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白癜风皮损中角质形成细胞分化及稳态的研究
目的 研究白癜风皮损由于黑色缺失对角质形成细胞分化及稳态的影响.方法 2010年8月—2016年2月镇江市第四人民医院白癜风患者的组织标本蜡块16例,并取8例正常皮肤作对照.免疫组化染色识别HMB45、Ki67、K15和FHL2蛋白,并以IPP6.0专业图像分析系统定量分析阳性表达的强弱,并经统计学分析.结果 正常皮肤基底层HMB45阳性表达,白癜风皮损表达阴性;白癜风组K15表达值为(0.1267±0.0514),正常皮肤组K15为(0.1263±0.0172),两组之间差异无统计学意义(P>0.05);白癜风组ki67表达值为(0.1075±0.0802),正常皮肤组ki67为(0.0608±0.0483),Ki67在白癜风皮损表达高于正常皮肤(P<0.05);白癜风组FHL2表达值为(0.2905±0.0332),正常皮肤组FHL2为(0.1428±0.0341),FHL2在白癜风皮损表达高于正常皮肤色素(P<0.05).结论 白癜风皮损存在黑素缺失、角质形成细胞增殖能力增强,但分化无影响.FHL2在白癜风皮损中高表达,可能和残留黑素细胞酪氨酸酶活性的抑制有关.
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GST-FHL2融合蛋白的表达及纯化
目的 高效表达和纯化可溶性GST-FHL2融合蛋白.方法 (1)PCR法扩增FHL2(Four and a half LIM domains 2)基因的编码片段,分别在5'端和3'端加上EeoR I和Xho l酶切位点,并克隆进入原核表达载体pGEX-4T-1;(2)利用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导重组质粒pGEX-4T-1-FHL2在大肠杆菌BL21(DE3)中表达同时带有谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签的融合蛋白;(3)超声法裂解大肠杆菌,应用谷胱苷肽琼脂糖树脂纯化可溶的GST-FHL2融合蛋白;(4)通过SDS-PAGE和Western blot验证GST-FHL2的表达.结果 (1)成功构建pGEX-4t-l-FHL2重组质粒,测序结果证明FHL2与载体的GST在同一读框;(2)0.1 mmol/L的IPTG在23℃的条件下能诱导可溶性GST-FHL2融合蛋白高效表达;(3)在Western blot分析中,GST-FHL2能被鼠抗GST单克隆抗体特异性识别,条带所在位置和GST-FHL2的分子量相符.结论 正确构建pGEX-4T-1-FHL2重组质粒,在大肠杆菌BL21中高效表达GST-FHL2融合蛋白,经谷胱苷肽琼脂糖树脂纯化得到高纯度的可溶性GST-FHL2融合蛋白.
关键词： FHL2 谷胱甘肽-S-转移酶 融合蛋白 原核表达 纯化 -
FHL2抑制乳腺癌MCT-7细胞增殖与侵袭生长的机制探讨
目的探讨FHL2对分化抑制蛋白1(Id1)的转录调控活性及Id1促乳腺癌细胞侵袭生长效应的影响.方法采用共转染双荧光素酶相对活性检测方法检测乳腺癌MCF-7细胞中FHL2对Id1介导的转录抑制功能的影响,MTT方法检测细胞的增殖能力,Transwell方法观察细胞的侵袭能力.结果 Id1对碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子E47介导的转录激活功能具有显著抑制作用,而FHL2明显削弱了该效应,并呈现出对FHL2转染剂量的依赖性;与空载体转染组比较.Id1明显促进了MCF-7细胞的增殖速率与侵袭能力,而该效应可被FHL2显著削弱(P<0.05).结论 FHL2可通过抑制Id1的功能活性来抑制乳腺癌细胞的增殖及侵袭生长,为深入研究FHL2-Id1信号途径在乳腺癌发生发展中的功能效应奠定了基础.
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BRCA1对FHL2转录激活功能的影响
目的:进一步了解乳癌易感基因BRCA1与FHL2相互作用对FHL2转录激活功能的影响,为揭示BRCA1在肿瘤发生发展中的作用提供依据.方法:将BRCA1 C端缺失突变体BRCA1(△1443～1863 aa)和BRCA1 (△908～1863 aa)按正确读框插入到pCR3载体中,并在293T细胞中表达.利用GAL4荧光素酶报告基因检测野生型BRCA1以及肿瘤易感突变体BRCA1(P1749R),BRCA1(Y1853insA),BRCA1(△1443～1863 aa)和BRCA1(△908～1863 aa)对FHL2转录激活活性的调节作用.结果:野生型BRCA1能增强FHL2转录激活活性,且具有剂量依赖性.而4种肿瘤易感突变体增强FHL2转录激活活性的能力明显减弱.结论: BRCA1与FHL2相互作用可能对基因转录调节以及肿瘤发生、发展中起着重要作用.
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FHL2蛋白的研究进展
FHL蛋白是分子结构中仅含有4个半LIM结构域的蛋白质家族,人类FHL蛋白有4个成员:FHL1、FHL2、FHL3及ACT.它们通过LIM结构域与某些结构蛋白、激酶、转录调控因子等多种蛋白质相互作用,对某些基因的表达、细胞分化与发育、细胞骨架形成等发挥重要调控作用.FHL2是其中研究深入的成员.本文介绍FHL2的结构特征、组织和细胞中的分布、FHL2与其他蛋白之间的相互作用、生物学功能,以及在肿瘤和其他疾病的发生和发展中的作用等方面的研究进展.
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FHL2调控Id2功能活性的研究
目的:探讨FHL2对Id2蛋白功能的调控效应.方法:将E47、 5xE-Box-Luc、 pRL-SV40、 Id2以及FHL2表达载体分别共转染MCF-7、 293T以及SH-SY5Y细胞,双荧光素酶报告基因方法检测不同转染组细胞中的相对荧光素酶活性.结果:三个细胞系中E47均显著上调了报告基因的表达, Id2抑制了E47的转录激活活性,而FHL2通过与Id2相互作用显著消弱了Id2对E47功能的抑制效应.结论:通过相互作用FHL2抑制了Id2蛋白的功能活性,FHL2是一个新的Id2蛋白功能抑制子.
关键词： FHL2 Id2 蛋白质相互作用域和基序 阻遏蛋白质类 -
FHL2与Id蛋白相互作用的表位分析
目的: 鉴定FHL2与Id家族蛋白成员之间的相互作用及分子表位.方法: GST-pulldown方法检测.结果: FHL2与Id家族的4个成员蛋白均存在直接的相互作用关系,FHL2蛋白中的第二个LIM结构域在FHL2/Id相互作用中是必需的,Id蛋白N端结构区域在介导FHL2/Id相互作用中是必需的.结论: FHL2是一个新识别的Id蛋白广谱相互作用因子,FHL2可能参与Id介导的多种生物学效应以及肿瘤发生与进展.
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FHL2蛋白生物学功能的探讨
FHL蛋白结构均含有4个半LIM结构,它可以通过不同的LIM结构域与其他蛋白质结合,激活或抑制转录因子的活性,激发不同的胞内信号途径,影响肿瘤的发生和发展.人类FHL蛋白家族有4个成员:FHL1、FHL2、FHL3及ACT,其中对于FHL2的研究较为深入.FHL2早在人心肌细胞中被发现,主要存在于细胞核并能穿梭于细胞核和细胞质之间,能与多种蛋白质发生作用,是蛋白质结构网中的重要成员.
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FHL2沉默对骨肉瘤U20S细胞增殖与凋亡的影响
目的探讨沉默FHL2表达对骨肉瘤U20S细胞的增殖和凋亡的影响及其相关机制的研究.方法通过构建FHL2的shRNA干扰载体pLKO.1,制备慢病毒并感染U20S细胞,分为ShFHL2目的基因干扰组(shFHL2)和无关序列对照组(SCR);感染96 h后采用实时定量PCR(QPCR)和Western blotting检测两组FHL2 mRNA和蛋白水平.采用MTT方法检测细胞增殖,流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期的变化,Western blotting检测FHL2干扰后U20S细胞相关信号通路的蛋白表达变化.利用双荧光素酶报告基因系统检测FHL2对P53下游基因转录调控的影响.结果与SCR组比较,shFHL2组感染96 h后FHL2 mRNA和蛋白水平均降低(P<0.05) . shFHL2组感染24、48、72、96 h的细胞增殖比分别为1.73±0.08、2.49±0.38、3.26±0.45和4.28±0.29,其中96h的细胞增殖比低于SCR组(P<0.05) ;shFHL2组感染96 h的细胞凋亡率为(17.55±1.05)％,高于SCR组的(7.73±1.12)％,差异有统计学意义(P<0.05);shFHL2组感染96 h的期细胞为(68.18±0.78)％,高于SCR组的(59.73±2.28)％,差异有统计学意义(P<0.05).干扰FHL2表达能够显著上调P53、P21和Bax的表达水平并能增强p53对Bax启动子的促转录活性.结论沉默FHL2表达可明显抑制骨肉瘤U20S细胞增殖并促进细胞凋亡,使细胞阻滞于G0/G1期;FHL2介导了 P53对Bax启动子的转录调节作用.FHL2可能会成为新的肿瘤治疗靶点,其机制与p53/Bax和p53/p21通路相关.
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FHL2蛋白与心脏Kv1.5钾通道相互作用的研究
目的 目前认为KCNA5通道蛋白是治疗房颤的一个理想靶点,文中旨在验证FHL2蛋白与KCNA5基因编码的心脏Kv1.5钾通道是否存在相互作用.方法 ①质粒构建:应用PCR法构建质粒pcDNA3.1/myc-His C-KCNA5和pcDNA3.0-FHL2;②基因转染:应用Lipofectamine 2000将pcDNA3.1/myc-His C-KCNA5质粒和pcDNA3.0-FHL2质粒共转染HEK293细胞;③免疫共沉淀:应用抗FHL2抗体和Protein A/G Plus-Agarose沉淀目的 蛋白,应用抗Myc抗体进行Western blot分析;④免疫荧光细胞化学分析:应用抗FHL2一抗和标记有FITC的二抗检测FHL2蛋白,应用抗Myc一抗和标记有Cy3的二抗检测KCNA5-Myc融合蛋白.结果 ①酶切和测序结果表明质粒pcDNA3.1/myc-His C-KCNA5和pcDNA3.0-FHL2构建正确;②抗FHL2抗体能够将KCNA5从总蛋白中沉淀下来;③KCNA5蛋白和FHL2蛋白共定位于细胞膜上.结论 初步证实FHL2蛋白与KCNA5蛋白存在相互作用.
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心肌肥厚大鼠FHL2的表达水平变化研究
目的 研究大鼠心肌肥厚时FHL2表达水平的变化,探讨FHL2对心肌肥厚调控的作用.方法将雄性SD大鼠20只,随机分成腹主动脉缩窄组( AAC组)和假手术组( Sham组),每组10只,AAC组通过U型银夹缩窄腹主动脉的方法建立左室心肌肥厚模型,Sham组进行相同的手术步骤但未缩窄腹主动脉;术后6周,经胸心脏彩超测定心脏形态和心功能后以颈椎脱臼法处死,分离大鼠心脏记录形态学参数并通过 HE染色和Masson染色观察心脏形态和纤维化程度;提取所有心肌组织总蛋白和总RNA,采用Western blot技术、实时定量PCR技术分析FHL2在两组大鼠心肌组织中的蛋白和 mRNA表达水平.结果 术后6 周,心脏超声结果显示ACC组心肌较Sham组明显肥厚(P＜0.05);与Sham组相比,AAC组大鼠心肌组织明显增厚,差异有统计学意义( P ＜0.05);ACC 组 FHL2 蛋白和 mRNA 水平均明显较 Sham 组升高,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 心肌肥厚时FHL2表达水平明显上调;FHL2 可能在心肌肥厚的发生发展过程中发挥重要调节作用.
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AAV介导的FHL2-siRNA对人结肠腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用
目的 探讨FHL2-siRNA对裸鼠体内人结肠腺癌移植瘤的抑制作用.方法 建立裸鼠体内人大肠癌移植瘤动物模型,当移植瘤平均体积约为50 mm3 时,在裸鼠体内进行FHL2-siRNA治疗,观察人大肠癌移植瘤的生长情况和组织形态学改变.结果 裸鼠人大肠癌移植瘤的生长受到明显抑制,siRNA治疗组、siRNA+5FU联合治疗组与对照组比较,siRNA治疗组与siRNA+5FU联合治疗组比较差异具有显著性(P＜0.05).结论 FHL2-siRNA可有效抑制裸鼠体内人大肠癌移植瘤的生长,为大肠癌的基因治疗提供重要的实验依据.
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FHL2基因与肿瘤的关系
我国肿瘤的发病牢呈逐年增高的趋势.目前的治疗手段主要是以手术治疗为主,辅以局部或全身的放疗及化疗等方法均末能使其疗效得到明显的提高.随着分子生物学技术的迅速发展和对肿瘤发病机制认识的不断深入,肿瘤的基因治疗也越来越受到人们的重视.肿瘤分子生物学和分子遗传学的研究表明原癌基凶的激活、抑癌基因的失活和细胞凋亡基因的缺失是许多肿瘤的发生机制.FHL2是一种适应蛋白,能与其他多种癌基因产物和蛋白质相互作用,参与调节基因表达,维持细胞结构,介导细胞黏附、细胞运动和信号传导等[1-2].目前认为.FHL2在肿瘤发生发展演化过程以及在肿瘤细胞的分化过程中均起重要的作用.本文就FHL2基因与肿瘤的父系作综述如下.
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FHL2抗体的制备及其在癌细胞和组织中表达的检测
目的:制备FHL2特异性的多克隆抗体, 并检测FHL2在癌细胞和组织中的表达.方法:在大肠杆菌中融合表达GST-FHL2蛋白, 纯化后免疫小鼠, 制备多克隆抗体.采用Western blot检测抗体的特异性, 并检测FHL2在乳腺癌细胞、肝癌细胞和小鼠组织中的表达. 结果:获得了可特异识别FHL2, 而不识别FHL家族其他成员的多克隆抗体;FHL2蛋白在乳腺癌和肝癌细胞株中表达;FHL2在心脏、肌组织、乳腺、前列腺和肝脏组织中都有表达.结论:成功地得到可特异识别FHL2的多克隆抗体, 且发现FHL2在癌细胞和更广泛地正常组织中都有表达, 为进一步研究FHL2在凋亡、癌变、分化等生命过程中的功能奠定了基础.
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与HERG钾通道相互作用的FHL2蛋白对该通道功能的调控
目的 筛选与心脏人类果蝇相关基因(HERG)的编码蛋白钾通道存在相互作用的蛋白质,并进一步研究该相互作用蛋白对HERG钾通道的调控作用.方法 ①以带有编码人类心脏HERG钾通道的cDNA为模板,通过PCR方法得到编码人类心脏HERG钾通道氨基末端(404个氨基酸)的DNA片段.将该片段克隆入pGBKT7/载体,构建"诱饵"质粒pGBKT7-HERG-NT.②应用酵母双杂交技术筛选人类心脏cDNA文库.③以PCR法扩增4个半LIM结构域(FHL2)基因的开放读框片段(ORF),并克隆入pcDNA3.0载体.④以pcDNA3.0-herg转染HEK293细胞,应用G418筛选得到HEK293/HERG细胞株.以pcDNA3.0-FHL2转染HEK293细胞,筛选得到HEK293/FHL2细胞株后,再将pcDNA3.0-herg转染入该细胞株.⑤应用膜片钳技术,研究FHL2对HERG通道功能的影响.结果 ①用酵母双杂交技术筛选得到37个阳性克隆,其中含有表达FHL2蛋白的克隆.②膜片钳检测发现.FHL2蛋白在增加HERG电流幅度的同时并调节其激活过程.结论 FHL2蛋白能与HERG氨基末端相互作用而影响HERG钾通道的功能.
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FHL2对心脏钾离子通道调控的研究进展
FHL2蛋白是分子结构中仅含有4个半LIM结构域的蛋白质家族成员.LIM结构域是蛋白质——蛋白质相互作用的主要结构之一,可与多种蛋白结合成复合物发挥生物学功能.研究发现,FHL2能与多种蛋白质相互作用,如受体蛋白、结构蛋白、转录因子、信号转导蛋白及代谢酶类等.FHL2对某些基因的表达发挥调控作用.新近研究发现,FHL2蛋白参与了一些心脏钾离子通道的调控.本文就FHL2的结构特点、分布表达及其参与心脏钾离子通道调控的研究进展做一综述.
关键词： FHL2 蛋白质-蛋白质相互作用 转录调控 钾离子通道 -
BRCA2与LIM结构域蛋白FHL2的相互作用
目的: 应用酵母双杂交方法筛选BRCA2相互作用蛋白编码基因,验证其相互作用并研究其功能联系. 方法: 以BRCA2基因 3′端片段构建酵母双杂交质粒,筛选正常人乳腺上皮细胞cDNA文库,获得编码相互作用蛋白的基因,采用免疫共沉淀、哺乳细胞双杂交和荧光酶测定等方法进一步验证蛋白间相互作用和功能联系. 结果: 采用酵母双杂交系统筛选,获得了多个编码BRCA2相互作用蛋白的基因,其中包括已知的FHL2蛋白;免疫共沉淀和哺乳动物细胞双杂交试验显示BRCA2和FHL2在体内特异性结合,并证实FHL2在体内形成同源二聚体;转录活性分析发现BRCA2与FHL2有协同转录激活作用. 结论: 发现BRCA2与FHL2蛋白间相互作用和功能联系,为BRCA2功能研究提供了新的方向.
