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临海市2010-2011年手足口病病原学监测结果分析
目的 了解浙江省临海市2010-2011年手足口病主要病原体型别及分布特征,为手足口病的防控提供病原学依据.方法 采用实时荧光RT-PCR方法,对哨点医院定期采集的临床诊断病例样本进行肠道病毒(EV)核酸检测和型别鉴定.结果 共采集咽拭子样本157份,检出112例EV阳性病例,阳性率为71.34％;其中EV71阳性病例28例,CoxA16阳性病例33例,分别占EV阳性病例的25.00％、29.46％；5岁以下儿童EV感染占所有感染者的95.54％；2010年和2011年儿童EV71和CoxA16阳性率分别为17.44％、24.42％和18.31％、16.90％,差异无统计学意义(P＞0.05)；男性病例EV阳性检出率高于女性病例(P＜0.05)；重症病例EV71阳性检出率为100％.2010-2011年病原构成呈动态变化特征.结论 引起临海市手足口病的主要病原体为EV71和CoxA16;5岁以下儿童是EV感染的高危人群；EV71是引起重症病例的主要病原体.
关键词： 手足口病 肠道病毒71型 柯萨奇病毒A16型 实时荧光RT-PCR -
Ⅰ型脊髓灰质炎野病毒实时荧光RT-PCR快速检测方法的评价
目的 评价和探讨Ⅰ型脊髓灰质炎(脊灰)野病毒快速检测策略.方法 采集671名来自脊灰野病毒流行疫区的在京学生粪便标本,采用一组实时荧光RT-PCR代替标准方法分别进行肠道病毒通用型检测、脊灰病毒分型检测、Ⅰ型脊灰疫苗株和野毒株鉴别检测.并利用Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型脊灰病毒标准株(Sabin株)和Ⅰ型野毒株对实时荧光RT-PCR和标准方法的灵敏度进行比较和评价.结果 (1)新脊灰病毒检测流程(肠道病毒通用型检测+脊灰病毒分型检测+脊灰野毒鉴别检测)检出非脊灰肠道病毒33例；脊灰病毒疫苗株16例,其中Ⅰ型5例、Ⅱ型1例、Ⅲ型3例、Ⅰ+Ⅱ型1例、Ⅰ+Ⅲ型4例、Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ型2例；脊灰病毒Ⅰ型野毒株3例.(2)3种实时荧光RT-PCR检测脊灰病毒比标准方法敏感1～ 100倍.其中肠道通用型检测和脊灰病毒分型检测2种方法对Ⅱ型脊灰病毒疫苗株的检测,比标准方法敏感100倍；脊灰病毒分型检测能准确区分Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型脊灰疫苗株,脊灰野毒株鉴别检测对Ⅰ型疫苗株的检测比标准方法敏感10倍；3种实时荧光RT-PCR均能有效检测出Ⅰ型脊灰野毒株,比标准方法敏感10倍.结论 新的脊灰病毒检测流程,可大幅缩短检测时间,提高检测通量,且灵敏度高于标准方法,适合于脊灰应急检测应对突发疫情.
关键词： 脊髓灰质炎病毒 脊髓灰质炎野病毒 实时荧光RT-PCR -
禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测方法的建立
为了对致病性强、危害性大的H5、H7、H9亚型禽流感病毒进行同时集成化快速检测,通过对GenBank已报道的禽流感病毒的HA基因进行序列分析比较,设计了H5、H7、H9 3个亚型的特异性引物和分别用3个荧光基团标记的Taqman MGB核酸探针.将各个亚型引物与探针优化组合,筛选出能够同时检测禽流感病毒 H5、H7、H9 3个亚型、且对Ct值和扩增效率影响不大的3组引物和探针,建立了三重实时荧光RT-PCR方法.该方法特异性好,在我们检测的样品中,没有发现假阳性和假阴性现象.同时敏感性高,检测禽流感病毒 H5、H7、H9亚型的敏感性分别达到1 000、1 000、500个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对禽流感H5、H7、H9 3个亚型的不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测3个病毒亚型.所建立的方法对保存的89个禽流感病毒样品进行检测,结果与经典检测方法(病毒分离鉴定、HA、HI)的符合率达100%.用上述建立的方法与鸡胚分离法同时对新鲜采集的4 000多份临床样品进行检测,两种方法的检测结果符合率为100%.
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K亚群禽白血病病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立及初步应用
根据GenBank数据库K亚群禽白血病病毒(Subgroup K avian leukosis virus,ALV-K)特异性抗原gp85的基因序列,设计一组ALV K特异性的引物和探针,并构建阳性重组质粒.在对反应体系进行优化的基础上,建立了ALV-K的实时荧光RT-PCR检测方法并进行了特异性试验、敏感性试验和重复性试验.结果显示,本方法能对ALV-K进行特异性扩增,而对A亚群、B亚群、J亚群、E亚群禽白血病毒和新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、禽网状内皮组织增生病病毒(REV)、禽流感病毒(AIV)等禽病病原未见扩增.该方法低能够检测到3.4×101拷贝数/μL的阳性质粒,灵敏度是RT-PCR的100倍.应用本方法对人工攻毒ALV-K的SPF鸡各脏器进行病毒定量分析,结果显示,在攻毒鸡体内心、肝、脾、肺、肾等脏器中均能检测到ALV-K,且肝、肾和脾中的病毒含量显著高于心和肺(P＜0.01).
关键词： 禽白血病病毒(ALV-K) K亚群 实时荧光RT-PCR 检测方法 应用 -
脑室内注射β淀粉样蛋白造成大鼠大脑皮层KIF家族基因表达变化
目的探询脑室定向注射淀粉样蛋白对大鼠大脑皮层神经元驱动蛋白超家族(KIFs)基因表达的影响.方法脑室定向注射淀粉样蛋白诱导大鼠产生类似阿尔茨海默病的症状.水迷宫实验验证大鼠记忆损伤程度;胆碱乙酰基转移酶(ChAT)基因的RT-PCR扩增证实大鼠大脑皮层胆碱能神经元损伤.实时荧光PCR方法检测大鼠大脑皮层神经元驱动蛋白(kinesin)、KIFlb、KIFlc、KIF3a、KIF3c与KIF4基因的表达. 结果水迷宫实验与ChAT表达检测表明动物模型制备成功.实时荧光PCR结果显示,淀粉样蛋白脑室内注射造成大鼠皮层KIFs基因表达的普遍上升.结论淀粉样蛋白造成的皮层胆碱能神经元损伤很可能与其兴奋性毒性有关.
关键词： 神经元驱动蛋白 淀粉样蛋白 基因表达 实时荧光RT-PCR 大鼠 -
LGR5在肝癌细胞及肝癌组织中的表达及意义
目的 探讨LGR5在4个肝癌细胞系、癌旁组织及肝癌组织中的表达,及在肝癌中的作用.方法 免疫印迹法及实时定量RT-PCR检测正常细胞和4种肝癌细胞中LGR5的表达;采用免疫组织化学检测36例肝癌及癌旁组织中LGR5及β-catenin的表达;利用免疫细胞化学检测HepG2细胞中LGR5的表达.结果 免疫印迹法及实时定量RT-PCR证实,与正常肝脏细胞相比,LGR5除了在HepG2细胞中等表达外,在另外3种肝癌细胞Hep3B、Huh7、PLC中呈弱表达或不表达(P<0.05),免疫细胞化学结果进一步证实LGR5在HepG2细胞膜上表达.免疫组织化学结果显示,与癌旁组织相比,LGR5在肝癌组织中表达明显减少,而β-catenin的表达显著增加.结论 与正常肝脏细胞及癌旁组织相比,LGR5在多种肝癌细胞及肝癌组织中的表达明显减少.
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实时荧光RT-PCR与普通RT-PCR检测手足口病病原体的比较分析
目的 对比分析实时荧光RT-PCR和普通RT-PCR方法在检测手足口病病原体的差别. 方法 选择临床诊断为手足口病患者粪便256份,提取RNA,用实时荧光RT-PCR和普通RT-PCR检测手足口病肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CoxA 16)和总肠道病毒(PE),对实验结果进行统计学分析. 结果 实时荧光RTPCR和普通RT-PCR检测手足口病患者粪便标本,CoxA 16结果差异有统计学意义(P＜0.01),CoxA 16阳性率分别为62.22％和16.67％; EV71、PE结果差异无统计学意义(P＞0.05),实时荧光RT-PCR方法EV71和PE阳性率为42.22％和65.00％,普通RT-PCR方法为37.78％％和55.00％.普通RT-PCR检测的36份EV71、CoxA 16和PE全阴性标本,荧光RT-PCR方法检出PE阳性9份、EV71阳性4份、CoxA 16阳性14份. 结论 实时荧光RT-PCR方法比普通RT-PCR方法更灵敏、快捷,适用于临床手足口病病原体的检测.
关键词： 手足口病 EV71 CoxA 16 实时荧光RT-PCR 普通RT-PCR -
实时荧光RT-PCR法快速检测三带喙库蚊中的流行性乙型脑炎病毒
目的：从四川省成都地区采集三带喙库蚊样品，快速检测蚊虫中的流行性乙型脑炎病毒（JEV），并确定JEV基因型别。方法采用实时荧光RT?PCR方法检测蚊体内的JEV。利用一步法RT?PCR试剂盒扩增阳性样品PrM区段特异性核苷酸序列，测序后应用Clustal X1.83和Mega 5.0软件构建系统进化树，并进行基因分型和同源性分析。结果2012年采集三带喙库蚊雌蚊10656只，分为219份，检测出7份JEV阳性核酸样品，阳性率为3.2%。扩增PrM区域特异性核苷酸序列674 bp，经鉴定均为基因Ⅰ型。与国内外部分GⅠ型的相关序列比较，核苷酸同源性为91.5%～100%，氨基酸同源性为94.9%～100%，其中与四川省SC09-X08株同源性高。结论实时荧光RT?PCR法能快速检测三带喙库蚊中的JEV，成都地区存在基因Ⅰ型JEV流行。
关键词： 三带喙库蚊 流行性乙型脑炎病毒 实时荧光RT-PCR 基因分型 同源性分析 -
戊型肝炎病毒各生物标志物之间关系分析
目的 分析戊型肝炎病毒(HEV)各生物标志物之间关系以及各标志物在早期诊断中的作用.方法 从临床收集急性散发性肝炎患者的血清,用酶联免疫(EIA)试剂检测HEV IgG抗体、IgM抗体和抗原,用实时荧光RT-PCR方法 检测核酸,比较其相关关系.结果 在121例急性散发性肝炎中,HEV IgM抗体阴性者为51例,其中抗原或/和核酸阳性者占45.1%;IgM抗体阳性者70份,其中抗原或/和核酸阳性者占67.1%.HEV IgG抗体在IgM抗体、抗原和核酸均阴性的患者中阳性率为53.6%;在IgM阴性而抗原或/和核酸阳性者中阳性率为73.9%;在IgM阳性的HEV感染者中阳性率为92.9%.HEV抗原与核酸的符合率为81.8%,抗原与IgM抗体的符合率为58.7%,而IgM抗体与核酸的符合率为53.7%.结论 在HEV感染的早期诊断中增加抗原和核酸的检测有助于提高检出率.
关键词： 戊型肝炎病毒 实时荧光RT-PCR IgM抗体 IgG抗体 -
SPF家兔尿液中戊型肝炎病毒传染性的研究
目的 研究家兔尿液中戊型肝炎病毒(HEV)的存在情况,评价尿液中排出的HEV是否具有传染性.方法 使用兔型HEV毒株攻击SPF家兔,建立家兔HEV感染模型,采用实时荧光RT-PCR试剂和ELISA抗原、抗体检测试剂检测血清、粪便和尿液样品中的各病毒标志物和血清中的生化指标.到期解剖感染家兔,取肝脏和肾脏组织,进行组织病理和免疫组化检查.使用家兔阳性尿液攻击家兔,评价尿液的传染性.结果 HEV抗原和核酸能够从感染家兔R1#的尿液、血清和粪便中持续检出,转氨酶也检测到异常,家兔呈现典型的急性感染的特点.尿液中HEV抗原与核酸的比值显著高于血清和粪便,尿液中虽然未检测到有异常的生化指标,但肾脏组织病理改变比较典型.将阳性尿液感染2只家兔,其中1只血清和粪便中能检出病毒核酸,并且分离该粪便中的病毒能再次感染家兔.结论 家兔HEV感染能够导致肾脏损伤,并且感染后的尿液有传染性.尿液中的HEV抗原可以作为诊断HEV感染有意义的指标.
关键词： SPF家兔 戊型肝炎病毒 尿液 实时荧光RT-PCR HEV抗原 -
手足口病病原体实时荧光RT-PCR反应体系的建立与临床应用
目的 建立一种快速、准确、特异件高的方法 检测手足口病病原体.方法 根据引起手足口病常见致病原肠道病毒71(EV71)、柯萨奇病毒A16(CA16)及肠道病毒(EV),设计相应的引物、探针对35例临床诊断的手足口病患儿及20例正常健康婴儿的粪便进行EV、EV71、CA16三种病原体实时荧光RT-PCR检测,同时对55分标本进行EV71病毒培养分离.结果 35例临床诊断手足口病患儿粪便中EV全部阳性,EV71阳性25例,CA16阳性8例,其中3例为EV71、CA16同时阳性,与临床诊断符合率为85.71%,20例健康体检婴儿粪便中EV病毒5例阳性,EV71、CA16均阴性.结论 荧光RT-PCR对手足口病病原体检测准确性高、特异性强,具有快速、廉价等特点,适合于手足口病的早期诊断.
关键词： 手足口病 肠道病毒 柯萨奇病毒A16 实时荧光RT-PCR -
非酒精性脂肪肝大鼠肝脏硬脂酰CoA去饱和酶-1表达与ATP浓度之间的关系
目的:研究非酒精性脂肪肝大鼠肝脏SCD-1表达及ATP含量之间的关系.方法:SD大鼠30只分成正常组、高脂组,在实验的第8,16和24周分批处死,观察肝脏组织学改变,荧光素酶-荧光素法测定肝脏ATP含量,RT-PCR实时荧光分析大鼠肝SCD-1mRNA与β-actin mRNA的比值.结果:肝组织HE染色显示高脂组大鼠肝脏内有弥漫性肝细胞脂肪变性,8 wk达到脂肪肝诊断标准.8 wk表现为单纯性脂肪肝,16-24 wk进展为脂肪性肝炎.电镜下发现实验组与对照组相比,肝细胞线粒体肿胀、增大,部分内膜嵴粒脱落,16 wk发现线粒体内有类圆形结晶样物质沉积.实验组肝SCD-1 mRNA表达下降,8,16和24 wk的测定值分别为0.39±0.18 vs 0.83±0.28(P＜0.05)、0.44±0.17 vs0.81±0.30(P＜0.05)和0.47±0.23 vs 0.88±0.22(P＜0.01);每克肝匀浆ATP含量(10-8 μmol/L)减低(2.40±0.54 vs 2.96±0.43,P＞0.05,2.26±0.55 vs 3.00±0.42,P＜0.05和1.74±0.45 vs 2.79±0.40,P＜0.01).肝SCD-1 mRNA表达与ATP含量呈正相关(r=0.46,P＜0.05).结论:长期高脂饮食引起肝SCD-1的表达下调,促使脂肪在肝内蓄积形成非酒精性脂肪肝.同时使肝细胞内饱和游离脂肪酸增加,线粒体结构和功能受损,使ATP的合成和储存下降,加重氧化应激对肝细胞的打击和肝脏的炎症反应.
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2012年手足口病实验室检测及流行病学分析
目的 了解济源市手足口病病例肠道病毒的感染情况,为制定预防和控制策略提供依据.方法 对2012年1-12月济源市临床诊断为手足口病患者的862例标本,运用实时荧光RT-PCR技术检测样本中的肠道病毒核酸.结果 济源市2012年862例手足口病病例标本中检出阳性标本742例,阳性率为86.08％；其中肠道病毒71型(EV71) 502例,柯萨奇CoxA16 172例,其他肠道病毒68例.结论 济源市2012年1-12月EV71是手足口病病例的主要病原体,病例主要为5岁以下散居儿童为主.
关键词： 手足口病 肠道病毒71型 柯萨奇病毒A组16型 实时荧光RT-PCR -
浅析实时荧光RT-PCR与普通RT-PCR检测手足口病病原体的比较分析
目的：对实时荧光RT-PCR与普通RT-PCR检测手足口病病原体进行比较与探析。方法随机抽选2013年1月至2015年6月我院收治的125例手足口病患儿，共收集167份检验标本，均先后使用实时荧光RT-PCR与普通RT-PCR进行手足口病病原体的检测，对比与观察两种检测方法的检测结果。结果实时荧光RT-PCR在粪便中的EV71的阳性检出率是41﹒18%，普通RT-PCR是38﹒24%，无显著差异性（P＞0﹒05）。实时荧光RT-PCR中粪便的CoxA16阳性检出率是61﹒76%，普通RT-PCR是14﹒71%，差异性显著（P＜0﹒05）。实时荧光RT-PCR与普通RT-PCR在脑脊液、咽拭子等检测样本中EV71与CoxA16的阳性检出率均存在显著差异性（P＜0﹒05）。结论实时荧光RT-PCR在手足口病病原体的检测中比普通RT-PCR更具有优势，具备快捷性与灵敏度。
关键词： 实时荧光RT-PCR 普通RT-PCR 手足口病病原体 -
环介导等温扩增检测甲型H1N1病毒核酸方法的建立
目的 建立检测甲型H1N1病毒环介导等温扩增的方法(LAMP).方法 根据已公布的甲型H1N1流感病毒HA基因序列766～995bp的6个位点设计6条LAMP引物(2条内引物,2条外引物,2条环引物),优化并建立LAMP检测体系.并对36例确诊H1 N1感染患者和20例健康体检者的咽式子同时采用实时荧光RT-PCR(Real-time RT-PCR)和LAMP进行H1N1病毒核酸的检测.结果 所建立的甲型H1N1病毒核酸LAMP反应体系具有良好的特异性,采用该体系检测结果与Real -time RT-PCR检测结果一致,对H1N1核酸阳性的标本经LAMP扩增产物电泳图为阶梯状条带,健康对照标本未见条带产生.灵敏度试验,采用103复制的H1N1质粒进行10倍稀释后LAMP法仍能检出.特异性试验,20例体检标本经两种方法检测全阴性,对肺炎支原体和肺炎衣原体阳性标本采用该反应体系进行检测结果为阴性.结论 甲型H1N1病毒核酸LAMP检测方法简便、快捷,对实验仪器设备要求不高,适合各级实验室和现场快速诊断使用.
关键词： 流感病毒A型 H1N1亚型 病毒 环介导等温扩增 实时荧光RT-PCR -
实时荧光RT-PCR与细胞培养法在流感病毒检测中的应用效果观察
目的：分析研究实时荧光逆转录聚合酶链式反应RT-P CR和细胞培养法两种检测方法在流感病毒检测中的应用、及适合的领域。方法采集2014年10月至2015年3月国家级流感检测哨点医院抚顺市中心医院内科和儿科门诊病例咽拭子样本500份，同时采用实时荧光RT-PCR检测流感病毒核酸，以及采用MDCK进行阳性标本培养，分离流感病毒，比较两种方法的灵敏度以及差异性。结果在500份样本中，通过荧光RT-PCR检测阳性84份；通过MDCK细胞培养法阳性35份。二者之间的差异具有统计学意义（P<0.05）。结论实施荧光RT-P CR在检测流感病毒时快速有效，更适合应急疫情的快速诊断。细胞培养法更适合核实疫情的实验室诊断，通过病毒抗原性和基因特性进行分析，是流感病原学检测的基础。
关键词： 实时荧光RT-PCR 细胞培养法 病毒核酸 MDCK -
咸阳市甲型H1N1流感病例的实时荧光定量RT-PCR检测
目的 对咸阳市首例甲型H1N1流感病例进行病毒核酸检测,为此后疫情的防控提供参考;方法采集病人1份咽拭子标本,使用两种不同厂家试剂,利用实时荧光RT-PCR法检测[1]进行甲型H1N1流感病毒核酸检测;结果结果显示两种试剂RTPCR反应体系扩增曲线都有明显对数增长,且Ct值符合质量控制的标准,为甲型H1N1流感病毒核酸阳性,同一份咽拭子标本送陕西省疾控中心复检,结果为甲型H1N1流感病毒核酸检测为阳性;结论这名病人为1例甲型H1N1流感病毒感染者的密切接触者,由于及时采用灵敏度高,特异性强,检测时间短的实时荧光定量R T-P C R方法检测,快速确诊了病例,为疫情的控制争取了时间,防止了2代病例的出现.
关键词： 甲型流感 实时荧光RT-PCR 检测 -
一起外轮聚集性诺如病毒感染事件的病原学检验
目的 报告一起入境外籍船员聚集性非细茵性食物中毒事件的病原学检验.方法 采集该外轮11名船员的样本,应用实时荧光RT-PCR方法对样本进行核酸检验,结果呈阳性的样本应用RT-PCR方法进行验证,PCR产物进行测序并做序列分析.结果 从11份样本中检出5例诺如病毒GGⅡ-4群阳性.结论 引起此次外籍船员腹泻爆发的病原体为GGⅡ-4群诺如病毒.Real-time RT-PCR方法检验诺如病毒快速、准确、特异性强.此次为中国检验检疫机构首次从国境口岸检出诺如病毒.
关键词： 诺如病毒 实时荧光RT-PCR -
实时荧光PCR技术在手足口病病毒核酸检测中的应用
目的 探讨实时荧光RT-PCR和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测手足口病病毒核酸的应用价值.方法 采集2009年5-8月奉贤区幼儿疑似肠道病毒感染者粪便和咽拭子标本,分别用实时荧光RT-PCR和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法对肠道病毒EV71、Coxsackie A16(CoXA16)病毒进行检测.结果 在对38例疑似病例的粪便和咽拭子标本进行检测时,用实时荧光RT-PCR方法检测到EV71、CoXA 16阳性标本为63份,阳性率为82.89%;而用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测到52份阳性标本,阳性率为68.42%.结论 实时荧光RT-PCR技术具有特异性强、灵敏度高的特点,且能在采样后数小时内检测到病毒的RNA,从而达到快速诊断的目的 .因此,该方法对肠道病毒的流行病学调查及控制起重要作用.
关键词： 手足口病 肠道病毒EV71 CoxA16 实时荧光RT-PCR RT-PCR -
实时荧光RT-PCR快速检测手足口病病原体结果分析
目的 建立手足口病的实时荧光RT-PCR检测技术平台,开展手足口病病原学检测工作,为手足口病防控提供实验依据.方法 用实时荧光RT-PCR法检测河池市2010-2011年手足口病EV、EV71和CA16病毒核酸.结果 共检测578例手足口病临床诊断病例样本,421例EV阳性,阳性率为72.84％；其中EV71阳性109例(25.89％),CA16阳性198例(47.03％),其他肠道病毒阳性114例(27.08％)；6岁以下儿童EV阳性占所有感染者的99.05％；2010和2011年儿童EV71、CA16、其他肠道病毒阳性率分别为47.86％、10.00％、18.57％和9 59％、42.01％、20.09％；重症病例EV71阳性率为65.38％.结论 实时荧光RT-PCR法,适合于手足口病快速确诊及常规监测,特别是重症病例诊断的重要依据.该市不同年度手足口病感染型别有差异,2010年的主要病原体为EV71,其次是其他肠道病毒；而2011年的主要病原体为CA16,其次其他肠道病毒.6岁以下儿童是EV感染的高危人群；EV71是引起重症病例的主要病原体.
关键词： 手足口病 EV71 CA16 实时荧光RT-PCR
