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阻断CD4+T细胞活化的双信号可预防小鼠慢性GVHD
目的:探讨联合应用TJU103和CTLA4-Ig阻断T细胞活化的TCR-CD3及B7-CD28通路对小鼠慢性GVHD的影响.方法:参照前期构建的慢性GVHD动物模型,受鼠经输注6×107个供鼠脾细胞后按干预方式的不同分5组:空白对照、cGVHD、TJU103干预、CTLA4-Ig干预和TJU103+ CTLA4-Ig干预组.观察各干预因素对嵌合体形成及慢性GVHD大体表现评分和病理评分的影响.结果:TJU103和CTLA4-Ig不影响小鼠嵌合体的形成,分析慢性GVHD小鼠的Kaplan生存曲线显示,CTLA4-Ig和TJU103+ CTLA4-Ig干预降低了慢性GVHD的发病率,TJU103可推迟慢性GVHD的发生时间,但均不能改变慢性GVHD的严重程度.结论:TJU103可推迟小鼠慢性GVHD的发病时间,CTLA4-Ig可减少小鼠慢性GVHD的发生率;二者联合应用可明显减少小鼠慢性GVHD的发病率,但不能改变慢性GVHD的严重程度.
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腺病毒载体介导的CTLA4-Ig基因转移促进异基因小鼠皮肤移植耐受
目的探讨CTLA4-Ig重组腺病毒(AdCTLA4-Ig)促进"脾细胞(spleen cells, SP)+环磷酰胺(cyclophosphamide,CP)"系统诱导移植耐受的作用及其机制. 方法 BALB/c(H-2d)小鼠经尾静脉注射C57BL/6(H-2b,B6)小鼠脾细胞和AdCTLA4-Ig颗粒,48 h后腹腔注射环磷酰胺,并同天进行皮肤移植,于耐受25?d时对受体小鼠进行混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR)、迟发型超敏反应(delayed type hypersensitivity,DTH)等耐受状态的检查. 结果 B6小鼠的皮肤移植物在耐受的BALB/c小鼠中存活期特异延长.MLR和DTH检验证明BALB/c小鼠对B6小鼠的脾细胞产生特异性耐受,对无关第三者ICR小鼠的脾细胞仍表现出强烈免疫应答. 结论 AdCTLA4-Ig颗粒可以明显促进"细胞+环磷酰胺"诱导的异基因皮肤移植耐受;克隆排除和克隆无能是耐受诱导的主要因素.
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CTLA4-Ig在小鼠病毒性心肌炎中作用机制的研究
目的 探讨细胞毒T淋巴细胞相关抗原4融合蛋白(CTLA4-Ig)对柯萨舒B3(CVB3)病毒性心肌炎(VMC)小鼠死亡率、心肌病理改变与病毒滴度、CTLA4蛋白表达及Th1/Th2平衡的影响.方法 将106只BALB/c小鼠随机分为CTLA4-Ig组16只、病毒组40只、IgG组40只及正常对照组10只,于接种病毒后第7天处死所有小鼠,采用光镜检查心肌病理变化和实时荧光定量PCR(RQ-PCR)检测心肌组织中CVB3 mRNA的表达,免疫组化法检测CTLA4蛋白的表达,取外周血应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清IL-2、IL-4及IFN-γ的含.结果 CTLA4-Ig组小鼠死亡率、心肌病理积分、心肌CVB3 mRNA均低于病毒对照组(P均<0.05);CTLA4-Ig组小鼠心肌组织中CTLA4表达较病毒组明显增加(P<0.05);病毒组小鼠血清IFN-γ水平明显高于正常对照组小鼠(P<0.01),IL-4水平明显低于正常对照组小鼠(P<0.01),两组小鼠间IL-2的水平差异无统计学意义(P>0.05).CTLA4-Ig组小鼠血清IL-4水平明显高于病毒组及IgG组(P均<0.01),IFN-γ水平低于病毒组及IgG组(P均<0.01),三组小鼠血清IL-2水平的差异无统计学意义(P均>0.05).结论 CTLA4-Ig可减轻VMC小鼠心肌炎症,降低心肌病毒滴度及死亡率,其机制可能与阻断T细胞活化的共刺激信号,使Th2反应增强有关.
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CTLA4-Ig与器官移植免疫耐受的诱导
应用CTLA4-Ig或导入CTLA4-Ig基因在动物器官移植中诱导了免疫耐受.其主要作用机制是CTLA4-Ig可以阻断B7:CD28/CTLA4共刺激通路,阻碍第二信号的传递,从而抑制T细胞活化.CTLA4-Ig为诱导器官移植后的免疫耐受提供了新的方法.
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CTLA4-Ig在异体移植方面的相关研究进展
CTLA4-Ig是一种融合免疫球蛋白,可以选择性地阻断CD28与B7的信号传导通路,导致T细胞免疫失能,诱导对特异性抗原的免疫耐受.本文介绍了其生物学特性、免疫诱导耐受机制及在异体移植方面的研究进展和局限性,其在异体移植方面展示了良好的应用前景.
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CTLA4-Ig抑制小鼠同种异体门静脉移植物排斥反应的实验研究
目的 建立鼠同种异体门静脉移植模型,并研究门静脉移植物免疫排斥反应及其处理方法.方法 选用近交系C57BL/6(H2b)和BALB/c(H2d)小鼠,进行异体门静脉移植的动物实验,设同基因移植组(BALB/c到BALB/c),异基因移植组(C57BL/6到BALB/c)和异基因移植加CTLA4-Ig治疗组.结果 共实施80例小鼠门静脉移植,全组手术成功率91.3%(73/80).异基因组术后1周即出现明显排斥反应,管壁全层由单核细胞浸润.术后2周内皮层和肌层破坏进一步加重,管壁增厚伴管腔狭窄.术后4～8周内皮和肌层完全被新生的细胞外基质替代,单核细胞浸润相对减轻.异基因CTLA4-Ig治疗组术后排斥反应受到明显抑制,管壁厚度和管腔面积与同基因组类似,与异基因组相比获得明显改善.结论 CTLA4-Ig能有效抑制同种异体门静脉移植物免疫排斥反应.
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重组人CTLA4-Ig对T细胞活化功能的影响
目的:分析真核表达产物CTLA4-Ig对T细胞活化功能的影响.方法:构建并用真核表达系统表达CTLA4-Ig,通过蛋白A亲合柱纯化获得纯品;然后观察CTLA4-Ig对淋巴细胞转化功能及T细胞表面分子CD25表达的影响;用3H-TdR掺入法研究CTLA4-Ig对混合淋巴细胞反应的影响.结果:CTLA4-Ig抑制PHA对淋巴细胞的转化;同时,抑制PHA刺激的淋巴细胞表面CD25分子的表达,抑制率达53%,与对照相比抑制显著(P<0.05),且这种效应有剂量依赖性;CTLA4-Ig 抑制单向混合淋巴细胞反应,抑制率达87.53%,与对照相比亦抑制显著(P<0.05),且效应亦呈剂量依赖性.结论:CTLA4-Ig能有效阻断T细胞的活化,并且阻断效应是通过多种信号途径起作用的.
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CTLA4-Ig诱导大鼠同种肝细胞移植免疫耐受的实验研究
目的研究CTLA4-Ig诱导在D-氨基半乳糖致急性肝功能衰竭大鼠脾内同种异体肝细胞移植的免疫耐受.方法急性药物性肝衰模型:用10%D-氨基半乳糖溶液按1.0 g/kg一次性大鼠腹腔注射;用Ⅳ型胶原酶肝脏原位灌注,制备肝细胞悬液,浓度为4×107/ml,2 h内经脾移植;24只用D-氨基半乳糖诱导的急性肝衰大鼠,24 h后均进行经脾同种异体肝细胞移植,然后随机分为两组,一组为治疗组,腹腔一次性注射CTLA4-Ig,另一组为对照组,不予处理.两组均分别于术后第1,3,5,7天观察IL-2、TNF、肝功能及脾脏HE染色的变化.结果治疗组与对照组比较,术后治疗组IL-2含量明显下降,差异有显著性,P＜0.05;术后TNF含量两组之间差异无显著性,P＞0.05;术后肝功能治疗组比对照组下降明显,P＜0.05.组织学改变:术后第7天治疗组仍可见肝细胞或肝细胞团,对照组脾内见大量淋巴细胞浸润,但很少见肝细胞.结论CTLA4-Ig能诱导大鼠经脾同种异体肝细胞移植的免疫耐受,促使急性肝衰大鼠肝功能得到改善.
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CTLA-4Ig对复发性单纯疱疹性角膜基质炎的抑制作用
目的: 研究CTLA-4Ig对复发性单纯疱疹性角膜基质炎(HSK)的抑制作用.方法:采用复发性HSK的BALB/c鼠模型,经紫外线B光照射角膜诱导HSK复发;使用CTLA-4Ig作为负性调节因子,观察其对复发性HSK的影响.结果:注射CTLA-4Ig的小鼠,复发性HSK的角膜混浊程度及角膜炎性细胞浸润明显减轻,迟发型超敏反应明显减弱,外周血中CD4+T细胞减少了92.8%.结论:CTLA-4Ig通过阻断B7:CD28/CTLA-4协同刺激途径,抑制了CD4+T细胞的增殖,阻止了复发性HSK的发展.
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CTLA4-Ig对过敏性哮喘小鼠IL-13和气道高反应性的影响
目的:研究哮喘小鼠外周血和支气管肺泡灌洗液(BALF)中IL-13的表达情况和气道的高反应性及CTLA4-Ig对其影响,以明确支气管哮喘的免疫发病机制,并为治疗哮喘寻求一条安全有效的途径.方法:将小鼠分成A、B两组,A组(n=24)中的哮喘组(n=8)及CTLA4-Ig治疗组(n=8)用腹腔注射10%卵蛋白0.1 mL(10 mg)及10%氢氧化铝凝胶0.2 mL致敏,建立小鼠哮喘模型,测定外周血及BALF中白细胞总数并进行分类,用ELISA方法测定IL-13水平,并测定CTLA4-Ig对上述各项指标的影响.B组(n=24)中的哮喘组(n=8)及CTLA4-Ig治疗组(n=8)给予雾化吸入乙酰胆碱(0.08～1.25 g·L-1)用于测定气道高反应性.结果:激发后24 h哮喘小鼠外周血白细胞总数及嗜酸性粒细胞比例较正常组(n=8)增高(P=0.013,P=0.014);哮喘小鼠BALF中白细胞总数及嗜酸粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞比例较外周血中增高(P=0.001,P=0.0013,P=0.0001,P=0.037);CTLA4-Ig可以降低哮喘小鼠BALF中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞及淋巴细胞比例(P=0.0028,P=0.0001,P=0.033);与正常组(n=8)比较,哮喘组血清及BALF中IL-13水平明显升高(P=0.004,P=0.005),与哮喘组比较,治疗组血清及BALF中IL-13水平明显下降(P=0.003,P=0.03);CTLA4-Ig可有效降低小鼠气道高反应性.结论:IL-13在哮喘发病中起重要作用,CTLA4-Ig可抑制哮喘小鼠IL-13的分泌并能降低小鼠气道的高反应性,对哮喘治疗具有临床意义.
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治疗类风湿关节炎的研究进展
生物制剂在类风湿性关节炎治疗中的应用虽然不到二十年的时间,却取得了较大的效果,并且逐渐成为一种常规的疗法.根据类风湿关节炎发病机制中的不同作用环节,人们开发出了分别针对细胞因子和淋巴细胞的各种各样的生物制剂.本文介绍生物制剂主要作用的对象有肿瘤坏死因子、白细胞介素、淋巴细胞等,他们是类风湿性关节炎各个发病环节中的重要部分.这些生物制剂对于顽固性RA患者有很好的治疗作用,且有较好的安全性.
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TJU103联合CTLA4-Ig对T细胞表型和分泌细胞因子的影响
本研究应用HLA半相合供、受者间单向混合淋巴细胞培养(MLC)体系,体外检测了联合应用TJU103和CTLA4-Ig对供者T细胞增殖以及表型和分泌细胞因子的影响.结果显示,单独应用TJU103和CTLA4-Ig均能够降低T细胞的增殖活性.二者联合应用具有明显的协同抑制增殖效应,并能够使CD4+ CD69+/CD8+ CD69+比值降低,Thl型细胞因子(TNF-α,IFN-γ)分泌减少,Th2型细胞因子(IL-4)分泌增加.提示TJU103和CTLA4-Ig联合应用能够阻断供者T细胞激活的抗原和共刺激双信号通路,抑制T细胞的增殖活性,使CD4+ CD69+/CD8+ CD69+比值降低,并能够调节Th细胞分化,诱导Th细胞免疫偏离,使辅助性T细胞更多地向Th2细胞方向分化,可以作为一条预防临床HLA半相合造血干细胞移植重度移植物抗宿主病(GVHD)的新途径.
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Tju103和CTLA4-Ig诱导MHC半相合小鼠骨髓移植耐受比较
目的:观察Tju103和CTLA4-Ig各自对MHC半相合小鼠骨髓移植免疫耐受的诱导.方法:半相合供鼠T细胞与受鼠抗原、Tju103(或CTLA4-Ig)共育后与骨髓细胞混合移植,观测移植后受情况.结果:A.单纯照射组:全部小鼠于照射后11 d内死于造血衰竭;B.白血病CTX治疗组:全部小鼠于接种白血病细胞后16～23 d死于白血病;C.单纯移植组:全部小鼠于移植后21 d内死于移植物抗宿主病(GVHD);D.CsA预防组:5只小鼠于移植后8～22 d死亡,1只死于白血病,各有2只死于GVHD和感染,5只活过30 d;E.Tju103处理组:4只小鼠于移植后9～26 d死亡,2只死于GVHD,各有1只死于白血病和感染,6只活过30 d;F.CTLA4-Ig处理组:2只小鼠于移植后17～26 d死亡GVHD,8只活过30 d.结论:Tju103和CT-LA4-Ig均明显延长生存期,降低GVHD发生和严重程度,CTLA4-Ig保留有抗感染和移植抗白血病(GVL)作用,而Tju103没有.
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CTLA4-Ig对变应性接触性皮炎小鼠模型的治疗作用
目的探讨B7/CD28共刺激通路阻断剂CTLA4-Ig对变应性接触性皮炎的作用.方法建立小鼠二硝基氟苯(DNFB)变应性接触性皮炎模型,以不同剂量的CTLA4-Ig进行静脉注射,通过检测小鼠耳廓肿胀度观察其对DNFB和FITC刺激的反应,并观察CTLA4-Ig的长期疗效,同时对治疗后的小鼠脾细胞进行体外淋巴细胞增殖实验.结果CTLA4-Ig有明显的治疗作用,DNFB变应性接触性皮炎小鼠经治疗耳廓肿胀抑制率高达69.7%,而且治疗的小鼠在激发后的14d用DNFB再刺激能产生无应答反应,但对FITC的再刺激表现为耳廓肿胀明显,过继转移CTLA4-Ig治疗小鼠的淋巴细胞能诱导受体鼠对DNFB的刺激产生特异性免疫耐受.结论应用B7/CD28共刺激通路阻断剂CTLA4-Ig融合蛋白能有效地抑制接触性超敏反应,为临床治疗Ⅳ型变态反应性皮肤病如湿疹等提供一种新的可能的治疗策略.
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异源性Th表位修饰的CTLA4-Ig-msBlys构建及融合蛋白表达
目的 构建异源性Th表位修饰的CTLA4-Ig-msBlys的原核表达质粒,并在E.coli BL21中诱导融合蛋白表达,初步检测蛋白特性.方法 采用PCR法从质粒pCMV-sBlys扩增sBlys片段,将与卵清蛋白(ovalbumin,OVA)Th 表位重组后的msBlys连接CTLA4-Ig片段,克隆人pGEX-KG原核表达载体,用LB固体培养基抗生素筛选、酶切并经琼脂糖凝胶电泳鉴定;将质粒pGEX-KG-CTLA4-Ig-msBlys转入E.coli BL21菌株中,实现插人基因的融合表达,用SDS-PAGE 和Western blot检测表达产物.结果 pGEX-KG-CTLA4-Ig-msBlys构建正确且终转人E.coli BL21,得到融合蛋白的表达;CTLA4-Ig-msBlys融合蛋白在E.coli中获得表达,表达产物的相对分子质量同预期值一致.结论成功构建原核表达质粒pGEX-KG-CTLA4-Ig-msBlys,并在E.coli BL21表达CTLA4-Ig-msBlys融合蛋白,为下一步探讨Blys在自身免疫性疾病患者的治疗作用莫定了基础.
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AAV 体外介导hCTLA4-Ig 在新生猪胰岛细胞中的表达与生物学活性
目的:探讨AAV-hCTLA4-Ig体外感染猪胰岛细胞后,hCTLA4-Ig基因的表达能力及生物学活性.方法:腺相关病毒载体(AAV)介导hCTLA4-Ig体外转染新生猪胰岛细胞(NIPs),用RT-PCR和免疫细胞化学法检测胰岛细胞内hCTLA4-Ig mRNA及蛋白质水平的表达.转染后的新生猪胰岛细胞与人淋巴细胞共孵育,通过ELISA法检测培养基中IL-2,IFN-γ,TNF-α细胞因子水平的变化.并观察转染组与对照组葡萄糖刺激后的胰岛素释放反应.结果:转染组NIPs可检测到hCTLA4-Ig基因及蛋白表达;与人淋巴细胞共孵育后IL-2,TNF-α,IFN-γ浓度明显低于对照组(P＜0.01);且葡萄糖刺激胰岛素释放反应与对照组无明显差异(P＞0.05).结论:AAV-CTLA4-Ig体外转染的胰岛细胞能够表达具有生物学活性的hCTLA4-Ig,可抑制T细胞激活,而胰岛细胞生理功能不受影响.
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Tju103和CTLA4-Ig诱导T淋巴细胞免疫耐受的比较
目的观察比较Tju103和CTLA4-Ig分别调节、诱导T淋巴细胞免疫耐受的作用.方法用经丝裂霉素处理的异基因正常BALB/c(H-2d)小鼠巨噬细胞做耐受诱导原,分别用Tju103和CTLA4-Ig体外训导、调节C57BL/6(H-2d)小鼠T淋巴细胞,通过增殖效应(单向混合淋巴细胞反应,MLR)和杀伤效应(MTT法),考察经训导的C57BL/6小鼠T淋巴细胞分别对BALB/c小鼠和CBA(H-2k)小鼠脾细胞以及EL9611(H-2d)红白血病细胞的增殖效应和杀伤效应的改变.结果经Yju103调节后,C57BL/6 小鼠T淋巴细胞对BALB/c和CBA小鼠脾细胞以及EL9611红白病细胞的增殖反应和杀伤效应抑制作用明显,未能诱导对已接触抗原(BALB/c小鼠)产生特异性免疫耐受.经CTLA4-Ig孵育后,C57BL/6 小鼠T淋巴细胞对这三种细胞的增殖反应和杀伤效应抑制作用明显;对已接触抗原呈现免疫耐受,而对第三种抗原(CBA小鼠)和EL9611白血病细胞保持反应性.结论在特异抗原存在下,Tju103和CTLA4-Ig均能明显抑制异基因小鼠T淋巴细胞增殖反应性和杀伤效应,但Tju103诱导非特异免疫抑制,而CTLA4-Ig诱导特异免疫耐受,更适合于诱导移植免耐受.
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基因转移CTLA4-Ig对异种胰岛移植排斥反应的影响
目的 探讨基因转移细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(CTLA4-Ig)对异种胰岛移植排斥反应的影响.方法 用携带基因CTLA4-Ig的重组腺病毒转染人胰岛细胞,植人糖尿病大鼠肾胞膜下,建立人-大鼠异种胰岛移植模型,观察糖尿病大鼠移植后血糖变化、生存情况及移植物病理形态学改变,检测移植物CTLA4-Ig、胰岛素的表达和移植大鼠IL-2、TNF-α的水平变化.结果 (1)糖尿病大鼠胰岛移植后2 d血糖降至正常,对照组和转染组血糖平均分别在移植后8 d和25 d升高.(2)转染组移植物存活时间(28±6)d,较对照组(10±2)d显著延长(t=10.52,P＜0.01).(3)移植大鼠生存时间:转染组(48±8)d显著长于对照组(21±6)d(t=12.23,P＜0,01).(4)对照组在移植后1周内,IL-2、TNF-α水平均急尉上升,较移植前显著升高(P＜0.01);转染组则较移植前下降.(5)转染组移植物可见CTLA4-Ig和胰岛索的表达.结论 基因转移CTLA4-Ig可抑制异种胰岛移植排斥反应,延长移植大鼠和移植物的存活时间.
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CTLA4-Ig联合骨髓细胞诱导小鼠心脏移植耐受
目的:探讨细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(Cytotoxic T Lymphocyte Antigen 4-immunoglobulin,CTLA4-Ig)与供体骨髓细胞联合应用诱导器官移植免疫耐受的可行性.方法:应用小鼠腹部心脏移植模型,实验组小鼠术中输注供体骨髓细胞,术后腹腔注射CTLA4-Ig.观察移植心脏存活时间,并进行病理分析,检测迟发性超敏反应(Delayed Type Hypersensitivity,DTH).后期进行供体来源的皮肤移植并观察存活时间.结果:实验组移植心脏存活时间较对照组显著延长,达(79.3±23.7)d;排斥反应减轻,并产生了供体抗原特异性的免疫低反应性;后期进行的皮肤移植实验中,供体来源的皮肤存活时间也显著延长,达(23.0±3.1)d.结论:CTLA4-Ig与骨髓细胞联合应用可以显著延长移植物存活时间,诱导实体器官移植免疫耐受.两者具有明显的协同作用.
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CTLA4-Ig诱导的免疫耐受及其在肝移植和肝细胞移植中的应用
排斥反应尤其是急性排斥反应一直是影响器官、组织、细胞移植成功与否的关键问题,肝移植和肝细胞移植亦不例外.目前解决排斥反应的主要策略是使用免疫抑制剂,但此类药物毒副作用较大,需长期甚至终身服用,增加感染和肿瘤的发生率.在此背景下,诱导移植物免疫耐受成为研究热点.众多研究发现,细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(cytotoxic T-lymphocyte associated antigen 4-immunoglobulin,CTLA4-Ig)通过阻断T淋巴细胞活化的共刺激通路诱导移植物免疫耐受,具有良好的临床应用前景.笔者仅就CTLA4-Ig在诱导移植物免疫耐受中的作用、机制及其在肝移植和肝细胞移植中的应用作一简要综述.
