAPK特异性抑制剂)信号阻断剂探讨信号转导途径.结果 BMSCs在1.5 Pa切应力作用1h后Bmi-1基因表达即明显增强,24 h达高峰.不同强度切应力都会刺激Bmi-1基因表达,其中3.0 Pa强.切应力能显著激活磷酸化Akt和ERK1/2表达.Wortmannin而不是PD98059可以明显抑制Bmi-1基因的表达.结论 切应力可诱导BMSCs中Bmi-1基因表达,其表达量与刺激时间和切应力的强度密切相关,这种作用可能通过Akt信号调节.
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高血压与低切应力对大鼠颈总动脉血管重建的影响
目的:研究高血压与低切应力对血管重建的影响及其机制,这对于阐明血管疾病的发病机理以及提供诊断、治疗的一些基本原理都将有重要的理论和实际意义.方法:通过腹主动脉缩窄,结扎左颈总动脉的部分分支建立高血压、左颈总动脉低切应力以及高血压伴有低切应力大鼠动物模型.几何形态学方法观测左颈总动脉的壁厚及壁厚/内径比的变化;金属蛋白酶谱法分析MMP-2活性;免疫印迹法检测信号通路分子p-Akt分子以及Rho GDIa的表达变化.结果:高血压和低切应力均可诱导颈总动脉MMP-2活性和壁厚及壁厚/内径比显著增加;当高血压伴有低切应力时,两者的协同作用诱导颈总动脉MMP-2活性和壁厚及壁厚/内径比进一步增加,从而促进血管重建.低切应力可诱导颈总动脉p-Akt的表达水平,且与低切应力大小相关,切应力低,p-Akt的表达水平高.当高血压伴有低切应力时,两者的协同作用诱导p-Akt的表达水平进一步增加.高血压和低切应力可诱导颈总动脉RhoGDIα表达增加;当高血压伴有低切应力时,两者的协同作用诱导颈总动脉Rho GDIα表达进一步增加.结论:高血压与切应力协同作用对血管重建的影响为显著,Akt和Rho GDIα信号通路参与了高血压与低切应力诱导的血管重建过程.
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切应力作用下与血管平滑肌细胞联合培养的内皮细胞的形态学改变
内皮细胞与平滑肌细胞是血管壁的主要组成细胞.血管平滑肌细胞与流体切应力是影响血管内皮细胞形态和功能的重要因素.形态学作为内皮细胞研究中直观的指标,一直受到重视.单独培养的内皮细胞丧失了在体条件下的长梭形、沿流体方向平行排列的特征,呈现"铺路石"样外观.与平滑肌细胞联合培养的内皮细胞呈长梭形,与在体条件下的内皮细胞形态较为接近;但排列无极性,这可能是因为内皮细胞缺少了与其腔面直接作用的流体应力的缘故.
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动脉壁切应力和周向应力的协同作用
前言在体动脉的内皮细胞暴露于血流中,同时承受着血流产生的壁切应力(WSS)和血压导致的周向应力(CS)的作用.在体或离体的研究表明,血流切应力和周向应力与内皮细胞的结构和功能密切相关.但绝大部分研究都是研究血流切应力或周向应力对内皮细胞的单独作用.由于在体动脉中血流和血压不是孤立存在的,它们之间存在着联系,因之产生的血流切应力和血管周向应力不是孤立地对内皮细胞起作用,而是联合地起作用.已有的在体实验结果表明,低流体切应力和高周向应力的联合作用与动脉粥样硬化紧密相关.
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流体切应力对中性粒细胞内Ca2+的影响
中性粒细胞在循环血液中随血液绕行全身,担负着机体的防御功能.细胞在不断变化的血流切应力下感受机体的各种生理、病理变化,并作出相应的反应,因此,流体切应力环境是中性粒细胞的重要功能环境,但以往的研究很少涉及力学作用对中性粒细胞的影响.
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流体切应力对内皮细胞功能的调节
1.流体切应力对内皮细胞形态的影响:人脐静脉内皮细胞(HUVECs)被流体切应力38、75dyne/cm2作用12小时后,内皮细胞被拉长,长轴与流场方向一致,内皮细胞的拉长、定向程度和切应力大小、作用时间的长短有关.细胞内F-actin的排列方向也与切应力方向一致.
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脐静脉血流动力学模拟及装置设计
目的脐静脉内的血流动力学环境对胎儿的生长发育起至关重要的作用，体外研究脐静脉的生物功能需要可以同时模拟脐静脉内流体切应力和静脉压力的实验装置。方法利用双层平行平板模型进行结构优化，模拟脐静脉流体切应力；利用密闭储液罐模拟静脉压力。结果通过力学模拟效果计算发现，该装置可以有效模拟脐静脉内的流体切应力及静脉压力。结论该实验装置达到了初步模拟脐静脉内血流动力性环境的目的，可用于体外研究脐静脉内皮细胞的生物力学特性变化。
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流体切应力对内皮细胞的作用
与血流有关的机械作用力在对血管健康状况的准确控制、动脉结构的调节和重建、动脉粥样硬化发生的部位等方面都起到很重要的作用.而这些作用主要都是通过血液流动过程中产生的切应力对内皮的作用而发生的.通过内皮对血液动力的转导和传递导致内皮细胞对流体切应力(Fluid Shear Stress:FSS)发生生物物理的、生化的和基因调控水平的反应.
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流体切应力促成骨细胞通过细胞周期G1/S调控点机制的研究
[目的] 探讨流体切应力(FSS)促成骨细胞增殖、分化作用与细胞周期从G1期向S期转化机制的关系,为确立佳生理应力刺激骨再生提供依据.[方法] 从KM乳鼠颅盖骨提取原代成骨细胞,在体外流体小室内分别受FSS(12 dyn/cm2)作用0、0.25、0.5、1、2、4 h,通过MTT法分析细胞增殖能力,并利用碱性磷酸酶(ALP)的表达评价其分化能力;通过流式细胞仪、免疫荧光染色和RT-PCR测定细胞周期G1/S百分比、细胞周期依赖激酶2和4(CDK2、CDK4)的活性改变及E2F1、p27mRNA的表达实现FSS促成骨细胞由G1期转向S期的测定.[结果] FSS促增殖作用在短期(0.25 h、0.5 h)明显,并且细胞生长曲线前移;但在1、2、4 h却有明显抑制增殖作用.FSS同样增加了ALP的活性,尤其在应力作用0.25、0.5 h时显著(比对照达128%和158%);而应力作用1、2、4 h后减低了ALP的表达.在FSS作用1 h内细胞周期S期百分比增高,作用0.5 h后与对照组比较明显增高(P<0.05);但随着时间的增加细胞周期S期百分比开始下降,当作用时间持续4 h后S期百分比下降明显(P<0.05).流体切应力增加了活化pRb的CDK2、CDK4的活性,而且与CDK2相关的E2F1表达量也明显增加;而细胞周期依赖激酶抑制剂p27在流体切应力作用下有所下降.其中流体切应力在0.25 h、0.5 h明显增加了E2Fl mRNA的表达水平(P<0.05),此效应在作用1 h后减退.[结论] 适宜的流体切应力通过上调CDK2、CDK4及E2F1,下调p27,使细胞从G1期转化到S期,在流体切应力促成骨细胞增殖、分化机制中起重要作用;并且这种作用有明显的FSS作用时间限制性.
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流体切应力和Ox-LDL对内皮细胞表面ICAM-1表达的影响
目的：研究动脉粥样硬化(AS)的危险因素高脂血症、流体切应力及二者共同作用对血管内皮细胞细胞间粘附分子-1( ICAM-1 )表达的影响。方法：以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)为研究对象，应用免疫组化ACB方法，观测Ox-LDL、流体切应力及二者共同作用对HUVECs的粘附分子ICAM-1表达的影响。结果：与对照组相比，(1)Ox-LDL显著增加HUVECs表面ICAM- 1表达；(2)流体切应力使HUVECs表面ICAM-1表达增加，但ICAM- 1的表达随时间依赖性增加的趋势不明显；(3)共同作用后, HUVECs ICAM-1的表达较基础表达显著增加。结论：Ox-LDL、流体切应力的改变及二者共同作用显著增加H-UVECs表面ICAM-1表达。
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流体切应力促永生化大鼠BRL-3A肝细胞增殖的研究
目的 观察不同大小流体切应力对永生化大鼠BRL-3A肝细胞株增殖动力学的影响.方法 构建流体切应力加载细胞培养装置,以永生化大鼠BRL-3A肝细胞株为研究对象,实验分为未添加肝细胞生长因子(HGF)的A组和添加HGF的B组,各组加载0、12、24 dyn/cm2大小的流体切应力,采用直接细胞计数和分光光度计测定细胞计数试剂盒(CCK-8)的方法检测12、24、48、168 h细胞增殖动力学的变化.结果 未加载流体切应力时,B组细胞增殖优于A组;加载流体切应力越大,A组和B组细胞均增殖更明显;在同一时间点加载同样大小切应力时,B组细胞增殖由于A组(P＜0.05).加载大小为24 dyn/cm2的切应力培养细胞24h,A和B组的细胞计数和CCK-8分光光度计吸光度(A)值均达到高值,细胞计数分别为A组(10.73±2.54)×106个和B组(15.93±2.00)×106个(P＜0.05),CCK-8分光光度计A值分别为A组(2.04±0.51)和B组(3.09±0.40,P＜0.05);24～72 h逐渐下降,但仍高于未加载应力组(P＜0.05),168 h则接近或略高于未加载应力组.结论 流体切应力对永生化大鼠BRL-3A肝细胞株增殖有促进作用,而且,理化因素(流体切应力联合HGF)共同作用下肝细胞增殖更明显.
关键词： 肝再生 永生化大鼠BRL-3A肝细胞株 流体切应力 肝细胞生长因子 -
急性胰腺炎局部微循环中性粒细胞内[Ca2+]i变化与细胞粘附分子表达的调控及其意义
目的探讨急性胰腺炎(AP)早期大鼠胰腺局部微循环中性粒细胞在流体切应力作用下细胞内[Ca2+]i变化与表面粘附分子CD18和CD62L表达的调控及其意义.方法将Wistar大鼠随机分为3组(n=7):正常组、实验Ⅰ组(AP-2 h组)和实验Ⅱ组(AP-4 h组);用蛙皮缩胆囊肽(caerulein)诱发大鼠AP动物模型.用流式细胞仪分析切应力作用下胰腺局部微循环中性粒细胞 [Ca2+]i的变化、CD18和CD62L的表达.结果低切变率作用下各组 [Ca2+]i呈现轻微下调,以后随着切变率的升高逐渐上调(182.9±28.2,229.3±16.7,262.6±10.5,P<0.05).CD18和CD62L的表达与[Ca2+]i变化呈显著线性相关(r=0.947,r=-0.939,P<0.05).结论 AP早期胰腺微循环紊乱与中性粒细胞激活密切相关的细胞内[Ca2+]i的增加,在白细胞与内皮粘附过程中起重要作用.
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流体切应力作用于间充质干细胞对其内皮分化后细胞间黏附因子1表达的影响
目的 探讨流体切应力作用于成体骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)后,其定向内皮诱导所得细胞的细胞间黏附因子1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)的表达变化.方法 体外培养大鼠骨髓MSCs,于流室系统中加载不同强度的流体切应力后,将其向内皮细胞系诱导,以荧光实时定量RT-PCR检测所得细胞ICAM-1的mRNA表达水平,以流式细胞仪检测ICAM-1蛋白表达水平,并进一步观察细胞传代后ICAM-1 mRNA及蛋白表达水平变化.结果 大鼠MSCs经过流动加载后,定向内皮诱导所得细胞的ICAM-1 mRNA及蛋白表达水平均较静态对照组有所升高(P<0.05),但当细胞传代后,ICAM-1蛋白水平回落至对照组水平(P>0.05),而mRNA表达水平继续升高.结论 流体切应力能增加MSCs来源的内皮细胞黏附因子的表达,证实了血流动力学因素在动脉粥样硬化发病机制中所起的重要作用.
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切应力诱导内皮细胞表达IL-8基因的信号转导
目的:现已确定动脉粥样硬化是一种炎症疾病,单核/巨噬细胞在动脉内膜下集聚是导致动脉粥样硬化损伤发展的基础;血流低切应力促进其损伤的发展.趋化细胞因子MCP-1对单核/巨噬细胞起强力趋化和激活作用,并有报告切应力可诱导其基因的表达.新近报道在层流作用下IL-8亦是单核/巨噬细胞与内皮细胞相互作用的重要调节因子.本研究旨在观察切应力诱导人脐静脉血管内皮细胞IL-8 mRNA的表达,探讨Toll/NF-κB信号转导通路对其基因激活的介导作用.方法:4.2 dyn/cm2层流切应力处理人脐静脉血管内皮细胞,提取总RNA,应用RT-PCR和Northern杂交技术检测切应力作用不同时间后IL-8、TLR-2和TLR-4 mRNA的表达.免疫印迹技术检测IκB磷酸化和降解.免疫荧光细胞化学染色检测NF-κB胞核易位.结果:切应力作用0.5 h后IL-8 mRNA表达逐渐增高,2 h时达到很高水平.胞浆蛋白IκB和磷酸化IκB的免疫印迹显示4.2 dyn/cm2层流切应力作用10 min后磷酸化IκB水平即显著增加,30 min后又逐渐下降,与之相应IκB含量随切应力作用时间而逐渐下降,到1 h时几乎测不出,表明在切应力作用下内皮细胞胞浆NF-κB抑制因子IκB发生了磷酸化和降解.NF-κBp65亚基免疫细胞化学染色显示在4.2 dyn/cm2切应力作用0.5 h后内皮细胞核逐渐着色,1.5 h时细胞核几乎全着色,表明胞浆NF-κB在切应力作用下发生了易位,从胞浆进入胞核.RT-PCR检测和Northern杂交分析显示内皮细胞固有表达TLR-2和TLR-4 mRNA,在4.2 dyn/cm2切应力作用1 h后TLR-4 mRNA的表达显著增强,而TLR-2 mRNA的表达变化不明显.结论:流体切应力可诱导血管内皮细胞表达IL-8,活化转录因子NF-κB.在切应力作用下内皮细胞TLR-4 mRNA表达增强,提示Toll/NF-κB信号转导通路可能参与动脉粥样硬化性炎症反应.
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ERK1/2信号转导途径在低切应力上调人脐静脉内皮细胞IL-8基因表达中的作用
血管内皮细胞位于血流和血管壁之间,除受化学因素的调节外还受力学因素的影响.切应力可通过刺激相应的力学感受系统来调节内皮细胞某些基因的表达,其中包括诱导内皮细胞表达IL-8.为了阐明MAPK信号途径中的ERK1/2信号通路是否参与调控低切应力上调人脐静脉内皮细胞IL-8基因表达,采用Western blot分析了低切应力(4.20 dyne/cm2)处理不同时间内皮细胞ERK1/2的磷酸化水平及TPK抑制剂Genistein,MEK抑制剂PD98059对其磷酸化的影响;采用定量RT-PCR检测内皮细胞经低切应力刺激或给予阻断剂后再行切应力刺激等处理后IL-8基因的表达.结果显示:(1)低切应力处理可引起内皮细胞ERK1/2蛋白磷酸化水平上调,其磷酸化水平与切应力作用时间有关,具有快速、双向性的特点(在刺激10 min时达到高峰,2 h左右降至未刺激水平),阻断剂Genistein和PD98059处理后,ERK1/2磷酸化水平与低切应力刺激10 min比较明显降低;(2)阻断剂Genistein,PD98059可显著抑制低切应力所致的内皮细胞IL-8 mRNA上调.结果表明低切应力可通过ERK1/2信号途径上调人脐静脉内皮细胞IL-8基因的表达.
