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肿瘤坏死因子α诱导PERK-eIF2α介导的未折叠蛋白反应
目的 研究肿瘤坏死因子α(TNFα)对小鼠纤维母细胞(L929)中elF2α磷酸化及ATF4、CHOP表达的影响,探讨TNFα信号传导通路与内质网应激的相关性.方法 用TNFα作用于L929细胞0、2、4、6、8和10 h.以WesternBlot检测elF2α磷酸化和CHOP的表达;以Northern Blot检测ATF4mRNA的表达.结果 TNFα对L929细胞的杀伤作用呈时间依赖性,TNFα作用于L929细胞可以引起eIF2α磷酸化的增高、CHOP蛋白及ATF4mRNA表达的升高;且CHOP、ATF4表达的升高均发生在TNFα作用的早期(4 h达到高峰).结论 TNFα作用于L929细胞引起的内质网应激,可以通过激活未折叠蛋白反应的PERK-elF2α途经来缓解TNFα对肿瘤细胞的杀伤作用.
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ATF4基因在小鼠胚胎围着床期子宫内膜的表达
目的 探讨转录激活因子4(ATF4)在小鼠胚胎围着床期子宫内膜中的表达规律及在胚胎植入过程中的作用.方法 妊娠0～7d小鼠子宫内膜,用RT-PCR、免疫组织化学法和Western blot分别检测小鼠内膜ATF4 mRNA及蛋白的表达；用子宫角内注射ATF4抗体进行干预.结果 1)妊娠各组小鼠子宫内膜ATF4 mRNA的表达量均显著高于未孕组d0(P ＜0.0S),且随妊娠天数的增加其表达量逐渐增高,到d4达到峰值,之后逐渐下降；2)ATF4蛋白主要在基质细胞胞质表达,其表达规律与mRNA表达规律基本一致.3)子宫角ATF4抗体注射后与对照组相比着床数明显减少.结论 ATF4在小鼠妊娠早期可能参与子宫内膜蜕膜化过程,有利于着床.
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ATF4重组慢病毒抑制C2C12细胞增殖并促凋亡
目的 构建人活性转录因子4(ATF4)慢病毒,探讨C2C12细胞成骨分化过程中ATF4基因慢病毒修饰对其增殖和凋亡的影响.方法 构建ATF4重组慢病毒载体质粒,然后与2个包装质粒共转入293T细胞中包装成ATF4慢病毒(LV-ATF4);用病毒感染C2C12细胞,并用流式细胞仪(FCM)检测BMP2诱导C2C12细胞分化时对其增殖凋亡的影响,免疫印迹法检测凋亡相关蛋白的表达,电子显微镜观察凋亡细胞的形态学结构变化.结果 成功构建和包装了ATF4重组慢病毒.FCM检测结果表明,BMP2+ LV-ATF4处理组S期细胞(14.89％)低于BMP2+ LV-GFP组(30.64％) (P ＜0.05);BMP2+ LV-ATF4处理组细胞凋亡率(31.06％)高于BMP2+ LV-GFP组(11.39％)(P＜0.05);凋亡相关蛋白的表达与FCM结果一致.结论 在BMP2诱导C2C12细胞成骨分化时,LV-ATT4慢病毒可促进C2C12细胞的凋亡,抑制其增殖.
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慢性阻塞性肺疾病患者肺组织中ATF3与ATF4对γ-GCS表达的影响
目的 探究慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者肺组织中转录活化因子3(ATF3)与转录活化因子4(ATF4)对γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)表达的影响.方法 本研究采用回顾性分析方法,选择2014 ～2016年收治的160例肺部疾病患者作为研究对象,将经胸部X线或CT检查确诊为COPD者列为观察组(80例),将非COPD者列为对照组(80例).观察两组光镜下肺病理形态学改变、肺功能指标和吸烟史.经原位杂交分析两组肺组织中的ATF3、 ATF4、γ-GCS-HS水平,采用免疫组化法检测肺组织中的ATF3、ATF4、γ-GCS-HS蛋白表达,并采用直线相关法,分析肺组织ATF3、ATF4蛋白与γ-GCS-HS表达的相关性及肺组织ATF3、ATF4、γ-GCS-HS蛋白与肺功能之间的关系.结果 经HE法,光镜下可见观察组肺组织标本有病理形态学改变,而对照组无形态学变化;观察组肺功能指标低于对照组(P＜0.05),观察组吸烟史多于对照组(P＜0.05).经原位杂交法检验,观察组中的ATF3、ATF4、γ-GCSHS的mRNA表达水平高于对照组,差弄有统计学意义(P＜0.05).经免疫组化检测,观察组中的ATF3、ATF4、γ-GCS-HS蛋白的表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).经直线相关法分析,ATF3、ATF4蛋白表达与 GCS-HSmRNA及其蛋白呈正相关关系(P＜0.01);ATF3、ATF4、γ-GCS-HS蛋白与肺功能各指标呈正相关关系(P＜0.01).结论COPD患者的ATF3、ATF4表达明显上调可影响调控γ-GCS表达,从而使γ-GCS表达上调,以发挥抗氧化作用.
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左归丸含药血清对骨髓间充质干细胞GPR48、BMP6、ATF4表达影响的实验研究
目的:通过观察左归丸含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞GPR48、BMP6、ATF4的表达影响,研究左归丸治疗骨质疏松症的疗效机制,从而证明中医“肾藏精”理论的科学性.方法:将40只SPF级雌性大鼠按照正常组、左归丸组、诱导液组、阳性药物组骨疏康组、福善美组进行随机分组,并灌胃5d,5d后制备合药血清.运用现代医学实验技术观察左归丸含药血清对骨髓间充质干细胞的影响.结果:通过将左归丸组与正常组和阳性药物组及诱导液组的对比,可以看到该组的蛋白表达水平明显上升.结论:①骨质疏松症的发生与G蛋白偶联受体GPR48密切相关;②中药左归丸极有可能通过G蛋白偶联受体GPR48信号通路,来促使骨髓间充质干细胞向骨细胞分化.
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匹诺塞林对脑缺血再灌注内质网应激凋亡相关基因mRNA表达的影响
目的:观察匹诺塞林对大鼠脑缺血再灌注急性期损伤内质网应激凋亡途径相关基因的调控作用.方法:雄性SD大鼠50只,阻塞大脑中动脉建立脑缺血再灌注模型,随机分为假手术组、模型组、匹诺塞林1 mg/kg组、3 mg/kg组和10 mg/kg组,其中模型组及匹诺塞林各给药组,分别于大脑中动脉阻塞2h后再灌注同时给药,6h后取血并断头取脑,取缺血半暗带组织,实时荧光定量PCR(RT-PCR)法测定GRP78、CHOP、ATF4、XBP-1的mRNA变化.结果:匹诺塞林能增加急性局灶性脑缺血再灌注GRP78 mRNA水平,其中匹诺塞林3 mg/kg、10 mg/组与模型组比较,差异有统计学意义(P ＜0.05或P＜0.01);匹诺塞林能降低内质网应激凋亡相关蛋白CHOP、ATF4,XBP-1mRNA水平,与模型组相比,差异有统计学意义(P ＜0.05或P＜0.01).结论:匹诺塞林能抗脑缺血再灌注损伤,其机制可能与保护内质网功能,减少GRP78、CHOP、ATF4及XBP-1相关基因表达有关.
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益气除痰方调控内质网应激蛋白ATF4、CHOP治疗肺癌机理研究
目的:从内质网应激角度探讨益气除痰方治疗脾虚型肺癌的作用机制.方法:建立脾虚Lewis肺癌小鼠模型,随机分为模型组(生理盐水),化疗组(生理盐水+顺铂注射液1 mg/kg),益气除痰方低、中、高剂量组(2、4、8 g/kg),联合用药组(益气除痰方4 g/kg+顺铂注射液1 mg/kg),每组8只.每3d测量小鼠体重和瘤体大小,14d后处死小鼠,称量瘤重、计算肺表面转移结节数,免疫组织化学法、RT-qPCR法检测肿瘤组织中ATF4、CHOP表达.结果:与模型组比较,益气除痰方中、高剂量组均能明显抑制移植瘤生长,减少肺转移结节数,提高肺转移抑制率(P＜0.01或P＜0.05);并能明显上调内质网应激蛋白ATF4、CHOP表达,其中联合用药组效果好(P＜0.01).与化疗组比较,联合用药组ATF4、CHOP表达明显升高(P＜0.05).结论:益气除痰方可能通过上调内质网应激蛋白ATF4、CHOP的表达介导细胞凋亡,从而发挥抗肿瘤作用.
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栝楼桂枝汤对脑缺血再灌注模型大鼠皮质内质网应激相关因子表达的影响
目的 探讨栝楼桂枝汤对脑缺血再灌注损伤模型大鼠皮质内质网应激相关因子rmRNA表达的影响. 方法 将大鼠随机分为假手术组和造模组,造模组采用线栓法制备大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型,假手术组除不插入线栓外其余操作相同.将造模成功的大鼠随机分为模型组、阳性对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组.低、中、高剂量组分别予不同剂量的栝楼桂枝汤灌胃,阳性对照组给予尼莫地平混悬液灌胃,假手术组和模型组予等量生理盐水灌胃,每日1次,连续干预7d.采用Longa神经学评分法评定大鼠神经功能损伤程度,RT-qPCR法检测大鼠缺血侧皮质组织中葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、转录活化因子4(ATF4)、C/EBP同源蛋白(CHOP)及其B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白-3(Caspase-3)mRNA的表达. 结果 与假手术组比较,模型组神经功能损伤评分及大鼠皮质组织中GRP78、ATF4、CHOP、Caspase-3 mRNA表达明显提高(P＜0.01,P＜0.05),Bcl-2 mRNA表达降低(P＜0.05);与模型组比较,阳性对照组和低、中、高剂量组神经功能损伤评分及大鼠皮质组织中GRP78、ATF4、CHOP、Caspase-3 mRNA表达明显下降(P＜0.01,P＜0.05),Bcl-2mRNA表达提高(P＜0.05). 结论 栝楼桂枝汤对MCAO模型大鼠具有较好的治疗作用,其作用机制可能与调控内质网应激相关因子的表达,降低内质网应激水平有关.
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异氟烷对老年大鼠学习记忆及额叶神经元GRP78、ATF4、CHOP表达的影响
目的 观察异氟烷麻醉后老年大鼠学习记忆能力以及额叶神经元GRP8、ATF4、CHOP的表达变化.方法 雄性SD老龄大鼠随机分为4组,每组15只.ISO组吸入1.5%异氟烷维持麻醉2 h,SAL组腹腔注射Salubrinal(1 mg/kg),ISO+SAL组腹腔注射Salubrinal(1 mg/kg)后吸入1.5%异氟烷维持麻醉2 h,C组只吸入30%空氧混合气.分别在异氟烷麻醉后24 h进行Morris水迷宫实验,测试结束后采集大鼠左侧脑额叶,采用实时荧光定量PCR技术和免疫荧光检测葡萄糖调节蛋白78(78-kDa glucose-regulated protein,GRP78)、活化转录因子4(activating transcription factor 4,ATF4)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)的基因转录水平和蛋白表达的变化.结果 与对照组相比,异氟烷麻醉组逃避潜伏时间延长[ISO组(19.10±2.98)s,C组(10.54±2.05)s],穿越目标次数减少[ISO组(6.78±1.47)次,C组(9.03±1.69)次],差异有统计学意义(均P<0.05).GRP78蛋白表达增多[ISO组(965.8±86.5),C组(247.5 ±46.4)];ATF4蛋白表达增多[ISO组(470±69.39),C组(275.4±56.3)],CHOP蛋白表达增多[ISO组(618.7±83.3),C组(174.5±71.2)],差异有统计学意义(均P<0.05).GRP78、ATF4、CHOP三因子的基因转录情况与其蛋白表达趋势一致.结论 异氟烷麻醉后大鼠短时记忆能力下降,可能与额叶神经元内质网应激途径的激活有关.
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清热化淤方对脑缺血预处理大鼠ATF4、Caspase-12表达的影响
目的 观察清热化淤方对脑缺血预处理大鼠缺血再灌注后ATF4、Caspase-12 mRNA及其蛋白表达的影响.方法 SD大鼠160只,随机分为假手术组(SO)、脑缺血再灌注组(MCAO)、脑缺血预处理组(BIP)、清热化淤方干预组(QRHY)四组,每组按照再缺血后12h、1d、2d、3d四个时间点分为4个亚组.采用二次线栓法制备大鼠局灶性脑缺血预处理模型,用原位杂交法和Western blot法观察再缺血后各个时间点ATF4、Caspase-12 mRNA及其蛋白的表达变化.结果 ①MCAO组12h ATF4mRNA及其蛋白表达均达高峰(P＜0.01),随再灌注时间延长其表达逐渐下降；BIP组较MCAO组ATF4mRNA及其蛋白表达均明显降低(P＜0.05,P＜0.01)；QRHY组较BIP组进一步降低其表达(P ＜0.05,P＜0.01).②MCAO组12 h Caspase-12 mRNA及其蛋白表达均达高峰,随再灌注时间延长其表达逐渐下降(P ＜0.01)；BIP组较MCAO组Caspase-12mRNA及其蛋白表达均明显降低(P＜0.05,P＜0.01)；QRHY组较BIP组进一步降低其表达(P＜0.05,P＜0.01).结论 清热化淤方可通过下调大鼠脑缺血预处理后ATF4、Caspase-12表达发挥其神经保护作用.
关键词： 清热化淤方 缺血预处理 ATF4 Caspase-12 神经保护 -
ATF4对皮肤癌细胞增殖的影响及相关机制
目的：探讨沉默/过表达ATF4对人皮肤癌细胞增殖的影响及其相关作用机制。方法：Western blot技术检测不同类型皮肤癌细胞中ATF4的蛋白表达水平。构建ATF4沉默/过表达的A431皮肤癌细胞株，采用CCK-8法、克隆形成实验和流式细胞术检测A431细胞增殖能力的变化及细胞周期分布；Western blot技术检测细胞周期调控因子cyclin D1、cyclin E、P21和p-Rb/Rb的蛋白表达水平。结果：ATF4在3种不同类型的皮肤癌细胞中均呈高表达。CCK-8法和克隆形成实验结果显示沉默ATF4的A431细胞存活率和增殖能力均显著降低(P<0.05)，而过表达ATF4可促进A431细胞的增殖；流式细胞仪检测结果显示沉默ATF4可明显抑制A431细胞从G0/G1期向S期转换，过表达ATF4则促进其G1/S转换。同时Western blot实验结果显示沉默ATF4后，cyclin D1、cyclin E和p-Rb的蛋白水平均显著降低，而P21的蛋白表达显著增加(P<0.05)，过表达ATF4后则cyclin D1、cyclin E和p-Rb的蛋白水平显著增加，而P21的蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论：ATF4能够促进人皮肤鳞状细胞癌细胞株A431的增殖，其潜在作用机制可能与促进细胞周期G1/S转换及影响相关周期调控因子的表达有关，提示AT F 4可作为治疗皮肤癌的一个潜在作用靶点。
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ATF4在顺铂致肝癌细胞HepG2凋亡中的作用
目的 探讨ATF4在顺铂诱导的肝癌细胞HepG2凋亡中的变化,并对其作用进行初步研究.方法 人肝癌细胞HepG2经不同浓度顺铂处理24和48 h后,MTS法检测细胞活力;Western blot 检测内质网应激反应及凋亡相关蛋白(Bip、 ATF4、PARP、activated-Caspase3、CHOP)表达的变化;使用siRNA干扰技术沉默ATF4 的表达,并观察沉默ATF4蛋白表达后,肝癌细胞对顺铂敏感性的变化;利用Annexin V-FITC 和PI双标法,在倒置荧光显微镜中检测细胞凋亡情况.平板克隆形成实验用于判断单个细胞克隆生长速度.结果 与溶剂对照组相比,顺铂明显抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡;时间和浓度依赖性地引起内质网应激反应相关蛋白CHOP、ATF4表达水平上调,但不影响Bip的蛋白表达;同时导致activated-Caspase3的活化,引起PARP蛋白的切割. 使用siRNA沉默ATF4的蛋白表达后,能部分逆转顺铂引起的细胞凋亡以及克隆形成抑制.结论 顺铂可以通过上调ATF4的表达,触发内质网反应,从而诱导肝癌细胞凋亡.
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ATF4在CCl4和LPS/D-GalN介导小鼠肝损伤中的保护作用
目的 利用小鼠模型对转录激活因子4(ATF4)在肝损伤中的作用进行研究.方法 建立CCl 4慢性肝损伤小鼠模型和LPS/D-GalN急性肝损伤小鼠模型,运用逆转录PCR和Western blot分析比较损伤模型中小鼠肝脏、心脏、肾脏、肺脏组织中的ATF4蛋白及其mRNA水平.采用CRISPR-Cas9技术敲低ATF4后,分析检测两种模型中小鼠血清AST和ALT水平.为进一步探明ATF4的作用,采用内质网应激诱导剂衣霉素处理小鼠,Western blot检测小鼠肝、肺组织中ATF4、磷酸化-eIF2α、总eIF2α和Bip的蛋白水平.RT-PCR检测肝脏XBP1 mRNA的剪接形式(活性形式)和未剪接形式(非活性形式).结果 小鼠肝脏中的ATF4蛋白与其他组织相比异常增高.衣霉素能诱导小鼠体内内质网应激反应(如eIF 2α磷酸化),却引起小鼠肝脏中ATF4蛋白降低.在CCl4慢性肝损伤模型和LPS/D-GalN急性肝损伤小鼠模型中,肝脏ATF4蛋白明显降低.CRISPR-Cas9敲低肝脏ATF4后,两种小鼠模型中的血清AST和ALT进一步升高.结论 ATF4在小鼠肝损伤中起保护作用.
关键词： ATF4 CCl4 LPS/D-GalN 肝损伤 -
利用CRISPR/Cas9技术构建ATF4基因敲除的HepG2细胞株
目的:运用CRISPR/Cas9基因编辑技术,建立ATF4基因敲除的HepG2细胞株.方法:针对ATF4基因作用的功能区域,设计靶向ATF4基因Exon 1(外显子1)和Exon 2(外显子2)的两对gRNA.构建PX459-ATF4-gRNA重组质粒并转化DH5α感受态细胞,筛选出重组子后进行测序,通过测序验证所设计的gRNA的有效性.将PX459-ATF4-gRNA质粒转染到HepG2细胞中,挑选单克隆细胞,提取DNA,进行PCR检测与基因测序,获得敲除ATF4基因的细胞株.通过western blotting检测筛选出来的HepG2细胞ATF4基因的敲除效果.结果:菌落PCR与菌液测序结果显示PX459-ATF4-gRNA载体构建成功;PCR扩增电泳与基因测序检测显示成功构建成了ATF4基因敲除的HepG2细胞;western blotting检测结果显示单克隆2号ATF4蛋白不表达,单克隆3号仍表达ATF4蛋白.结论:成功构建ATF4基因敲除的HepG2细胞,为后续ATF4在肝癌中的作用机制和功能研究奠定基础.
关键词： ATF4 CRSPR/Cas9系统 基因敲除 肝癌 -
内质网应激蛋白ATF4调控STAT3信号通路促进黑色素瘤细胞生长及转移的研究
目的:探索内质网应激蛋白ATF4在黑色素瘤发生发展中的作用和机制.方法:运用荧光定量PCR技术分析对比黑色素瘤细胞系和黑色素细胞系内ATF4表达的差异,运用CCK-8染色以及BrdU染色检测细胞生长及增殖能力,运用Tranwell技术检测细胞转移能力,运用免疫印迹技术检测细胞内STAT3磷酸化水平.结果:ATF4 mRNA在黑色素瘤细胞中的表达水平显著高于黑色素细胞,显示肿瘤细胞中含有更高水平的ATF4 mRNA;在A375细胞中过表达ATF4后,细胞生长增殖速率提高,转移能力增强,而降低内源ATF4后,MM200细胞的增殖速度和转移能力都出现明显降低.同时,A375细胞内ATF4含量的增加也引起了细胞内STAT3磷酸化水平以及细胞内IL-6表达的显著升高.结论:内质网应激蛋白ATF4在黑色素瘤的发生发展中具有重要的调控作用,细胞内ATF4可能是参与调控了IL-6-STAT3信号通路,从而促进黑色素瘤细胞增殖和迁移.
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ATF4与RPL41在宫颈癌中的表达及其临床意义
目的:通过检测宫颈癌中ATF4与RPL41的表达情况,探讨其表达特点以及临床意义.方法:采用免疫组化SP法检测正常宫颈组织、CIN和宫颈癌组织中ATF4与RPL41的表达情况,并且分析两者与宫颈癌的关系及其意义.结果:ATF4、RPL41在宫颈癌与宫颈正常组织中阳性率差异有统计学意义(P＜0.05).ATF4蛋白的表达与宫颈癌临床分期、高危型HPV感染密切相关(P＜0.05).RPL41蛋白的表达与宫颈癌临床分期密切相关(P＜0.05).二者在宫颈癌组织中的表达有相关性(r=-0.254,P＜0.05).结论:ATF4与RPL41可能在宫颈癌的发生发展、局部侵袭中起着重要作用.
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慢性阻塞性肺疾病患者肺组织中ATF3与ATF4对γ-GCS表达的影响
目的:探讨慢性阻塞性肺疾病患者肺组织中ATF3与ATF4对γ-GCS表达的影响.方法:将2017年1月-2017年12月期间在我院接受治疗的60例慢性阻塞性肺疾病患者为研究组,60例非COPD为对照组,经原位杂交分析两组肺组织中的ATF3、ATF4、γ-GCS-HS水平,采用免疫组化法检测肺组织中的ATF3、ATF4、γ-GCS-HS蛋白表达.结果:经原位杂交法检验及免疫组化检测,研究组中的ATF3、ATF4、γ-GCS-HS的mRNA表达水平高于对照组(P<0.05).结论:COPD患者的ATF3、ATF4表达明显上调可影响调控γ-GCS表达,从而使γ-GCS表达上调,以发挥抗氧化作用.
