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可变数目串联重复序列技术用于中国C群脑膜炎奈瑟菌基因分型的研究
目的利用脑膜炎奈瑟菌基因组中可变数目串联重复序列(VNTR)特征,对中国C群脑膜炎奈瑟菌菌株进行基因分型.方法中国C群脑膜炎奈瑟菌菌株109株,选择脑膜炎奈瑟菌DNA中4个VNTR位点,PCR扩增含有串联重复序列的DNA片段,选择每一个VNTR位点有差别的PCR产物进行测序,序列比对,测算串联重复序列的拷贝数.Bio-Rad Gel DocTM XR凝胶成像分析系统计算PCR产物DNA片段的碱基含量,换算成串联重复数;对109株菌株4个位点的串联重复序列拷贝数进行聚类分析,依据聚类分析结果进行基因分型,并将VNTR基因分型结果与脉冲场凝胶电泳基因分型(PFGE)结果进行比较.结果109株C群脑膜炎奈瑟菌菌株分为22个VNTR基因型,同一暴发来源的菌株具有相同VNTR特征;VNTR基因分型方法与PFGE基因分型具有相关关系.结论应用VNTR技术可以对中国C群脑膜炎奈瑟菌进行基因分型和分子流行病学方面的研究,VNTR基因分型可较好地应用于追溯流行性脑脊髓膜炎暴发传染源.
关键词： C群脑膜炎奈瑟菌 可变数目串联重复序列 基因分型 -
山东地区恙虫病东方体分离株的基因分型与序列分析
目的 鉴定山东地区恙虫病东方体分离株的基因型别,分析其核苷酸序列.方法 以日本、韩国常用的恙虫病东方体分型引物,用巢式PCR技术检测恙虫病东方体分离株的相对分子质量(Mr)56×103蛋白基因片段,对群引物扩增的PCR产物纯化回收后测序,并行序列分析.结果 Gilliam、Karp、Kato、山东分离株用群引物均扩增出481～507 bp的目的片段,Gilliam、Karp、Kato经相应的型引物扩增出了目的片段.山东分离株仅Kawasaki型的分型引物扩增出目的条带,序列分析证实山东分离株与Kawasaki型相似.结论 在国内首次扩增出Gilliam、Karp、Kato三型标准株,山东地区恙虫病东方体分离株为Kawasaki型;山东地区恙虫病东方体与日本的Kawasaki型相似,两者有较近的亲缘关系.
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丙型肝炎病毒逆向点杂交基因分型方法的建立及初步应用
目的利用逆向点杂交技术建立丙型肝炎病毒(HCV)基因分型新方法.方法在HCV 5'端非编码区(5'UTR)设计引物与分型探针,将活性氨基标记的分型探针依次固定在尼龙膜上,制成HCV基因分型逆向点杂交检测膜条.分离纯化血清中的HCV RNA,经逆转录反应和生物素标记引物聚合酶链反应(PCR)巢式扩增后,将扩增产物与检测膜条杂交,过氧化物酶和四甲基联苯胺显色,判断基因分型结果.后,通过与基因测序结果比较确定新方法的有效性.从佛山地区丙型肝炎患者中随机抽取60份经荧光定量PCR方法对HCV RNA进行过定量分析的血清,用新建方法进行HCV基因分型检测.结果新建HCV逆向点杂交基因分型方法可对所有60份HCV RNA拷贝数在102～106/ml之间的抽检血清进行基因分型,发现1b型50例,占83.3%;1a型2例,占3.3%;2a型2例,占3.3%;1a、1b混合型5例,占8.0%;1b、2a混合型1例,占1.7%;未发现2b、3a和3b型.新方法基因分型结果与测序分型结果一致.结论 PCR-逆向点杂交技术可以准确有效和简便经济地进行HCV基因分型,适用于临床检测与流行病学研究.在佛山地区人群中感染的HCV以1b型为主.
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江苏省宜兴地区丙型肝炎病毒基因分型研究
目的了解江苏省宜兴地区丙型肝炎病毒(HCV)基因型分布特征和病毒变异情况.方法对宜兴市人民医院收治的158例HCV抗体阳性患者血清进行HCV RNA检测,对阳性标本进行Simmonds分型,采用5'非编码区(5'NCR)1、2、3、1b型特异性引物进行PCR扩增,并对1b型和2型各1株的PCR产物测序验证.分析不同性别、临床类型的丙型肝炎患者基因型分布差异.结果158份血清中,有95份为HCV RNA阳性,其中1b型80份(84.2%),2型5份(5.3%),1b/2型的混合感染5份(5.3%),不能分型的5份(5.3%),1b型的序列与GenBank J4株的同源性为99.2%,2型与GenBank J-6株的同源性为97.7%.男性和女性在基因型总体分布上存在差异(P＜0.05),并且在单一型感染和混合型感染的分布上差异亦有统计学意义,不同临床类型的丙型肝炎中HCV基因型分布未显示差异.结论江苏省宜兴地区HCV以1b型为主,男女患者HCV基因型分布差异有统计学意义,而不同临床类型的HCV基因型分布无显著差异,基本反映了本地区HCV感染的特点.
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长春地区乙型肝炎病毒基因分型与肝病发病关系的研究
目的 了解长春地区乙型肝炎(乙肝)患者基因型特点及与肝炎严重程度、疾病转归的关系,以指导临床对疾病进展的判断和指导临床用药.方法 选择216例乙肝病毒(HBV)阳性肝炎患者,年龄33～87岁,平均(60.5±11.4)岁.病变程度的判断根据2000年<病毒性肝炎防治方案>中的诊断标准.应用巢式聚合酶链反应方法(nPCR)扩增HBV S基因组序列,用第二轮PCR产物直接进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析;然后用HBV S基因扩增产物采用Sanger双脱氧链终止法进行DNA测序,将所得到的核苷酸序列及推测的相应氨基酸序列通过DNASIS软件处理,并与GenBank中已发表的HBV中国株及国外株进行同源性比较以确定HBV的基因型,证明用S基因序列的RFLP法HBV分型结果与用全基因组序列的基因分析是一致的.表明S基因序列RFLP法的基因分型结果与S基因测序分型结果是一致的.结果 216例HBV DNA阳性标本中单基因型分别检测出A、B、C、D四种,其中单基因型中A型有1例(0.46%),B型有19例(8.8%),C型有175例(81.02%),D型有21例(9.72%).86例HBV DNA阳性住院患者标本中,C型为感染的主要基因型,69例(80.23%).B型次之,9例(10.47%).6例原发性肝癌均为C型;20例肝炎后肝硬化的患者中有17例(85.0%)为C型.结论 长春地区HBV基因型仍以C型为主(81.02%),B、D型次之(分别是8.8%和9.72%).同时结果显示长春地区HBV感染有基因多样性趋势,表现在检测出了A单基因型.肝癌、肝硬化与C基因型HBV的相关性大.C基因型HBV DNA拷贝数较非C基因型高,提示与HBVDNA在C型患者体内长期存在有关.HBV病毒载量与肝脏病变严重程度的关系无统计学意义.
关键词： 乙型肝炎病毒 基因分型 限制性片段长度多态性 -
间隔区寡核苷酸分型和多位点可变数量串联重复序列分析在结核分枝杆菌基因分型中的应用
目的 评价间隔区寡核苷酸分型(Spoligotypmg)及多位点可变数量串联重复序列分析(MLVA)方法在结核分枝杆菌基因分型研究中的应用.方法 收集224株结核分枝杆菌临床分离株,分别采用Spoligotyping及MLVA方法进行基因分型,比较两种方法的分型效果,评价两种方法在结核分枝杆菌基因分型中的应用.结果 使用Spoligotyping方法,224株结核分枝杆菌呈现出55种基因型,39株具有独特的基因型,其余185株菌呈现出16种基因型;使用MLVA方法时,224株结核分枝杆菌呈现出160种基因型,132株具有独特的基因型,余下的92株菌呈现出28种基因型;当两种方法联合使用时,224株结核分枝杆菌呈现出179种基因型,159株结核分枝杆菌具有独特的基因型,余下的65株菌表现为20种基因型.湖南省和安徽省的菌株中北京家族菌株所占的比例差异有统计学意义(P＜0.001),安徽省北京家族菌株所占的比例明显高于湖南省.结论 MLVA在结核分枝杆菌株水平的鉴定方面,其分辨能力高于Spoligotyping,但是Spoligotyping在鉴定北京家族菌株和M.bovis方面有一定的优势.将Spoligotyping方法作为一线分型技术,MLVA作为二线分型技术联合应用时,将提高结核病的流行病学调查和病原学监测效果.不同地区的菌株有不同的特点.
关键词： 结核分枝杆菌 间隔区寡核苷酸分型 可变数量串联重复序列 基因分型 -
13个VNTR位点用于113株结核分支杆菌的基因分型研究
目的 应用数目可变串联重复序列(VNTR)分子分型技术,对北京地区113株肺结核临床分离菌株进行分型研究,探讨北京地区菌株DNA多态性和基因型特征.方法 采用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术对结核分支杆菌13个VNTR位点进行检测,并应用Gel-Pro analyzer 3.1软件和BioNumerics 3.0软件进行结果分析.结果 113株结核分支杆菌可分为4个基因型(分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ和V型),其中Ⅰ型占92.0%(104/113),其他3型所占比例很小,分别为Ⅱ型占4.4%(5/113),Ⅳ和V型均为1.8%(2/113),而标准菌株H37Rv在分型中为独立的一个基因型,即Ⅲ型.结论 北京地区的结核分支杆菌存在基因多态性,其主要流行型为Ⅰ型.
关键词： 结核分支杆菌 基因分型 聚类分析 数目可变串联重复序列技术 -
50株麻风菌基因分型的初步研究
目的了解中国麻风菌基因分型图谱,以选择合适麻风病流行病学研究的基因位点.方法从云南省文山州的37例、其他省市的13例麻风患者的皮损活检中,提取麻风菌DNA.以麻风菌基因组内的可变数目的串联重复序列(VNTR)为基因分型的基础,对11个位点进行聚合酶链反应,确定其重复序列的拷贝数.结果中国麻风菌株在GGT5、12-5、21-3、23-3位点的同一性高达100%;12-5位点仅表现为3个拷贝;AC8、18-8、27-5、rpoT的同一性分别达97%、94%、97%、85%;GTA9、6-7、AC9位点有非常明显的多样性,但GTA9的多样性与其他国家不同.结论中国麻风菌株多数位点的基因型与印度、菲律宾的菌株一致,提示中国麻风菌株与印度和菲律宾的菌株相近;12-5位点可作为区别中国与周边国家麻风菌株基因分型的标记物;VNTR基因分型方法可应用于麻风病传播链和分布的流行病学研究.
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上海市2000-2002年91株结核分枝杆菌分子流行病学分析
目的探讨上海地区结核病分子流行病学特点.方法对从上海市疾病预防控制中心菌株库中随机抽取的2000-2002年各50株耐药和敏感菌株进行间隔区寡核苷酸分型(Spoligotypmg)和分枝杆菌散在分布重复单位(MIRU)基因型分型,并结合流行病学资料进行分析.结果抽样菌株中,具有特异Spoligotyping指纹图谱的北京基因型菌株在上海地区分布达89%(81/91).未接种过卡介苗(BCG)的患者中北京基因型菌株占88.5%(54/61),接种过BCG的患者中北京基因型菌株占90%(27/30),差异无统计学意义.北京基因型菌株耐药率为45.7%(37/81),低于非北京基因型菌株的耐药率60.0%(6/10),差异无统计学意义.MIRU成簇菌株占所有菌株的62.6%(57/91).结论北京基因型菌株在上海地区有广泛分布,北京基因型菌株与BCG接种和耐药无关,结核病患者中有部分是由于近期传播而引起的.
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利用串联重复序列研究炭疽芽胞杆菌的基因分型
目的 应用基因组中多位点串联重复序列遗传标记对不同地区88株炭疽芽胞杆菌进行基因分型.方法 炭疽芽胞杆菌染色体DNA基因组中存在着串联重复序列.在串联重复序列两侧设计引物,PCR扩增,琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳,凝胶影像分析软件对PCR扩增产物碱基含量进行测算,并与测序结果进行比较,计算出串联重复拷贝数,对拷贝数进行聚类分析.结果 (1)聚类分析发现,88株菌株可分为三大群,45个基因型,基因型与生态环境存在一定的关系.就某一地区炭疽暴发而言,其可变数目串联重复序列遗传标记具有相似性.(2)研究发现,A16R疫苗株作为中国的疫苗株具有代表性.结论 炭疽芽胞杆菌基因组中的串联重复序列具有遗传稳定性和特异性,可作为炭疽芽胞杆菌基因分型的指标,在炭疽暴发和生物恐怖事件中的病原体溯源上具有重要的意义.
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不同基因型丙型肝炎病毒混合感染者体内丙型肝炎病毒基因型和序列的分布
应用套式PCR从一例维吾尔族丙型肝炎病毒(HCV)感染者血清[职业献血员,有多次献血史,无自觉肝炎症状,抗-HCV(+),PCR基因分型为Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ混合型]中,扩增出C区部分基因片段(357bp),将其克隆于T载体中进行基因型分析,并对不同基因型的C区片段进行序列测定.
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黑龙江地区丙型肝炎病毒的基因分型与临床关系的探讨
为探讨黑龙江地区丙型肝炎病毒(HCV)基因型与临床病情程度的相关性,我们对113例各型丙肝病人的HCV RNA(+)血清进行了基因分型检测.
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60例丙型肝炎患者血清丙型肝炎病毒RNA的基因分析
丙型肝炎(丙肝)病毒(HCV)全基因或片段基因克隆的序列分析,据国内外报道证实至少存在12种基因型,不同国家地区核苷酸有很大差异.目前日本和美国已分离出4种基因型,美国以Ⅰ型为主,日本以Ⅱ型为主,中国是Ⅱ、Ⅲ型,其次是Ⅱ/Ⅲ混合型.不同基因型的HCV致病性及对干扰素治疗反应不同.我们对克拉玛依地区慢性丙肝患者血清HCV RNA进行基因分型的检测,了解该地区HCV基因型分布情况,指导治疗及判断预后.
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湖南省2006年肾综合征出血热病原学监测研究
目的 了解湖南省啮齿动物中汉坦病毒带病毒率、基因型别和分布.方法 采用直接免疫荧光(DFA)法检测鼠肺汉坦病毒抗原,从汉坦病毒阳性鼠肺标本中提取病毒RNA,应用汉坦病毒型特异性引物进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增、核苷酸序列测定以及基因分型和同源性分析.结果 总鼠密度为3.15%,鼠带病毒率为1.31%,在室内捕获的7只褐家鼠、黑线姬鼠、小家鼠、黄胸鼠鼠肺标本中均发现携带SEO型病毒,在室外捕获的1只黑线姬鼠鼠肺标本则携带HTN型病毒.成功对6份阳性PCR产物进行了序列分析,浏阳市1、2、4、6号标本同源性较高为100%,邵东市的7、8号标本同源性也较高为100%,但两地区间的同源性差异为89.3%,L99株与浏阳分离株的同源性为94.4%,与邵东分离株的同源性为88.3%.结论 湖南省汉坦病毒存在HTN和SEO型,以SEO型为主.
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陕西省麻疹高接种率和高发病率的原因分析
目的 探讨陕西省麻疹高接种率下高发病率的病原学和疫苗免疫相关因素.方法 分析麻疹病例年龄及免疫史.从咽拭子中分离病毒,用酚-氯仿抽提法提取病毒RNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增N基因-COOH端的450个核苷酸(bp)片段,进行序列测定和基因分型.用微量中和试验测定疫苗免疫血清及麻疹病例急性期血清中和疫苗株和野毒株的抗体水平.结果 麻疹病例中有麻疹疫苗免疫史的平均占38.97%;麻疹病例急性期血清:有免疫史的中和S191株GMT(56.18)明显高于H1野毒株GMT(26.90);无免疫史的S191株GMT(25.40)与H1野毒株(27.86)相近.疫苗免疫血清:S191株抗体效价≤16血清中有19.15%为H1野毒株抗体阴性.结论 陕西省近年出现的麻疹高接种率水平下的高发病率现象不排除麻疹流行株变异和疫苗对流行株H1基因组野毒株保护性不足两方面因素.
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浙江省温州市啮齿动物中汉坦病毒的分子流行病学研究
目的 研究浙江省温州市啮齿动物中汉坦病毒(HV)流行情况及病毒型别,为该地区肾综合征出血热(HFRS)的预防控制提供科学依据.方法 采用间接免疫荧光法(IFA)检测鼠肺中HV抗原;用RT-PCR法扩增阳性样品中HV的部分S片段及部分M片段;构建系统发生树进行系统发生分析及分型.结果在温州市HFRS疫区共捕获啮齿动物96只,在6份鼠肺样品中检测到HV抗原,其中4只褐家鼠,1只黄胸鼠与1只黄毛鼠,病毒携带率为6.3%.用汉城病毒(SEOV)特异引物从其中5份HV抗原阳性样品中扩增出部分S片段(620～999nt)及部分M片段(2001～2301nt)并测定序列.对扩增出的部分S及M片段的核苷酸序列分析发现,5株病毒与现有的SEOV有高同源性,均为汉城型HV.但在用部分S片段及部分M片段核苷酸序列所构建的系统进化树上,5株病毒的聚集模式不同.结论温州市的褐家鼠、黄胸鼠、黄毛鼠均携带汉城型HV,并可能发生基因片段的重排.
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对分子流行病学发展之拙见
近年来,随着分子生物学的迅速发展,蛋白质、核酸等先进检测技术已在医学研究中被广泛应用,不少医学界同仁正试图应用这些先进技术解决流行病的诸多问题,例如通过对分子、基因的研究,来发现和认识因病原体变异而引起相应疾病在人群中的新特征;从变异研究到基因预防以及通过基因分型以判断可能的传染源、传播途径等,这不仅是一个良好的开端,而且令人欣慰的是,这些研究均已取得了初步成果,尤以在传染病研究方面的成绩更为显著.
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中国27省(市、自治区)2009-2013年门诊腹泻病例诺如病毒流行特征分析
目的 了解我国门诊腹泻患者中诺如病毒的流行特征.方法 在国内27个省(市、自治区)173家医院的门/急诊中开展腹泻监测,收集腹泻病例临床和流行病学资料,同时采集病例粪便标本,送58家网络实验室采用RT-PCR检测诺如病毒,并分析2009-2013年不同地区、人群以及时间的诺如病毒检出率.结果 在34 031名腹泻监测病例中,有11.6％的病例检出诺如病毒.其中6 ～ 23月龄儿童和＞45岁人群的检出率高,分别为13.7％和12.4％.一年中以秋、冬季检出率较高;中温带和暖温带地区,诺如病毒在冬季检出率高,分别为10.7％和11.6％;而亚热带地区,以秋季检出率高(14.3％).诺如病毒检出的主要型别为GⅡ组(89.9％).结论 诺如病毒对我国各年龄组人群均有不同程度的影响,尤其在儿童和中老年门诊腹泻病例中较为常见,并呈现明显的季节性流行特征,且不同气候带地区的流行高峰存在差异.
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深圳市鼠类感染汉坦病毒的分子特征
目的 了解深圳市宿主动物携带汉坦病毒状况、病毒型别及分子特征.方法 笼日法捕鼠,计算鼠密度,确定鼠种构成.共捕获宿主动物472只,褐家鼠为优势鼠种,占87.29%.免疫荧光抗原阳性鼠肺标本中提取病毒RNA,应用汉坦病毒型特异性引物进行逆转录.套式PCR扩增M片段基因和核苷酸序列测定,对汉坦病毒进行基因分型和同源性分析.结果 21只来自我市不同区褐家鼠的鼠肺标本中均发现携带汉城型病毒,汉坦病毒M片段核苷酸同源性高达95.4%以上,属于同一亚型.系统进化树显示它们可以分为6个小进化分支,与SZ2083进化关系相对近.但发现来源于地理位置较近的病毒株并没有显示出较高的基因组核苷酸序列的同源性,反而相隔较远的病毒株呈现出一致性.结论 深圳市汉坦病毒的主要宿主动物是褐家鼠,携带的汉城型汉坦病毒之间的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列同源性较高,但也存在一定的差异.这种差异形成的原因有待进一步研究.
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2012-2014年广东省哨点医院诺如病毒GII.4 Sydney变异株流行状况及暴发疫情特征分析
目的：分析2012年1月至2014年6月广东省哨点医院诺如病毒GII.4 Sydney变异株流行状况，以及由诺如病毒GII.4 Sydney变异株感染引起的暴发疫情特征。方法2012年1月至2014年6月在广东省选取22家医院的门诊科室为监测哨点，将采集的腹泻病例粪便样本（共10750份）送至市级CDC，进行病毒核酸提取及诺如病毒核酸检测，所有阳性样本递送至广东省CDC，并按照随机数字法抽取了855份进行诺如病毒基因分型，共成功测序样本690份。采用χ2检验比较不同年龄组、不同时期内腹泻病例诺如病毒感染情况。通过广东省突发公共卫生事件管理信息系统，收集2012年1月至2014年6月广东省13起由诺如病毒GII.4 Sydney变异株感染引起的社区暴发疫情数据，进行社区流行病学分析。结果2012年8月首次检出诺如病毒GII.4 Sydney变异株，2012年11月检出比例为13/15。2012年11月至2013年1月（T1时期），各月份中腹泻病例诺如病毒感染阳性率分别为23.8%（100/421）、15.9%（61/383）、19.2%（95/495），2013年11月至2014年1月（T2时期），各月份中腹泻病例诺如病毒感染阳性率分别为17.0%（90/529）、8.7%（37/426）、11.2%（46/409），均低于T1时期（χ2值分别为6.65、9.93、10.74，P值分别为0.010、0.002、0.001）。T1时期内≥15、<15岁组腹泻病例诺如病毒感染阳性率分别为26.3%（143/543）、14.9%（113/756）（χ2=25.90，P<0.001）；T2时期≥15、<15岁组阳性率分别为10.1%（52/516）、14.3%（121/848）（χ2=5.09，P=0.024）。13起暴发疫情中，食源性传播占10/13。结论广东省2012年8月首次检出诺如病毒GII.4 Sydney变异株，2012年11月起呈现社区流行，流行1年后，强度降低；由诺如病毒GII.4 Sydney变异株引起的暴发疫情主要以食源性传播为主。
