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成都地区三带喙库蚊乙脑病毒带毒率调查
目的 调查成都地区三带喙库蚊(Culex tritaeniorhynchus)乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)带毒率,为乙脑疫情的防控提供科学依据.方法 采用实时荧光RT-PCR技术快速检测三带喙库蚊携带乙脑病毒的情况.结果 采集三带喙库蚊雌蚊10 656只,分为219份,检测出7份乙脑病毒阳性核酸样品,阳性检出率3.2％,自然蚊体带毒率0.065％.结论 成都地区三带喙库蚊种群携带乙脑病毒,应加强蚊密度及相关带毒监测,根据监测结果提出蚊类防制对策.
关键词： 三带喙库蚊 乙脑病毒 实时荧光RT-PCR 带毒率 蚊类防制 -
燃煤型砷中毒患者金属硫蛋白基因表达
目的比较燃煤型砷中毒患者与正常人群金属硫蛋白(MT)表达,研究金属硫蛋白基因在燃煤型砷中毒患者中的表达及其意义,阐明燃煤型砷中毒分子机制.方法燃煤型砷中毒患者与正常人群各50例,采用Trizol-酚-氯仿一步法提取总RNA.紫外分光光度法测定RNA的量,A260/A280鉴定RNA纯度.采用实时荧光RT-PCR技术测定燃煤型砷中毒MT mRNA的表达,以β-actin作为实时荧光RT-PCR的质控,当P<0.05时认为差异有统计学意义.结果正常组MT mRNA的相对表达水平为6.82±7.80,砷中毒组MT mRNA的相对表达水平为2.02±2.82.燃煤型砷中毒患者MTmRNA表达降低,约为正常对照的30%,二者间差异有统计学意义(P<0.01).结论金属硫蛋白在燃煤型砷中毒代谢中有重要意义,起重要的调控作用.MT mRNA表达降低可能是砷中毒机制之一.
关键词： 燃煤型砷中毒 金属硫蛋白 实时荧光RT-PCR 基因表达 -
2009-2012年内蒙古自治区急性呼吸道感染患儿呼吸道合胞病毒感染的检测及分布特征
目的:了解内蒙古自治区14岁以下儿童急性呼吸道感染患者中呼吸道合胞病毒(RSV)的感染状况,阐明内蒙古自治区儿童RSV感染的流行趋势.方法:收集2009年1月-2012年10月内蒙古中、东和西部地区14岁以下儿童急性呼吸道感染及肺炎病例标本共3 207份,采用实时荧光RT-PCR法扩增RSV的部分基因片段.对不同时间、不同年龄和不同地区的样本的RSV阳性率进行分析.结果:检测的3 207份样本中,阳性样本224份,阳性率为6.98％.RSV全年均可检出,检出率高峰期主要集中在10月到次年的3月份.不同年龄段对RSV的易感性不同,3岁以下儿童RSV感染高于与3岁以上儿童(x2=31.89,P＜0.01).1～6月龄婴儿的感染率(19.61％)高,然后随着年龄的增加感染率逐渐下降.不同性别感染率之比为男性∶女性=1.37∶1.RSV感染病例在内蒙古东、中和西部地区均有分布,无明显的地域差异(x2=0.207,P＞0.05).结论:RSV在内蒙古自治区全区流行,发病高峰期为冬春季节,3岁以下儿童为高发人群.
关键词： 呼吸道感染 呼吸道合胞病毒 实时荧光RT-PCR 儿童 -
上海市浦东新区2013-2014年手足口病流行特征分析
目的 探讨2013-2014年上海市浦东新区手足口病病原学特征及其流行趋势,为下一步加强防控工作提供有效依据.方法 采集2013-2014年浦东新区临床诊断手足口病病例标本,运用实时荧光RT-PCR方法检测.结果 2013-2014年共检测手足口病样本823份,其中肠道病毒通用核酸检测阳性率为63.18％,EV71和CoxA16核酸检测阳性率分别为24.04％和30.19％,CoxA6和CoxA10阳性率分别为26.54％和1.54％,其他未分型肠道病毒占17.69％,2013-2014年的主要病原分别为CoxA6和CoxA16.1～12月份均有手足口病疫情报告,发病高峰集中在4～6月份.核酸阳性患者的男女性别比为1.50∶1,男性发病率显著高于女性,发病年龄集中在5岁以下,尤以3岁年龄组发病率高,占阳性总数的34.62％.结论 浦东新区2013-2014年手足口病流行的病原体主要为CoxA16,而CoxA6也已成为浦东地区手足口病流行的重要病原,今后应加强多种病原监测,做好防控措施是预防手足口病的关键.
关键词： 手足口病 肠道病毒 实时荧光RT-PCR 上海 -
慢性粒细胞白血病患者外周血BCR/ABL融合基因表达水平及意义
目的 观察慢性粒细胞白血病(CML)初发和急变患者外周血BCR/ABL基因的表达变化.方法 建立实时定量RT-PCR同时检测b2a2和b3a2两种融合基因亚型,检测25例CML初发和25例CML急变患者的外周血样本中BCR/ABL融合基因的表达.结果 BCR/ABL及GAPDH标准曲线的相关系数均为1.0,灵敏度为2 pg RNA,根据熔解温度的不同可以区分b2a2和b3a2两种融合基因亚型.CML急变患者外周血BCR/ABL融合基因的表达水平是初发患者的4.72倍.结论 本法简便、敏感、特异,可以相对定量BCR/ABL融合基因表达水平,有助于反映白血病细胞负荷,评价疗效及判断预后.
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一步法实时RT-PCR快速检测手足口病肠道病毒
目的 探讨实时荧光RT-PCR在手足口病(HFMD)肠道病毒快速检测中的应用价值.方法 以实时荧光RT-PCR检测64例临床初诊为HFMD患儿标本中总肠道病毒(EV)、柯萨奇病毒A组16型(CA16)和肠道病毒71型(EV71),用RD细胞、Vero细胞和Hep-2细胞进行病毒分离培养,以免疫荧光法鉴别分离培养的EV71.结果 64例标本中,EV(+)/EV71(+)为23.4%(15/64)、EV(+)/CA16(+)为48.4%(31/64)、EV(+)/EV71(-)/CA16(-)为10.9%(7/64)、EV(-)/EV71(-)/CA16(-)为17.2%(11/64).实时荧光RT-PcR检测为EV71且病毒分离培养出现细胞病变效应的培养细胞经抗EV71单克隆抗体免疫荧光检测均为阳性,未发生细胞病变效应或非EV71的培养细胞均为阴性.结论 实时荧光RT-PCR检测HFMD病原具有特异和快速等优点,与病毒分离培养具有较高的一致性,可用于手足口病的早期诊断和鉴别诊断.
关键词： 手足口病 实时荧光RT-PCR 肠道病毒 免疫荧光检测 -
BCR/ABL融合基因和转录因子FoxO3a在初发和急变慢性粒细胞白血病患者中的表达变化
目的:观察慢性粒细胞白血病(CML)初发和急变患者外周血BCR/ABL融合基因和转录因子FoxO3a的表达变化及其意义.方法:利用EVA Green建立实时荧光RT-PCR检测BCR/ABL、FoxO3a和GAPDH的方法,检测25例CML初发和25例CML急变患者的外周血样本中BCR/ABL融合基因和FoxO3a的表达,以及30例正常人外周血样本中FoxO3a的表达,以GAPDH为内参基因,各组基因表达水平的差异采用△△CT相对定量法.结果:CML急变患者外周血BCR/ABL融合基因的表达水平是初发患者的4.72倍,正常人外周血样本中FoxO3a的表达水平分别是CML初发和急变患者的143.39倍和8.18倍.结论:BCR/ABL融合基因的高表达与转录因子FoxO3a的低表达可能与CML不同阶段的病理过程相关联.
关键词： BCR/ABL FoxO3a 慢性粒细胞白血病 融合基因 实时荧光RT-PCR -
东台市2012-2015年手足口病病原学特征
目的 掌握东台市2012-2015年手足口病病原学特征,为防控及临床诊治提供依据.方法 采集临床诊断手足口病患者的咽拭子和肛拭标本进行核酸病毒检测并分型,分析检测结果.结果 2012-2015年检测标本核酸阳性率44.0％(106/241),阳性率总体呈下降趋势.型别构成比:CVA16为43.4％、EV71为23.6％、其他肠道病毒为33.0％,不同年份流行优势株有所差异,检出病原由以往的CVA16为主,转为CVA16、EV71和其他肠道病毒共同流行.重症患者仍以EV71型感染为主.结论 东台市2012-2015年手足口病病原谱发生了变化,应继续开展病原监测,掌握其他未分型肠道病毒的流行特征.
关键词： 手足口病 肠道病毒 实时荧光RT-PCR 病毒分型 -
大连市2013年腹泻患者诺如病毒检测分析
目的 了解大连地区2013年腹泻患者中诺如病毒的感染情况.方法 收集2013年大连地区腹泻监测点大连市儿童医院及大连市中心医院腹泻粪便标本300份,用荧光定量PCR方法检测并分析基因型.结果 300份粪便标本中,诺如病毒阳性27份,均为GⅡ型,检出率9.0％;检出率:男性9.9％,女性8.0％;儿童21.2％,成人2.5％;发病以冬季为主(63.0％,其中儿童病例占94.1％).结论 诺如病毒是大连地区病毒性腹泻病原体之一,以GⅡ型为主,冬季高发,冬季儿童腹泻应考虑诺如病毒感染.
关键词： 诺如病毒 腹泻 病毒性腹泻 实时荧光RT-PCR 大连市 -
龙岩市2011年流感监测结果分析
目的 掌握2011年龙岩市流感的流行趋势,为制定防治措施提供依据.方法 由流感哨点医院及各县(市、区)疾控机构采集并送检流感样病例(ILI)咽拭样本,用实时荧光RT-PCR和MDCK细胞分离法进行检测.结果 2011年国家级哨点医院市第一医院门急诊病例就诊331 339人次,其中流感样病例17 347例(5.2％),5岁以下的婴幼儿占60.1％；各周ILI％2.4％～8.5％(平均5.2％).全年均处于ILI％基线附近,高峰出现在29周,高于ILI％警戒线.全年共对887份咽拭标本进行流感病毒分离,阳性率3.7％；检测病毒核酸共845例,阳性率17.0％,24岁以下年龄段占65.3％.结论 龙岩市流感活动有明显季节性,第1个流行高峰为2～5月,第2个高峰为10～12月,流感病毒流行株以2009年大流行H1N1型和乙型Victoria系为主.
关键词： 流感监测 病毒分离 核酸检测 实时荧光RT-PCR 龙岩市 -
实时荧光RT-PCR在HIV母婴传播病例诊断中的应用
[目的]探讨反转录-PCR技术在HIV母要传播早期诊断中的应用.[方法]应用实时荧光定量反转录-PCR技术,结合HIV病毒分离等方法分析我中心发现的4例HIV抗体确认试验阳性、月龄在18个月以下婴幼儿的HIV感染状况.[结果]3例分别为8、12、13月龄的婴儿,血浆HIV-1 RNA实时荧光定量反转录-PCR检测结果均阳性,病毒载量5.12×104～6.80×106copies/ml;对8月龄病例同时进行HIV病毒分离,结果也阳性.另1例出生5 d的新生儿血浆HIV-1 RNA病毒载量＜500 copies/ml,平行进行的HIV病毒分离结果阴性.[结论]确定8月龄的婴儿系HIV病毒携带者,推断12、13月龄的婴儿也极可能已被感染,5日龄的新生儿应继续随访,但不排除被HIV感染的可能.实时荧光反转录PCR检测血浆HIV-1 RNA,方法简便、快速、费用适中,其定性结果与HIV病毒分离一致,有望成为HIV母婴传播早期诊断重要辅助手段.
关键词： HIV母婴传播 实时荧光RT-PCR 早期诊断 -
广东首例苏里南输入性寨卡病毒感染病例的实验室检测
目的 对从广州白云国际机场口岸入境的一例自苏里南归国发热人员进行寨卡病毒实验室检测.方法 采集发热人员的血液和唾液样本,同时使用两种寨卡病毒实时荧光RT-PCR试剂进行寨卡病毒核酸检测.RT-PCR扩增寨卡病毒部分基因片段,并进行序列测定和同源性比较.基于扩增片段构建系统进化树,分析输入性病例的来源.结果 实时荧光RT-PCR结果显示,该病例血清样本寨卡病毒核酸弱阳性、唾液样本寨卡病毒核酸阳性.RT-PCR扩增出预期大小约1.5Kb片段,测序结果表明该片段与巴西寨卡病毒株(GenBank号KX197250)相应序列的同源性为99％.系统进化树显示该病毒属亚洲谱系.结论 根据患者流行病学史、临床表现和病例标本核酸检测情况,确诊该病例为广东首例从苏里南地区输入性寨卡病例.
关键词： 寨卡病毒 实时荧光RT-PCR 核酸检测 进化分析 -
发热伴血小板减少综合症病毒核酸快速检测方法的建立与应用
目的 建立发热伴血小板减少综合症病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)核酸快速检测方法,并对276例SFTSV疑似感染病例进行检测.方法 SFTSV JS3株基因组相对保守的序列,设计针对其S片段引物及Taqman探针,建立常规RT-PCR和real-time RT-PCR检测方法,进行敏感性,特异性试验,用2种方法 分别对276例SFTSV疑似感染病例进行检测.结果 常规RT-PCR和real-time RT-PCR两种核酸检测方法 都有较好的特异性,对阳性对照核酸检测限分别为1.0×10-4 和1.0×10-3 TCID50.疑似病例中,常规RT-PCR和real-time RT-PCR分别检出30份和41份阳性,阳性率为10.9% 和14.9%.后者的检出率比前者高(P<0.05).结论 成功的建立了SFTSV核酸快速检测方法,为SFTSV感染的防治提供了有力的依据.
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西尼罗病毒荧光RT-PCR检测方法的建立
目的 用TaqMan技术建立荧光RT-PCR方法 ,用于检测西尼罗病毒(WNV).方法 从GenBank上调取WNV的基因序列,设计WNYA、WNYB、WNYC三套荧光RT-PCR,经优化后用于WNV灭活苗、乙型脑炎病毒(JEV)、黄热病毒(YFV)等11种病毒核酸的检测,同时用10倍倍比稀释的双链DNA、质粒DNA、cDNA、RNA进行扩增,以检测其灵敏度.结果 建立的WNYA、WNYC荧光RT-PCR检出WNV灭活苗阳性,而JEV等10种非WNV病毒均为阴性,能检出30个拷贝和65个拷贝的双链DNA、420个拷贝和460个拷贝的质粒DNA;WNYB的反转录效率明显低于WNYA和WNYC.结论 建立的WNYA、WNYC荧光RT-PCR可作为检测WNV的技术储备.
关键词： 西尼罗病毒 实时荧光RT-PCR 特异性 灵敏度 -
慢性粒细胞白血病病人Mcl-1基因和Bcr/Abl基因的表达及临床意义
目的 探讨慢性粒细胞白血病(CML)病人Mcl-1基因和Bcr/Abl融合基因的表达水平及临床意义.方法 应用实时荧光定量PCR技术检测了41例CML病人(包括慢性期15例、加速期6例、急变期6例、伊马替尼治疗后遗传学完全缓解8例及非伊马替尼治疗的未缓解的CML病人6例)骨髓标本Mcl-1基因、Bcr/Abl融合基因的表达水平,以10例正常人作为对照.结果 CML各组Mcl-1和Bcr/Abl mRNA的表达水平差异均有显著性(χ2 = 19.12～36.08,p<0.05).伊马替尼治疗组与正常对照组Mcl-1 mRNA的表达明显低于其他各组(z=2.547～3.254,p<0.05);加速期、急变期及非伊马替尼治疗组之间Mcl-1 mRNA的表达水平差异无显著性(z=0.481～1.922,p>0.05),但均明显高于慢性期(z=2.65～3.465,p<0.05).Bcr/Abl mRNA在慢性期、加速期、急变期及非伊马替尼治疗组之间表达差异无显著性(z=0.48～1.196,p>0.05).CML患者Mcl-1与Bcr/Abl mRNA的表达水平呈正相关(r=0.68,p<0.05).结论 Mcl-1和Bcr/Abl与CML的病情密切相关,参与CML的发生和发展,是判断病情进展及预后的分子标记物.
关键词： 白血病 髓样 慢性 mcl-1基因 融合基因Bcr/Abl 实时荧光RT-PCR 伊马替尼 -
人季节性H1N1流感病毒小鼠感染模型的建立
目的 制备人季节性H1N1流感病毒的小鼠感染模型,为研究流感病毒致病性、研发抗病毒药物提供模型动物.方法 将人季节性H1N1流感病毒在鸡胚尿囊腔扩增后,滴鼻接种小鼠,4d后将小鼠处死,挑选感染体征严重者进行实时荧光PCR(FQ-PCR)检测肺中的流感病毒,将检测阳性的肺上清在鸡胚尿囊腔扩增,接种于下一代小鼠.比较各代小鼠对流感病毒的适应情况,直至小鼠出现明显的感染体征,取肺研磨制成匀浆,获得流感病毒鼠肺适应株并检测其半数致死量( LD50).将10 LD50的病毒液接种于小鼠,建立人季节性H1N1流感病毒的小鼠感染模型,观察模型小鼠的一般活动状态、体质量变化、肺部病变,HE染色观察肺部病理切片,计算肺指数,FQ-PCR检测病毒RNA.结果 人季节性流感病毒在小鼠体内传代4次后,鼠肺适应株制备完成,其经鼻的LD50为10-2.41/0.05 mL.人季节性流感病毒的小鼠感染模型,一般状态差,体质量明显减轻,肺指数增大,70％出现死亡.病理切片观察病变明显,FQ-PCR显示流感病毒阳性.结论 成功建立了人季节性H1N1流感病毒的小鼠感染模型.
关键词： 流感病毒 感染模型 小鼠 实时荧光RT-PCR -
贝类中诺如病毒检测方法的优化
目的 优化贝类中GⅡ型诺如病毒(NoV GⅡ)的检测方法.方法 用NoV GⅡ人工染毒贝类样本,分别比较曲通X-100缓冲液(KNT)、Tris/甘氨酸/牛肉膏(TGBE)缓冲液、甘氨酸缓冲液、脱脂牛奶、磷酸盐缓冲液(PBS)、PBS-吐温80缓冲液和大豆蛋白缓冲液的洗脱效果以及PEG沉淀法、超滤法和膜吸附法3种浓缩方法的回收效果,并采用实时荧光RT-PCR方法进行检测,后运用优化后的方法对诺如病毒污染的贝类各组织的病毒含量进行检测,以确定佳检测部位.结果 实时荧光RT-PCR结果表明,人工染毒后的贝类样品采用KNT缓冲液洗脱,再用PEG沉淀法浓缩,回收率好,达18.95％;诺如病毒在贝类中的分布主要集中于进出水口、鳃和消化腺.结论 贝类海产品中诺如病毒的检测建议取贝类的进出水口、鳃和消化腺,用KNT缓冲液洗脱、PEG沉淀法浓缩,实时荧光RT-PCR进行检测,以提高检测率.
关键词： 诺如病毒 贝类 检测方法 实时荧光RT-PCR -
新疆出血热病毒的实时荧光RT-PCR检测方法研究
目的:建立新疆出血热病毒的实时荧光RT-PCR检测方法.方法:分析新疆出血热病毒核酸S片段序列的保守性,设计新疆出血热病毒实时荧光RT-PCR引物和探针.以体外转录后的RNA作为阳性对照模板,摸索出实时荧光RT-PCR检测的佳引物浓度、探针浓度和反应体系条件,并进行灵敏度和特异性分析.结果:建立的新疆出血热病毒的实时荧光RT-PCR检测方法佳反应体系为:正向引物CCHFV FP终浓度250 nM,反向引物CCHFV-RP终浓度500 nM,探针CCHFV-Probe终浓度500 nM;扩增程序为:50℃ 10 min,95℃ 10 min;95℃5 s,57℃20 s45次循环.该方法低检测限约为2copies病毒/反应,与森林脑炎病毒和汉坦病毒无交叉反应.结论:该方法灵敏度高、特异性强,适用于新疆出血热病毒的快速检测.
关键词： 新疆出血热病毒 实时荧光RT-PCR 检测 -
黄热病病毒的实时荧光RT-PCR检测方法研究
目的:建立黄热病病毒的实时荧光RT-PCR检测方法.方法:体外转录黄热病病毒3-UTR的部分序列核酸作为阳性对照模板,设计实时荧光RT-PCR不同的反应程序和引物/探针浓度的组合,摸索佳反应体系条件,并用于黄热病疫苗的检测.结果:建立的黄热病病毒的实时荧光RT-PCR检测方法佳反应体系为:正向引物YFV-FP终浓度500 nM,反向引物YFV-RP终浓度750 nM,探针YFV-Probe终浓度250 nM;Roche lightcycler仪器适用的扩增程序为:45℃ 10 min,95℃ 10 min;95℃ 5 S,60℃20 s 45次循环.该方法低检测限约为2copies病毒/反应,与登革病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、基孔肯雅病毒等蚊媒病毒无交叉反应.应用该方法对黄热病疫苗进行检测,结果为核酸阳性.结论:该实时荧光RT-PCR方法灵敏度高,特异性强,适用于黄热病病毒的快速检验.
关键词： 黄热病病毒 实时荧光RT-PCR 检测 -
实时荧光RT-PCR快速检测蚊体内乙型脑炎病毒及福建省基因Ⅰ型乙型脑炎病毒的发现
目的:应用实时荧光RT-PCR方法快速检测蚊体内乙型脑炎病毒,并对蚊体内携带的乙型脑炎病毒进行基因分型.方法:从蚊媒监测点采集蚊标本,研磨后提取RNA,用新型的LNA探针实时荧光RT-PCR方法进行高通量快速筛查蚊体携带的乙型脑炎病毒,对核酸阳性的标本进一步用乙型脑炎病毒E基因特异引物进行RT-PCR扩增和序列测定,根据所测序列与GenBank中不同地理来源乙型脑炎病毒株E基因核苷酸序列分析的结果进行基因型别的判定.结果:12575只蚊子分成254份,用实时荧光RT-PCR方法从来源于福州的2份三带喙库蚊标本中检出乙型脑炎病毒核酸阳性,经RT-PCR及核苷酸序列测定,得到一段长1500nt的E基因核苷酸序列,序列分析结果显示,其核营酸同源性大的是来源于上海(DQ404100)和浙江(EU258742)的毒株,分别是99.1%和99.0%,均属于基因Ⅰ型病毒.结论:实时荧光RT-PCR方法是快速检测蚊体内乙型脑炎病毒的理想方法,此次调查发现的乙型脑炎病毒是以往福建省内未见报道的基因Ⅰ型病毒.
关键词： 实时荧光RT-PCR LNA探针 乙型脑炎病毒 E基因 基因型
