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278例手足口病病原学监测结果分析
目的 分析永州市2012年1-12月手足口病(HFMD)的病原学特征,为手足口病的预防控制工作提供病原学依据.方法 选取2012年1-12月辖区内三级甲等综合性医院定点收治的278例手足口病病例作为研究对象.采集HFMD患儿发病1周内的咽拭子标本,用实时荧光RT PCR法对患者进行总肠道病毒、柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)和肠道病毒71型(EV71)的特异性核酸检测.回顾性分析患儿性别、年龄、病例来源的分布情况.结果 278例手足口病病例中,肠道病毒通用型核酸阳性182份,检出率65.47％ (182/278),其中EV71、CoxA16、EV71和CoxA16混合感染、非EV71和CoxA16的其他肠道病毒核酸分别为151、1、1、29份,占肠道病毒感染阳性的82.97％ (151/182)、0.55％(1/182)、0.55％(1/182)、15.93％(29/182),非肠道病毒(NEV) 96例占34.53％ (96/278).患儿以3岁以下儿童为主,男性多于女性,以散居儿童居多.结论 2012年1-12月永州市HFMD流行的病原体优势株可能为EV71,实时荧光RT-PCR可用于手足口病的快速诊断,对3岁以下儿童手足口病进行病原学检测,及早发现及早治疗,是防止手足口病死亡病例的关键.
关键词： 手足口病 肠道病毒71型 柯萨奇病毒A组16型 实时荧光RT-PCR -
湖南省湘西自治州首例人感染H5N6禽流感病例的实验室结果分析
目的 对一例不明原因重症肺炎病例进行H5N6禽流感病毒实验室诊断. 方法 采集患者呼吸道标本,利用两种核酸提取方法,使用实时荧光RT-PCR技术进行检测. 结果 H5和N6亚型引物的检测结果均为阳性,其中仪器提取法扩增曲线较手工提取法扩增曲线结果典型. 结论 该病例经实验室检测,为湖南省湘西自治州首例H5N6禽流感病例.为提高H5N6禽流感病毒的检出率,建议在可疑病例使用药物之前,及早采集下呼吸道标本送实验室检测.
关键词： H5N6禽流感 实时荧光RT-PCR 实验室检测 -
胃癌术中腹腔游离癌细胞检测临界值的确定及其临床意义
目的 探讨胃癌术中腹腔游离癌细胞(FCC)检测的佳阳性判定值,以及腹腔FCC的存在对预后的影响.方法 用实时荧光RT-PCR方法检测术中腹腔FCC,并进行5年的随访.用MedCalc软件分析FCC佳阳性判定值;[大于此值表示FCC存在,标记为FCC(+)],并前瞻性地分析FCC(+)组及(-)组与预后的关系.后用多因素Cox回归模型分析影响预后的独立因素.结果 (1)佳阳性判定值为31.21拷贝/mL时约登指数高;(2)FCC(+)与(-)组的平均存活期分别为17.2个月和48.7个月,中位存活期分别为8.1个月和60.0个月;5年累积存活率分别为9.1%和67.4%.Kaplan-Meier生存分析显示,FCC(-)组生存时间明显长于FCC(+)组(P=0.000).Cox模型分析发现FCC,浆膜及远处转移是影响生存预后的独立因素(P＜0.05).结论 (1)FCC佳阳性判定值为31.21拷贝/mL;(2)腹腔FCC是影响预后的独立危险因素之一,FCC(+)反映手术时肿瘤存在扩散状态.预示患者预后较差.
关键词： 胃肿瘤 游离癌细胞 实时荧光RT-PCR ROC曲线 预后 -
新疆出血热病毒实时荧光RT-PCR检测方法的假病毒阳性对照品制备
目的 制备安全、稳定的新疆出血热病毒实时荧光RT-PCR检测阳性对照品.方法 人工合成含实时荧光RT-PCR扩增片段的新疆出血热病毒核苷酸序列,连接入慢病毒载体,将重组慢病毒载体与慢病毒包装载体共转染293T细胞,培养48 h后采用实时荧光RT-PCR方法检测假病毒包装情况,随后将包装成功的假病毒颗粒加核酸保护剂制备成阳性对照品,并进行稳定性试验.结果 重组慢病毒载体与慢病毒包装载体共转染293T细胞后,将收集到的细胞培养上清采用实时荧光RT-PCR进行检测,结果显示10、100、1 000、10 000倍4个倍比稀释度扩增后所得的Ct值分别为13、19、25、33,显示含高浓度的假病毒颗粒.取经1 000倍稀释后制备的阳性对照品于37℃孵箱中放置0、3、7、15、21和30 d后,提取的RNA经实时荧光RT-PCR检测,所得Ct值在25～ 28之间,表明阳性对照品有较高的热稳定性.结论 本研究通过慢病毒包装技术制备的假病毒颗粒,是新疆出血热病毒荧光RT-PCR核酸检测过程中理想的阳性对照品.
关键词： 新疆出血热病毒 实时荧光RT-PCR 阳性对照品 -
2014年深圳市儿童手足口病流行特征
目的 分析手足口病的病原学和流行特征,为该病的预防控制提供科学依据.方法 选择深圳市某哨点医院2014年采集的手足口病患者肛拭子和粪便标本,采用实时荧光RT-PCR技术检测肠道病毒并分型.结果 2014年深圳市某哨点医院共检测845例手足口病例,阳性数717例,总阳性率为84.85％(717/845).其中,肠道病毒71型(EV71)阳性196例,阳性率为23.20%(196/845),柯萨奇病毒A组16型(CVA16)阳性144例,阳性率为17.04%(144/845),其他肠道病毒(EV)阳性376例,阳性率为44.50%(376/845),EV71和CA16混合感染1例,阳性率为0.12%(1/845).5月份为手足口病的高发季节.不同病原的阳性检出率呈现不同的季节分布特征:EV71在5-6月份检出率高,CVA16在6-7月份检出率高,EV分别在2和10月份有2个检出高峰.在实验室检测性病例中,5岁以下儿童占98.61%%(707/717);重症患者中,EV71阳性率为73.12%(68/93);死亡患者中,EV71阳性率为87.50%(7/8).结论 2014年深圳市手足口病主要由其他肠道病毒引起;夏秋季是手足口病高发季节;5岁以下儿童为高危人群.EV71病毒是导致重症手足口病的主要病原体.
关键词： 手足口病 肠道病毒 实时荧光RT-PCR -
柯萨奇A组6型病毒TaqMan探针实时荧光RT-PCR的建立
目的 建立柯萨奇A组6型病毒TaqMan探针实时荧光RT-PCR,用于手足口病例快速诊断及监测.方法 根据GenBank中柯萨奇A组6型病毒VP1高保守序列设计引物和探针,建立和优化实时荧光RT-PCR反应体系,评估其特异性、灵敏度、稳定性,在手足口病监测中应用,并与商品化试剂比较,抽取部分阳性标本测序验证.结果 本研究建立的柯萨奇A组6型病毒实时荧光RT-PCR可在60 min内完成检测,与其它型别的肠道病毒和病原体无交叉反应,灵敏度可达100 copies/μL梯度,对两个不同核酸浓度样本Ct值的变异系数分别为0.29%、0.38%.280份非EV71、CA16的标本中检出142份CA6阳性标本,与商品化试剂检测结果一致.随机抽取15份阳性标本产物测序,与CA6靶基因序列同源性99.8%以上.结论 建立的柯萨奇A组6型病毒实时荧光RT-PCR方法特异、灵敏、稳定,可用于非EV71、非CA16的其它肠道病毒标本分型.
关键词： 手足口病 柯萨奇A组6型病毒 实时荧光RT-PCR -
H7N9禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与评价
目的 应用TaqMan探针实时荧光RT-PCR技术,建立一种快速检测H7N9禽流感病毒的方法.方法 针对H7N9禽流感病毒的HA和NA基因分别设计特异性引物和TaqMan-LNA探针,建立H7N9禽流感病毒特异性实时荧光RT-PCR快速检测方法.结果 本研究建立的方法对检测H7N9禽流感病毒株的灵敏度达到10 PFU/ml.该方法特异性强,与其他亚型流感病毒株及呼吸道病原体无交叉反应.与对照方法相比,本研究方法的检测阳性符合率为99.07％,阴性符合率为100％,Kappa值为0.993.结论 建立的检测试剂盒具有快速灵敏、结果准确可靠等优点,适用于H7N9禽流感病毒的分子生物学检测和监测.
关键词： H7N9禽流感病毒 实时荧光RT-PCR 检测方法 -
肠道病毒71型实时荧光RT-PCR检测方法的建立及临床评价
目的 利用实时荧光RT-PCR技术,并通过系统的分析性能和临床性能评价,建立一种早期快速检测肠道病毒71型(EV71)的方法.方法 根据EV71基因组中编码衣壳蛋白VP1基因保守区序列设计一对引物和一条荧光探针,利用实时荧光RT-PCR技术建立了检测EV71的方法,并对扩增产物进行分析,同时进行灵敏度、特异性、精密度评价.在此基础上利用不同标本类型共1104例临床样本对本方法和RT-PCR方法进行对比分析.结果 本方法可以特异性的检测EV71,而对种属相近的或引起症状相似的其他病毒均无交叉反应.本方法检测灵敏度达到9.22×102 PFU/ml,不同浓度样本的Ct值的变异系数在1.4%～2.9%之间.1104例临床样本的研究显示本方法与RT-PCR方法检测结果的总符合率达到96.74%,阳性样本的检出率要高于RT-PCR方法.结论 本方法检测EV71具有灵敏度高、特异性强、精密度高、快速简便的特点,并与RT-PCR方法具有很好的符合率,在手足口病的早期快速诊断和疫情监测方面具有很好的应用前景.
关键词： 肠道病毒71型 实时荧光RT-PCR 性能评价 -
纳米磁分离实时荧光RT-PCR检测食管鳞状细胞癌患者血清miR-21表达的价值?
目的：建立食管鳞状细胞癌( ESCC)患者血清中miR-21纳米磁分离( MS)实时荧光RT-PCR检测方法,观察ESCC患者血清miR-21的表达。方法分别采用Trizol法和MS法提取60例ESCC患者及60例健康体检者血清总RNA,采用实时荧光RT-PCR检测miR-21的表达。利用Bland-Altman法检验Trizol法与MS法提取的血清中miR-21表达量的一致性,利用ROC曲线评价MS法提取的miR-21表达量筛查ESCC的效能。结果 MS法能够提取血清中miR-21,其灵敏度与Trizol方法相当,Bland-Altman法检验结果显示两种方法提取的miR-21表达量具有很好的一致性。 ESCC患者miR-21表达量明显高于健康体检者( P<0．05)。 ROC曲线下面积为0．878,佳临界值为1．115,此时敏感度为85．00%,特异度为81．67%。 ESCC患者血清miR-21的表达与TNM分期以及淋巴结转移情况相关( P<0．05)。结论 MS实时荧光RT-PCR在血清miRNA检测中有着很大的应用价值,血清miR-21的表达水平有可能作为食管癌诊断一个新的分子生物学指标。
关键词： 磁性纳米微粒 实时荧光RT-PCR miR-21 食管鳞状细胞癌 -
深圳市首例人禽流感病例的实验室检测分析
目的 对深圳市首例人禽流感病例进行实验室确诊,并研究其携带病毒关键基因的遗传特性. 方法 采用实时荧光RT-PCR方法检测高致病性禽流感病毒(H5N1)核酸,采用血凝抑制方法检测患者血清抗高致病性禽流感病毒的抗体滴度变化,利用MEGA 3.1软件分析患者携带病毒HA、NA基因的进化关系. 结果 成功确认了深圳市首例人禽流感病例,患者携带病毒为HSN1高致病性禽流感病毒,HA、NA基因进化关系比较特殊. 结论 深圳地区禽鸟中可能携带高致病性禽流感病毒,具有潜在感染人类的可能.
关键词： 人禽流感病毒 实时荧光RT-PCR 进化树 -
排除流感的儿童流感样病例肠道病毒核酸检测分析
目的 为了解排除流感的儿童流感样病例的肠道病毒感染状况,以减少对手足口病患儿的误诊,提高儿童流感样病例(ILI)标本的采集质量.方法 随机抽取88份已排除流感的儿童流感样病例标本,以实时荧光RT-PCR法进行人肠道病毒(EV)核酸检测并分型.对EV核酸阳性率按季节、年龄、性别和采样人进行分类统计分析.结果 检出EV71型核酸阳性6份、CoxA6型2份、CoxA10型1份、其它型别17份,EV核酸总阳性率为29.55％ (26/88).EV核酸阳性率由高到低的季节依次为:2012年第四季度(47.83％)、2013年二季度(40.00％)、2012年三季度(20.83％)和2013年一季度(9.52％).5岁以下与6岁以上病例标本的EV核酸阳性率依次为36.76％(25/68)和5.00％(1/20).男女病例标本的EV核酸阳性率分别为30.91％(17/55)和27.27％(9/33).医生与护士采集标本的EV核酸阳性率分别为9.09％(3/33)和41.82％(23/55).结论 儿童流感样病例应同手足口病进行鉴别诊断,流感监测哨点医院应提高病例的样本采集质量.
关键词： 流感样病例 儿童 肠道病毒 实时荧光RT-PCR -
实时荧光RT-PCR法快速检测流感病毒的应用研究
目的 应用实时荧光RT-PCR快速检测2009 ～ 2012年河池市流感病毒核酸,为流感的预防控制提供科学依据.方法 采集河池市哨点医院的流感样病例和暴发疫点现患病例的咽拭子标本,采用实时荧光RT-PCR方法进行流感病毒核酸检测分型.结果 以实时荧光RT-PCR法检测2 090份标本,流感病毒核酸阳性801份,总阳性率为38.28％.其中甲型H1N1流感468份,B型126份,季节性流感H1亚型14份,季节性流感H3亚型109份.结论 实时荧光RT-PCR法检测流感病毒具快速、操作方便、特异性强、灵敏度高等优点,值得推广应用.
关键词： 实时荧光RT-PCR 流感病毒 分型 检测 -
惠州地区2010年手足口病实验室检测分析
目的 了解惠州市手足口病例肠道病毒的感染情况,为制定预防和控制肠道病毒感染策略提供依据.方法 采集2010年5月至12月惠州市中心人民医院、惠州市第一人民医院等全市各大医院的998例疑似手足口病患者的疱疹液、脑脊液、咽拭子、粪便等标本,采用实时荧光RT-PCR技术检测样本中的肠道病毒(EV)、肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CA16).结果 在检测的682份EV阳性标本中,EV71阳性率偏高,为总数的48.9％,而CA16阳性率较低,为总数的5.71％；在998例疑似手足口病患者中,男性患者居多,占62.12％,女性患者相对较少,占37.88％; 0～4岁的儿童是手足口病的高发人群,占所有患者的92.99％；5～7月的夏季为手足口病感染的高峰期,其阳性率占98.9％.结论 惠州市2010年5月～12月手足口病的病原体以肠道病毒71型为主,0～4岁的男性儿童是感染肠道病毒的高危人群,5～7月的夏季较为高发.
关键词： 手足口病 肠道病毒 肠道病毒71型 柯萨奇病毒A组16型 实时荧光RT-PCR -
汉城病毒的TaqMan-BHO探针实时荧光定量检测方法的建立
目的：建立一种汉城病毒实时荧光定量 RT-PCR 快速的检测方法。方法用专业软件设计引物和 TaqMan-BHQ探针，以人工合成 L 基因的片段作为模板，进行实时荧光定量 RT-PCR 研究。结果模板的 Ct 值与模板稀释浓度的对数存在良好的线性关系，标准曲线为Y ＝－3.607X ＋41.84，r2＝0.998，PCR 扩增效率为108.1％，其低检出限为53.2 copies／μL。结论应用 TaqMan-BHQ1探针的实时荧光 RT-PCR 检测汉城病毒核酸，具有耗时短、灵敏度高等特点。
关键词： TaqMan-BHQ探针 实时荧光RT-PCR 汉城病毒 定量检测 -
重庆渝东北地区2010年手足口病病原分析
目的 了解重庆渝东北地区儿童手足口病的病原学特征,为手足口病防治工作提供科学依据.方法 收集2010年4～12月268例临床手足口病患儿的肛拭子、咽拭子、疱疹液标本共336份,采用Real-time RT-PCR检测肠道病毒核酸及进行型别鉴定.结果 336份标本中检出193份肠道病毒阳性,总阳性率为57.44％,其中疱疹液、肛拭子、咽拭子标本阳性率分别为79.24％、67.44％、47.21％,泡疹液阳性检出率高.268例患儿中检出146例肠道病毒阳性,阳性率为54.48％,其中CoxA 16感染高,占53.42％,其次为EV71型,占41.10％.重症患儿肠道病毒阳性检出率为68.75％,均为EV71型.男性发病多于女性,男女之比为1.47:1,其差异无统计学意义(x2=0.530,P=0.466).肠道病毒阳性病例主要集中在5岁及以下儿童,占92.47％.结论 2010年渝东北地区手足口病流行的病原体主要为Cox-A16、EV71,重症病例系由EV71病毒感染所致.疱疹液标本中核酸阳性检出率高.
关键词： 手足口病 EV71 CoxA16 实时荧光RT-PCR -
汉坦病毒通用型实时荧光定量RT-PCR方法的建立及应用
目的 建立一种适应汉坦病毒不同基因型别的通用实时荧光定量RT-PCR检测方法.方法 利用BeaconDesigner7.5软件设计引物和探针,以人工合成汉坦病毒5种具有代表性基因型别的L片段作为模板,进行实时荧光定量RT-PCR方法的建立,确定所建立方法的检测限及灵敏度并对采集的112份鼠肺进行快速检测.结果 5种模板RNA的Ct值与其稀释浓度的对数存在良好的线性关系,以HTNV为例建立的标准曲线为:y=-3.40x+46.8,R2=0.99,其低检出限为5.32 copies/μl,对于不同基因型别的汉坦病毒,其检测低限:HTNV为12.40 copies/μl、SEOV为5.32 copies/μl、PUUV为15.02 copies/μl、DOBV为22.14 copies/μl及SNV为24.26 copies/μl.对1 12份鼠肺样本的病毒检出率为17.86％,较巢式RT-PCR的检出率(8.04％)高.结论 建立的通用型实时荧光定量RT-PCR方法灵敏度高,检测的广谱性好,适合啮齿类动物中携带的汉坦病毒的快速检测.
关键词： 汉坦病毒 基因型 定量 实时荧光RT-PCR -
深圳市龙岗区蚊虫自然感染流行性乙型脑炎病毒状况调查
目的 研究深圳市龙岗区蚊虫流行性乙型脑炎病毒自然感染状况,为预测该地区乙脑发病趋势及流行强度,制定有效预防控制措施提供科学依据.方法 采用灯诱法捕捉蚊虫标本并进行分类鉴定,以JEV的NS3基因区段设计特异引物,通过实时荧光RT-PCR (real-time RT-PCR)对蚊虫中流行性乙型脑炎病毒进行检测,阳性标本经测序后再在GenBank中进行核苷酸序列的同源性比对.结果 捕获的蚊虫隶属3属5种,致倦库蚊是优势蚊种;1 533只蚊虫分成25批,从3批致倦库蚊标本中检出JEV核酸阳性,阳性率为12％.阳性标本与GenBank中报道的JEV参考株间相应的核苷酸序列同源性达99％以上,均属于JEV Ⅰ型病毒.结论 龙岗区存在着蚊虫自然感染JEV,致倦库蚊是区内乙脑传播的主要蚊媒,有流行人间和畜间流行性乙型脑炎的潜在危险,提示应进一步完善疫苗接种和免疫监测,积极开展消除蚊虫孳生地,灭蚊、防蚊工作,以控制和切断乙脑传播途径.
关键词： 流行性乙型脑炎病毒 蚊 实时荧光RT-PCR -
实时荧光RT-PCR技术在黄热病快速检测中的应用
[目的]建立黄热病病毒的实时荧光RT-PCR检测方法并用于口岸黄热病的快速检测. [方法]体外转录黄热病病毒5-UTR的部分序列核酸作为阳性对照模板,设计实时荧光RT-PCR不同的反应程序和引物/探针浓度的组合,摸索佳反应体系条件并用于黄热病疫苗和入境发热患者标本的检测.[结果]建立的黄热病病毒的实时荧光RT-PCR检测方法佳反应体系为:2xRT-PCR缓冲液10 μl,正向引物5UTR-FP终浓度750 nM,反向引物5UTR-RP终浓度750 nM,探针5UTR-Probe终浓度500 nM,25xRT-PCR Enzyme Mix 0.8μl,RNA 5μl,用DEPC H2O补足到反应总体积20μl;Roche lightcycler仪器适用的扩增程序为:45℃10 min,95℃10 min;95℃5 s,56℃10 s(single),72℃15 s,45次循环.该方法低检测限约为20copies病毒/反应,与登革病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、基孔肯雅病毒等蚊媒病毒无交叉反应.应用该方法对黄热病疫苗、媒介蚊虫和入境发热患者的血清标本进行检测,结果为黄热病疫苗核酸阳性,其他标本为阴性.[结论]该实时荧光RT-PER方法灵敏度高,特异性强,适用于黄热病病毒的快速检验,防止该病在国境口岸的传入.
关键词： 黄热病病毒 5'端非编码区 实时荧光RT-PCR 快速检测 -
应用荧光定量PCR技术检测肠道病毒71型
[目的]探讨实时荧光RT-PCR和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测肠道病毒EV71病毒核酸的应用.[方法]采集2008年5月深圳市龙岗区幼儿疑似肠道病毒感染者粪便和疱疹液标本,分别用实时荧光RT-PCR方法和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法对肠道病毒EV71病毒进行检测.[结果]在对16例已收集到的患者的粪便、疱疹液标本进行检测时,用实时荧光RT-PCR方法检测到8份阳性样本,阳性率为50.0%(8/16),而用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测到5份阳性样本,阳性率为31.3%(5/16).[结论]实时荧光RT-PCR技术具有特异性强,灵敏度高的特点,且能在采样后数小时内检测到病毒的RNA,从而达到快速诊断的目的,因此该方法对肠道病毒的流行病学调查及治疗起重要作用.
关键词： 肠道病毒EV71 实时荧光RT-PCR RT-PCR -
2009-2015年广州口岸输入性登革热的流行病学分析
目的 分析广州口岸近年输入性登革热病例的流行病学情况,为国内登革热疫情的溯源和制定有效的预防控制措施提供依据.方法 对2009-2015年经广州口岸入境、疑似登革热病例进行流行病学调查和登革病毒的实验室核酸检测,用描述性流行病学方法分析其流行特征和流行因素.结果 2009-2015年,使用实时荧光RT-PCR共检出输入性登革热病例152例,近3年输入病例逐步升高.89.5％病例来自亚洲,其中东南亚占87.5％,主要来源于泰国、越南、马来西亚、印度尼西亚、缅甸和新加坡等地.输入性登革热病例主要集中在21～ 40岁,男性占77％.全年均有输入性病例报告,其中第三季度和第四季度是高峰期,10月份输入性病例多.结论 东南亚地区的入境人员已成为广东省输入性登革热病例的重点人群.广东口岸地区面临输入性登革热的威胁,出入境检验检疫机构应及时掌握国内外疫情信息,加强口岸检疫查验、疾病监测,一旦发现疫情,及时采取有效的控制措施,防止输入性登革热造成本地疫情的爆发.
关键词： 输入性登革热 东南亚 实时荧光RT-PCR 流行病学分析
