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匹诺塞林缓解大鼠肝细胞系BRL-3A低氧/复氧损伤
目的 探讨匹诺塞林(PIN)对低氧/复氧(H/R)诱导的大鼠肝细胞损伤的保护作用及其可能机制.方法 将大鼠肝细胞(BRL-3A细胞系)分为正常对照组、PIN实验组、低氧复氧损伤模型组和PIN预处理组.CCK-8检测细胞存活率;Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞计量术检测细胞凋亡;检测细胞培养液中谷丙转氨酶(ALT)活性;ELISA检测TNF-α和IL-1β含量;Western blot检测细胞中TLR4、IκB-α和NF-κB P65蛋白水平;RT-qPCR检测细胞中TLR4、IκB-α和NF-κB P65mRNA表达.结果 在H/R条件下细胞存活率明显降低(P<0.01),细胞凋亡率增高(P<0.001),ALT活性升高(P<0.01),IL-1β和TNF-α含量增多(P<0.01),TLR4和NF-κB P65蛋白与mRNA表达水平显著提高(P<0.01)而IκB-α降低(P<0.05);经PIN预处理后,细胞存活率显著提高(P<0.01),细胞凋亡率显著减小(P<0.001),ALT活性降低(P<0.01),IL-1β和TNF-α含量降低(P<0.01),TLR4和NF-κB P65蛋白与mRNA表达水平明显降低(P<0.01)而IκB-α升高(P<0.05).结论 PIN对H/R诱导的BRL-3A肝细胞的损伤具有保护作用,且该作用可能是通过TLR4/NF-κB信号通路实现的.
关键词： 匹诺塞林 低氧/复氧 肝细胞损伤 Toll样受体4 核转录因子-κBp65 -
高效液相色谱质谱联用法测定人粪便中匹诺塞林浓度的不确定度评定
目的：对人粪便中匹诺塞林浓度的高效液相色谱质谱联用（LC-MS/MS）定量分析方法的测量不确定度进行评定。方法：分析人粪便中匹诺塞林浓度测定过程，确定并简化不确定度来源，利用LC-MS/MS测定人粪便中匹诺塞林的方法学验证数据，通过统计学方法，依次计算各变量的不确定度、合成不确定度和扩展不确定度。结果：人粪便中低（51.07 ng·mL-1）、中（510.44 ng·mL-1）和高（2957.50 ng·mL-1）质量浓度匹诺塞林的扩展不确定度分别为14.58 ng·mL-1、26.30 ng·mL-1和206.46 ng·mL-1（k=2，置信概率为95%）。结论：测量不确定度与检测结果数值相关，随浓度高低不同而有所差异，而且测定不确定度比例在匹诺塞林不同浓度的结果也不相同，标准曲线拟合对低浓度点的影响非常大。
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匹诺塞林对脑线粒体呼吸功能的促进作用
匹诺塞林是一种广泛存在于蜂胶和植物中的黄酮类天然化合物,具有抗菌、抗炎、抗氧化、神经保护等多种药理作用.本实验利用大鼠全脑缺血模型(4-vessel occlusion,4-VO),评价了匹诺塞林在体内对4-VO大鼠脑线粒体功能的保护作用.结果表明,匹诺塞林能显著提高4-VO大鼠脑线粒体的ADP/O比值、V3以及RCI、OPR等参数,保护线粒体结构完整性;体外实验表明,匹诺塞林能显著提高分离的脑线粒体的ADP/O、V3、RCI、OPR,降低V4,保护线粒体结构完整性;同时,匹诺塞林在体外条件下促进脑线粒体ATP的生成;在细胞水平,匹诺塞林能促进SH-SY5Y细胞的ATP生成.本研究发现,匹诺塞林通过保护线粒体结构完整性,降低NADH呼吸链的电子漏流,提高氧化磷酸化效率,促进线粒体呼吸功能,提升线粒体ATP合成能力等起到脑缺血保护作用.
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LC-MS/MS法测定人粪便中匹诺塞林的浓度及在粪便排泄中的应用
目的 建立LC-MS/MS测定人粪便中匹诺塞林浓度并将其应用于粪便排泄的方法.方法 样品用乙腈提取处理,用LunaTMC8色谱柱,以乙腈-乙酸铵水为流动相,等度洗脱(65∶ 35),流速为0.25 mL·min-1,电喷雾电离源(ESI),用负离子模式检测,多反应离子监测(MRM).结果 匹诺塞林的线性范围为30～ 4000 ng·mL-1,定量下限为30 ng·mL-1,日间、日内准确度与精密度变异均＜7％,回收率均＞90％,不存在基质效应.48 h内粪便的累积排泄率为(1.9±1.4)％.结论 本方法快速、灵敏、专属性强、重现性好,可用于人粪便中的匹诺塞林测定.
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抗脑卒中新药匹诺塞林两种代谢产物的合成
目的:合成匹诺塞林的两种体内代谢产物5-羟基-黄烷酮-7-0-磺酸钠及5-羟基-黄烷酮-7-0-β-D-葡糖糖醛酸.方法:以匹诺塞林为原料,吡啶作为溶剂和催化剂,与氯磺酸进行磺酸化反应后再成盐得到5-羟基-黄烷酮-7-O-磺酸钠.5-羟基-黄烷酮-7-O-β-D-葡糖糖醛酸的合成同样以匹诺塞林为原料,经过乙酰化保护羟基,再选择性脱去保护基,然后与三-0-乙酰基-α-D-溴代葡糖糖醛酸甲酯进行糖苷化,再水解脱去保护基团得到目标化合物.结果:两个目标化合物的结构经lH-NMR、MS得到确证,纯度经HPLC检测均达到98％以上.结论:本文首次合成了5-羟基-黄烷酮-7-O-磺酸钠和5-羟基-黄烷酮-7-O-β-D-葡糖糖醛酸两种代谢产物,可作为新药匹诺塞林体内代谢研究的对照品.
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LC-MS/MS测定人尿中匹诺塞林浓度及尿排泄研究
目的 建立高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定人尿中匹诺塞林浓度,考察其在中国健康受试者尿液中的排泄特征.方法 尿样用乙醚液-液萃取,采用LunaTMC8色谱柱(2.00 mm×150 mm,3μm)分离,以乙腈-0.3 mmol·L-1醋酸铵水溶液(65:35,V/V)为流动相进行等度洗脱,流速为0.25 mL·min-1,通过电喷雾离子源(ESI),多重反应监测(MRM)负离子模式进行检测.8名受试者静脉滴注匹诺塞林40 mg,测定匹诺塞林的尿药排泄参数.结果 匹诺塞林在3～200ng·mL-1内线性关系良好,定量下限为3 ng·mL-,批内、批间变异(RSD)小于6.34％,稳定性较好.受试者给药后,匹诺塞林在给药结束后4h尿的累积排泄百分率达到平台,48 h累计排泄百分率为(0.11±0.05)％.结论 该方法快速、灵敏、准确、专属性强、重现性高,适用于人尿中匹诺塞林的测定及其尿药排泄特征研究.
关键词： 高效液相色谱-串联质谱法 匹诺塞林 尿药排泄 -
匹诺塞林的神经保护作用机制研究进展
匹诺塞林(pinocembrin)化学名为5,7-二羟基黄烷酮,是从蜂蜜,蜂胶,姜,野生马郁兰等提取的一种黄酮类化合物,具有抗氧化、抗炎、血管舒张等多方面的作用.其在体内外具有广泛的神经保护作用.笔者就匹诺塞林在脑缺血和神经退行性疾病中的神经保护作用进行了综述,总结了其在动物及细胞实验水平的药理学活性、可能的神经保护作用机制.
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匹诺塞林对脑出血损伤后脑组织中线粒体的保护作用
目的 探索匹诺塞林对脑出血损伤后脑组织中线粒体的结构和功能的影响.方法 采用Rosenberg法制备大鼠脑出血模型,根据是否制造出脑出血模型分为假模型组和真模型组,真模型组根据是否静脉给予匹诺塞林分为不给药组和给药组.于给药后24 h分别记录3组的脑组织三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)、一磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP),线粒体钙离子泵(Ca-ATP)酶活性和线粒体肿胀程度.结果 相对于假模型组,不给药组的大鼠脑组织的线粒体肿胀更明显,Ca-ATP酶活性更低,ATP、ADP、AMP和能量代谢更低,2者间的差异具有显著的统计学意义.与不给药组相比,给药组的大鼠脑组织的线粒体肿胀程度减轻,Ca-ATP酶活性更高,ATP、ADP、AMP和能量代谢更高,2者间的差异具有显著的统计学意义.结论 匹诺塞林通过保护大鼠脑出血损伤后脑组织中线粒体的结构和功能,改善大鼠脑组织缺氧,降低脑出血后脑组织的水肿程度.
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羟丙基-β-环糊精对匹诺塞林的包合作用研究
目的 测定匹诺塞林在不同浓度羟丙基-β-环糊精溶液中的溶解度曲线,以及包合物的组成量比例和稳定性常数.方法 在25℃运用相溶解度法进行实验,采用紫外分光光度法测定匹诺塞林在溶液中的浓度.结果 随着羟丙基-β-环糊精浓度增加和pH的增大,匹诺塞林的溶解度显著提高.计算了表观稳定常数、确定了不同pH条件下包合物的摩尔比.结论 难溶性药物匹诺塞林与羟丙基-β-环糊精可形成1:1包合物.
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匹诺塞林对脑缺血再灌注内质网应激凋亡相关基因mRNA表达的影响
目的:观察匹诺塞林对大鼠脑缺血再灌注急性期损伤内质网应激凋亡途径相关基因的调控作用.方法:雄性SD大鼠50只,阻塞大脑中动脉建立脑缺血再灌注模型,随机分为假手术组、模型组、匹诺塞林1 mg/kg组、3 mg/kg组和10 mg/kg组,其中模型组及匹诺塞林各给药组,分别于大脑中动脉阻塞2h后再灌注同时给药,6h后取血并断头取脑,取缺血半暗带组织,实时荧光定量PCR(RT-PCR)法测定GRP78、CHOP、ATF4、XBP-1的mRNA变化.结果:匹诺塞林能增加急性局灶性脑缺血再灌注GRP78 mRNA水平,其中匹诺塞林3 mg/kg、10 mg/组与模型组比较,差异有统计学意义(P ＜0.05或P＜0.01);匹诺塞林能降低内质网应激凋亡相关蛋白CHOP、ATF4,XBP-1mRNA水平,与模型组相比,差异有统计学意义(P ＜0.05或P＜0.01).结论:匹诺塞林能抗脑缺血再灌注损伤,其机制可能与保护内质网功能,减少GRP78、CHOP、ATF4及XBP-1相关基因表达有关.
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匹诺塞林对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织急性损伤的神经保护作用
目的:探讨并确证匹诺塞林对脑缺血再灌注急性损伤的神经保护作用,进一步为匹诺塞林治疗缺血性脑卒中的临床应用提供依据.方法:SD大鼠50只,随机均分为假手术组、模型组、匹诺塞林1 mg/kg组、匹诺塞林3 mg/kg组、匹诺塞林10 mg/kg组,其中模型组及匹诺塞林各给药组采用大脑中动脉阻塞法(middle cerebral artery occlusion,MCAO)建立脑缺血再灌注模型,分别与大脑中动脉阻塞2h再灌注同时给药,6h后取血并断头取脑,制作病理切片.HE染色观察额顶叶皮层(缺血半暗带)和纹状体病理变化,尼氏染色观察海马CA1区形态变化.酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测大鼠血清神经元特异性烯醇化酶(neuronal specific enolase,NSE)及S100-β蛋白水平.结果:匹诺塞林能够改善大鼠急性局灶性脑缺血再灌注的脑组织皮层、纹状体和海马神经元的形态,降低血清中NSE和S100-β蛋白的水平(P＜0.05或P＜0.01).结论:匹诺塞林能减轻缺血再灌注造成的脑组织急性损伤,具有神经保护作用.
关键词： 匹诺塞林 脑缺血再灌注急性损伤 神经元特异性烯醇化酶 S100-β -
匹诺塞林对急性局灶性脑缺血大鼠脑线粒体功能的影响
目的 考察匹诺塞林对大鼠急性局灶性脑缺血组织能量代谢及线粒体功能的影响.方法 制备永久性大鼠大脑中动脉栓塞(pMCAO)模型,大鼠随机分为假手术组、模型组、匹诺塞林给药组(1、3、10 mg·kg-1)、尼莫地平给药组(3 mg·kg-1).给药组于手术后10 min、12 h分别给予静脉注射,假手术组与模型组给予生理盐水.于手术24 h应用生化方法检测脑组织中LDH的活性,HPLC法检测大鼠脑组织ATP、ADP、AMP、磷酸肌酸含量.通过检测线粒体超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、线粒体Ca2+-ATP酶活性,超氧阴离子含量、线粒体膜肿胀度、线粒体钙离子含量综合评价线粒体功能.结果 匹诺塞林(3、10 mg·kg-1)给药组大鼠缺血脑组织中乳酸脱氢酶活性降低,能量指数比模型组分别提高了34.6%和45.8%(P<0.05);匹诺塞林(10 mg·kg-1)组线粒体SOD 活性提高了24.4 %、Na+,K+-ATP 酶、Ca2+-ATP 酶活性分别升高了24.9 %及34.0 %,线粒体钙离子浓度降低了22.0 %,与模型组相比差异均具有显著性(P<0.05).匹诺塞林(3、10 mg·kg-1)组线粒体超氧阴离子水平分别降低了20.2 %及30.6%、线粒体肿胀程度分别降低了26.1 %及46.0 %,与模型组相比差异均具有显著性(P<0.05).结论 匹诺塞林可减轻大鼠脑缺血后能量损伤,提高脑组织抗缺血缺氧能力,其对线粒体功能的保护作用可能是改善缺血脑组织能量代谢的重要机制.
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匹诺塞林对体外共培养海兔SN/L7神经元电生理活动的作用
目的 研究匹诺塞林(PNCB)对海兔神经元共培养体系(SN/L7)的电生理效应,探讨可能的作用机制.方法 体外共培养海兔(aplysia)的感觉神经元(SN)和运动神经元(L7),使其互相接触形成突触连接.细胞培养至d 5,给予不同浓度的PNCB刺激,考察药物对SN/L7兴奋性突触后电位(EPSP)的影响,随后撤去药物,观察EPSP的恢复情况.另取细胞,在PNCB孵育后加入0.005 mmol·L-15-羟色胺(5-HT),观察SN/L7对5-HT的反应性的变化.结果 PNCB作用5 min,使SN/L7的EPSP幅值降低.药物浓度低于0.1 mmol·L-1时,作用强度与药物剂量呈负线性关系(r>0.995),在0.1~0.4 mmol·L-1的浓度范围内,作用强度与药物剂量呈正线性关系(r>0.998);撤去药物后,SN/L7的 EPSP幅值可恢复至初始值.PNCB使SN/L7对5-HT的反应性消失,撤去药物后,该反应性得以恢复.结论 PNCB可逆地抑制体外共培养的海兔SN/L7神经元突触的兴奋性传导,并可逆地抑制SN/L7对5-HT的反应性.这一效应可能与突触后膜的谷氨酸受体有关.
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匹诺塞林对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠炎症反应的影响
目的：探讨匹诺塞林对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠炎症反应的影响，分析其治疗缺血性脑卒中的机制。方法雄性SD大鼠50只，随机分为假手术组、模型组、匹诺塞林1mg／kg ，3mg／kg ，10mg／kg治疗组，采用大脑中动脉阻塞法（middle cerebral artery occlusion ，MCAO）建立脑缺血再灌注模型，分别与大脑中动脉阻塞2h再灌注6h后，观察缺血脑组织水肿情况，计算脑水肿百分比；酶联免疫吸附测定法（enzyme linked immunosorbent assay ，ELISA ）检测大鼠血清肿瘤坏死因子α（（tumor necrosis factor α，TNFα）及白细胞介素1β（interleukin‐1β，IL‐1β）含量。结果大脑中动脉阻塞2h再灌注后6 h ，与模型组比较，匹诺塞林各治疗组脑水肿百分比降低（ P＜0．05），脑水肿明显减轻；血清T N Fα及IL‐1β含量明显降低（ P ＜0．01或 P ＜0．05）。结论匹诺塞林具有减轻大鼠脑缺血再灌注损伤炎症反应的作用。
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Ⅰ类新药注射用匹诺塞林(DL0108)体外吸附性试验
目的:考察不同材质的输液瓶和一次性输液器对注射用匹诺塞林的吸附性.方法:高效液相色谱法测定匹诺塞林在玻璃输液瓶及塑料输液瓶中放置4h过程中的峰面积,并测定此过程中的pH值；测定匹诺塞林经过不同规格的一次性输液器之前以及经过后30min内的峰面积.结果:在输液瓶中放置4h的过程中,相对0时的匹诺塞林的峰面积百分数在98.5％～104.1％的范围内；在流经一次性输液器的30 min的过程,相对0时的峰面积的百分数在93.6％～99.2％的范围内.结论:输液瓶对匹诺塞林没有明显的吸附作用,一次性输液器对匹诺塞林有一定的吸附,临床应用是应考虑吸附现象以保证药物浓度.
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反相高效液相色谱法拆分匹诺塞林对映异构体
目的:建立匹诺塞林的手性分析方法,用于拆分产物光学纯度的分析测定,并对手性拆分反虚进行临测.方法:采用高效液相色谱法.使用Chiralpak AD-RH淀粉类手性柱,流动相为100%甲醇,流速1.0 mL·min~(-1),检测波长290 nm.结果:匹诺塞林消旋体在此条件下的分离度为5.0.将该方法实际应用于手性拆分反应得到的光学异构体的光学纯度测定,结果对映体过量百分比(ee%)在97%以上.结论:本方法分离度与重现性好,可用于匹诺塞林光学纯度的分析测定,并对拆分反应进行监测,结果可靠.
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HPLC法测定匹诺塞林含量及有关物质
目的:采用高效液相色谱法测定匹诺塞林的含量及其有关物质.方法:采用Kromasil C18色谱柱(4.6mm×150 mm,5μm);以甲醇-水(用磷酸调pH至3.0)(63:37)为流动相;流速1.0 mL·min-1;检测波长:290 nm;柱温:审温;进样量:20μL.结果:高效液相色谱法测定的线性范围为2～200μg·mL-1;相关系数r=1.0000;开内精密度:RSD为0.10%(n=5);日间精密度:RSD为0.14%(n=5).杂质1、2、4的线性范围为0.05～50μg·mL-1;相关系数r分别为1.0000,1000,0·9999.杂质3的线性范围为0.2～8μg·mL-1;相关系数r=0.9999.结论:本法简便快速、准确、专属性好.
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LC-MS/MS法测定人血浆和尿中匹诺塞林浓度的不确定度评定及对比分析
目的:评定LC-MS/MS法测定人血浆和尿中匹诺塞林浓度的不确定度,并对二者进行对比分析.方法:分析评定2种生物基质中匹诺塞林浓度测定过程中的影响因素,依次计算各变量的不确定度、合成不确定度和扩展不确定度,对比分析影响2种生物基质中匹诺塞林浓度不确定度差异的影响因素.结果:人血浆中50 ng·mL-和人尿中40 ng·mL-1匹诺塞林的扩展不确定度分别为3.36ng· mL-1和3.94ng· mL-1(P=95％,k=2).结论:LC-MS/MS法测定人血浆中匹诺塞林浓度的不确定度主要由标准曲线拟合、标准溶液和血浆提取引入,而人尿中匹诺塞林浓度的不确定度主要由尿样提取、标准曲线拟合和标准溶液的配制引入,不同生物基质中匹诺塞林的测定不确定度及其主要影响因素是不一致的,主要是由样品提取方法不同所引起.
